Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Samenvatting

De effecten van migraine remmers op glioom kanker Celmigratie in driedimensionale (3D) invasie testen met behulp van een histon deacetylase (HDAC) inhibitor worden gekenmerkt door een hoge resolutie confocale microscopie.

Samenvatting

Het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen in kankeronderzoek wordt steeds meer gebaseerd op medicijn schermen in 3D-formaat. Nieuwe remmers gericht op het migratie-en invasief potentieel van kankercellen, en bijgevolg de gemetastaseerde verspreiding van ziekten, worden ontdekt en beschouwd als complementaire behandelingen in zeer invasieve kankers zoals gliomas. Dus, het genereren van gegevens waardoor de gedetailleerde analyses van cellen in een 3D-omgeving na de toevoeging van een medicijn is vereist. De hier beschreven methodologie, het combineren van spheroid invasie testen met hoge resolutie beeldopname en data-analyse door confocale laser scanning microscopie (CLSM), ingeschakeld gedetailleerde karakterisering van de effecten van de potentiële anti-migratie remmer MI-192 op glioom cellen. Spheroids werden gegenereerd uit cellijnen voor invasie testen in laagaanhandig 96-goed platen en vervolgens voorbereid voor CLSM-analyse. De beschreven workflow had de voorkeur boven andere veelgebruikte spheroid-genererende technieken vanwege zowel gemak als reproduceerbaarheid. Dit, in combinatie met de verbeterde beeldresolutie bereikt door confocale microscopie in vergelijking met conventionele breedveld benaderingen, liet de identificatie en analyse toe van verschillende morfologische veranderingen in migratie cellen in een 3D-omgeving na behandeling met de migrastatic drug MI-192.

Inleiding

Driedimensionale spheroid-technologieën voor preklinische geneesmiddelen ontdekking en de ontwikkeling van potentiële kankergeneesmiddelen worden in toenemende mate begunstigd op conventionele drugs schermen; Er is dus meer ontwikkeling van migraine — migratie en invasie voorkomen — drugs. De achterliggende gedachte achter deze ontwikkelingen in de behandeling van kanker is duidelijk: 3D-spheroid-assays vormen een realistischer benadering voor het screenen van potentiële anti-kanker drugs, omdat ze de 3D-tumor architectuur meer getrouw nabootsen dan de monolaag-culturen van cellen, even drug-tumor interacties (kinetiek) nauwkeuriger, en toestaan de karakterisering van drug activiteit in een tumor-gerelateerde setting. Bovendien is de opkomst van resistentie tegen chemotoxische geneesmiddelen in vele soorten kanker en hoge sterftecijfers onder kankerpatiënten als gevolg van metastasen versterkt door het vermogen van kankercellen te migreren naar verre tumor sites ondersteunt de opname van chemotherapeutische agenten gericht op het migratie potentieel van kankercellen als adjuvante behandeling in toekomstige klinische kanker onderzoeken¹. Dit is met name het geval bij zeer invasieve kankers, zoals high-grade glioblastomas (GBM). GBM-beheer omvat chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Echter, zelfs met combinatiebehandeling, de meeste patiënten recidief binnen 1 jaar van de initiële diagnose met een mediane overleving van 11-15 maanden^2,3. Er zijn de afgelopen jaren enorme vooruitgang geboekt op het gebied van 3D-technologie: rotatieve systemen, micro fabricaat structuren en 3D-steigers, en andere individuele testen worden voortdurend verbeterd om routinematige tests op grote schaal⁴mogelijk te maken^{, 5,6,7}. De resultaten van deze testen moeten echter op een zinvolle manier worden geanalyseerd, omdat gegevens interpretatie vaak wordt belemmerd door pogingen om 3D-gegenereerde gegevens te analyseren met 2D-beeldanalyse systemen.

Ondanks de voorkeur in termen van beeld acquisitie snelheid en verminderde foto-toxiciteit, blijven de meeste breedveldsystemen beperkt door resolutie⁸. Zo, afgezien van de gegevens lezen-outs met betrekking tot de werkzaamheid van het geneesmiddel, gedetailleerde effecten van drug actie op 3D cellulaire structuren van migrerende cellen zijn onvermijdelijk verloren als afbeelding gemaakt met behulp van een breed-veld systeem. Omgekeerd, confocale laser scanning microscopie (CLSM) vangt hoge kwaliteit, optisch verdeelde beelden die kunnen worden gereconstrueerd en gerenderd in 3D na overname met behulp van computer software. CLSM is dus gemakkelijk toepasbaar op Imaging complexe 3D cellulaire structuren, waardoor ondervraging van de effecten van anti-migrastatic remmers op 3D structuren en diepgaande analyses van de cel migratie mechanismen. Dit zal ongetwijfeld leiden tot toekomstige migrastatic drug ontwikkeling. Hier wordt een gecombineerde workflow van spheroid-generatie, medicamenteuze behandeling, kleurings protocol en karakterisering door confocale microscopie met hoge resolutie beschreven.

Protocol

1. generatie van Celsferioïden

Dag 1

1. Bereid het standaard kweekmedium voor zoals vereist door de onderzochte cellijn.
2. Voer alle met weefselkweek samenhangende stappen uit in een weefselkweek afzuigkap met behulp van steriele behandelingstechnieken.
3. Trypsinize en Tel kankercellen. Gebruik 20 mL celsuspensie per plaat. Houd de celsuspensies in duidelijk gelabelde steriele universele buizen.
4. Voeg een vooraf bepaald aantal cellen toe aan elk goed. Zowel het aanvankelijke aantal cellen als de uiteindelijke grootte van de spheroid is afhankelijk van het proliferatie percentage van de cellijn dat wordt onderzocht.
   Opmerking: Voor gevestigde glioom cellijnen zoals U251 en KNS42^9,10, 5 x 10³ cellen/ml zal na 4 dagen incubatie een microscopisch zichtbare spheroid (200 of 800 μm) produceren.
5. Rebreng de cellen in universele buizen door zachte inversie om celklontering te voorkomen. Pipetteer 200 μL van de celsuspensie in elke put van een 96-well plaat. Als alle putjes niet nodig zijn, is het raadzaam om 200 μL 1x PBS aan elke lege put toe te voegen om verdamping te voorkomen.
6. Incuberen de cellen in een incubator als normaal bij 37 °C.
   Opmerking: Cellijnen zoals glioom Cancer cellijnen vormen sferoïden binnen 24 uur. laat de 3D-cellulaire architectuur vorm geven door de spheroid voor 72 h te inbroed.

Dag 2

7. Controleer cellen op helder-veld microscopie na 24 h. afhankelijk van de cellijn, cellen kunnen hebben gevormd een spheroid detecteerbaar in de bodem van de put.
   Opmerking: Opgezette glioom kanker cellijnen vormen gemakkelijk sferoïden binnen 24 uur. patiënten afgeleide glioom Cancer cellijnen kunnen tot 1-2 weken duren.

2. collageen invasie test

Dag 3

1. Plaats collageen, 5x kweekmedium, 1 M NaOH en 1 20 mL Tube op ijs.
2. Voeg voorzichtig en langzaam 10,4 mL koud collageen toe aan een gekoelde kweek buis. Vermijd bubbels. Deze hoeveelheid collageen is genoeg voor 1 96-goed plaat. Opschalen is mogelijk, maar het wordt aanbevolen dat 1 20 mL buis per plaat wordt bereid op een tijdstip.
3. Voeg zachtjes 1,52 mL koud steriel 5x kweekmedium toe. Vermijd bubbels.
4. Net voor gebruik, voeg voorzichtig 72 μL koude steriele 1 M NaOH toe. Houd de oplossing op ijs.
5. Meng zachtjes door pipetteren. Vermijd bubbels. Efficiënte menging leidt tot een kleurverandering (van rood naar oranje-rood (pH 7,4) in het medium. Laat het mengsel op ijs staan tot het gebruik.
6. Cruciale stap: Verwijder 190 μL supernatant van de 96-put die op dag 1 is bereid. Wees heel voorzichtig om de sferoïden die in de bodem van de put zijn gevormd niet te verstoren. Gebruik de pipet onder een hoek naar de zijkant, niet het midden, van de put.
7. Voeg voorzichtig 100 μL van de collageen mix toe aan elk goed. Pipetteer de Meng zijde van de put om een spheroid-verstoring te voorkomen. Vermijd bubbels. Bewaar elke overgebleven collageen mengsel in de tube van 20 mL bij kamertemperatuur om polymerisatie te beoordelen.
8. Incubeer de plaat in de incubator gedurende ten minste 10 min om het collageen te laten polymeriseren. Als een richtlijn, als de overgebleven collageen heeft ingesteld, steeds halfvaste en spons-achtige, de sferoïden zijn klaar om te worden behandeld met remmer.
9. Voeg de geneesmiddelen of remmers bij 2x de concentratie toe aan het kweekmedium. Voeg het medium zachtjes toe aan elk goed (100 μL per put). Pipetteer het medium aan de zijkant van de put om spheroid-verstoring te voorkomen.
10. Observeren en beeld elke spheroid door helderveld microscopie soms T = 0 h, 24 h, 48 h, en 72 h om drug activiteit te beoordelen. Breng vervolgens de plaat terug naar de incubator.
    Opmerking: Afhankelijk van het invasieve gedrag van de cellijn kan de migratie weg van de oorspronkelijke spheroid-kern vanaf 24 uur worden waargenomen.

3. bereiding van met collageen ingesloten spheroïden en migratie cellen voor confocale microscopie

1. Plaats de plaat in een weefselkweek kapje en verwijder voorzichtig het supernatant (200 μL). Nogmaals, zorg dat u de spheroid niet verstoort en Vermijd het aanraken van het collageen, omdat dit de collageen plug kan verstoren.
2. Vervang de supernatant met 100 μL 1x PBS. Herhaal deze Wash stap 3x.
3. Verwijder de laatste wassing en vervang met 4% formaldehyde in 1x PBS (100 μL per put).
   Let op: Formaldehyde is een potentieel kankerverwekkend. Behandel met zorg in overeenstemming met de gezondheids-en veiligheidsrichtlijnen.
4. Plaats de 96-put plaat op een labbank, dek af met folie en laat 24 uur op kamertemperatuur liggen.
5. Verwijder voorzichtig de formaldehyde en vervang deze door 1x PBS. Herhaal deze 1x PBS Wash 3x.
6. Maak 0,1% Triton X-100 klaar in 1x PBS. Verwijder de 1x PBS Wash en vervang met 100 μL van de Triton X-100 oplossing. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de blokkerende oplossing met 1x PBS en 0,05% mageremelkpoeder en meng grondig.
7. Verwijder Triton X-100 en was 3x met 1x PBS. Voeg 100 μL blokkerende oplossing toe aan elk goed en incuberen gedurende 15 minuten.
8. Verdun het vereiste primaire antilichaam in de blokkerende buffer bij de vooraf bepaalde concentratie. Hier, gebruik anti-muis IgG geacetseerd tubuline antilichamen (1:100).
9. Centrifugeer de primaire antistofblokkerende buffer mix gedurende 5 minuten bij 15.682 x g. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing en voeg de supernatant (25 − 50 μL) toe aan elk goed. Inincuberen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
10. Verwijder de antilichaam oplossing en was 3x met 1x PBS (100 μL per put).
11. Verdun het secundaire antilichaam in de blokkerende buffer bij de aanbevolen of vooraf bepaalde concentratie, naast eventuele extra fluorescerende vlekken. Hier, gebruik 1:500 anti-muis fluorophore-488 geconjugeerd antilichaam, phalloidin-594 (1:500) voor actine kleuring, en de DNA vlek (DAPI).
12. Centrifugeer nogmaals de secundaire antilichaam oplossing gedurende 5 minuten bij 13.000 tpm.
13. Verwijder de blokkerende oplossing van elke put en voeg 25 − 50 μL van het secundaire antilichaam/phalloidine/DAPI-mengsel toe. Inincuberen in het donker voor 1,5 uur bij kamertemperatuur.
14. Verwijder secundaire antistof oplossing en was 3x met 1x PBS (100 μL per put).
15. Til individuele collageen pluggen voorzichtig op met een plastic pipet (200 μL) op het midden van een hoge kwaliteit glijbaan van glas.
16. Voeg een druppel van een geschikte inbedmiddel toe aan de collageen plug, zodat de stekker volledig bedekt is. Vermijd bubbels.
17. Breng de afdekfolie van de optimale dikte aan voor de Microscoop doelstelling die zal worden gebruikt voorbeeld vorming en laat 's nachts instellen. Bewaar de glaasjes bij kamertemperatuur in het donker.

4. fluorescentiemicroscopie

1. Vang fluorescerende beelden met behulp van een geschikte confocale Microscoop.

Resultaten

Driedimensionale spheroid-technologie vordert het begrip van interacties tussen geneesmiddelen en tumoren, omdat het meer representatief is voor de kankerspecifieke omgeving. De generatie van sferoïden kan op verschillende manieren worden bereikt; lage hechting 96-put platen werden gebruikt in dit protocol. Na het testen van verschillende producten van verschillende fabrikanten, werden de hier gebruikte platen gekozen omdat ze consequent het beste presteerden in termen van succesvolle sph...

Discussie

Een nieuwe manier om kankercel sferoïden te maken voor de identificatie van de activiteit van migraine met behulp van hoge-resolutie confocale microscopie wordt beschreven. Het gebruik van lage hecht platen over andere technieken, zoals hangende druppels¹⁵, heeft een middel vergemakkelijkt om reproduceerbare en uniforme sferioïden te genereren voor gebruik in de collageen migratie en invasie testen. De kritische punten in dit protocol zijn de verwijdering van het groeimedium van de 96-put voor de ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	voor glioma invasie assay; dit wordt door veel distributeurs/fabrikanten aangeboden en moet worden bepaald voor zowel het type beoogde assay als de gebruikte cellijnen. Voor glioma kankercellijnen is Collagen rat tail type 1 (bijv. Corning) de voorkeurskeuze. Collageen moet worden bewaard bij 4 °C, in het donker, totdat het nodig is. Het is niet raadzaam om collageen uit verschillende batches te mengen, omdat dit de consistentie van het gepolymeriseerde collageen kan beïnvloeden.
Coverslips	various	various	voor microscopisch beeld
DMEM poeder	Sigma	D5648	nodig bij 5x concentratie voor collageen oplossing voor glioma invasie assay;  dit kan worden gekocht in poedervorm, gemaakt in dubbel gedestilleerd water en, afhankelijk van de uiteindelijke samenstelling van het groeimedium, worden aangevuld met alle vereiste toevoegingen. De volledige 5x oplossing moet vóór gebruik worden gefilterd door een spuitfiltersysteem (0,22 μm).
Foetaal runder serum	Sigma	F7524-500ML	nodig voor celkweek van glioma cellijnen
Glijbanen	various	various	voor microscopisch beeld
High glucose DMEM	Gibco	41965062	nodig voor celkweek van glioma cellijnen
Remmer	Tocris	various	various - volgens experimenteel ontwerp; remmers kunnen worden gekocht bij fabrikanten zoals Selleckchem en Tocris. Deze fabrikanten bieden een gedetailleerde beschrijving van remmerkenmerken, links naar geassocieerde referenties en suggesties voor werkconcentraties. Zoals bij alle remmers, kunnen ze mogelijk giftig zijn en moeten ze worden behandeld volgens gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen. Remmers worden bereid als stapoplossingen zoals aanbevolen door de fabrikant. Als voorbeeld gebruikten we de migrastatische remmer MI-192 om het gebruik van dergelijke remmers te demonstreren. We hebben een reeks migrastatische remmers op deze manier getest met vergelijkbare resultaten.
Montant	various	various	voor microscopisch beeld
NaOH (1 M)	various	various	NaOH kan worden gekocht bij de vereiste molairiteit of bereid uit vaste vorm. De bereide oplossing moet worden gefilterd gesteriliseerd met behulp van een spuitfiltersysteem. Een M NaOH is corrosief en voorzichtigheid is geboden bij de bereiding van de oplossing.
Paraformaldehyde	various	various	voor het fixeren van sferoïden en cellen; maak op 4%, let op gezondheidsrisico, zorg ervoor dat de gezondheids- en veiligheidsvoorschriften worden nageleefd voor collageenoplossing voor invasie assay
Pastettes (gegradueerde pipet, 3 mL)	various	various	voor invasie assay, oplossing verwijderen
PBS, steriele voor weefselkweek	Sigma	D1408-500ML	nodig voor celkweek van glioma cellijnen en wasbeurten voor kleuring
Pen/strep (antibiotica)	Sigma	P4333	nodig voor celkweek van glioma cellijnen
Primaire antilichaam, secundair antilichaam, DAPI, Phalloidin	various	various	er zijn veel fabrikanten van deze reagentia, voor secundair gelabelde antilichamen raden we Alexa Fluor aan (Molecular Probes). Hier gebruikten we voor primaire antilichamen muis anti-acetyleerde tubuline antilichaam (1/100, Abcam). Voor secundaire antilichamen gebruikten we 1/500 anti-muis Alexa Fluor 488 geconjugeerd antilichaam, Molecular Probes. Voor nucleaire kleuring gebruikten we DAPI (veel fabrikanten) en de actinekleuring Phalloidin (veel fabrikanten), beide gebruikt bij aanbevolen verdunning van 1/500.
Natriumbicarbonaat	Sigma	S5761	nodig voor collageenoplossing voor glioma invasie assay bij 5x concentratie
Natriumpyruvaat	Sigma	P5280	nodig voor collageenoplossing voor glioma invasie assay bij 5x concentratie
Trypsine	Sigma	T4049	voor trypsinisatie
Ultra laag adherente platen	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	voor glioma invasie assay; een laag adherente plaat is vereist, met 96-well platen bij voorkeur om grootschalige screening van onderzochte verbindingen mogelijk te maken. Er zijn verschillende laag adherente platen commercieel verkrijgbaar; het is raadzaam om een verscheidenheid aan platen te testen voor optimale sferoïdegeneratie. In onze ervaring werkt Costar Ultra Low Cluster met deksel, ronde bodem, het beste voor de generatie van sferoïden uit glioma kankercellen in termen van 100% sferoïdevorming en reproduceerbaarheid. Deze platen werden ook met succes gebruikt voor de generatie van glioma sferoïden uit patiënt-afgeleid materiaal, blaas- en eierstokkankercellen in ons laboratorium. Bovendien kunnen stam- of voorloperspheroiden in deze platen worden gebruikt om de generatie van gestandaardiseerde neurosfeer-sferoïden te vergemakkelijken
Stripettes (serologische pipetten, steriele, 5 mL en 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	voor weefselkweek en collageenbereiding
Verschillende multikanaals (50 - 250 μL) en enkelkanaals pipetten (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	voor cel- en sferoidebehandeling
Widefield microscopie	various	various	voor observatie van sferoidegeneratie en sferoidebeeldvorming; hier werden wide-field fluorescentiebeelden vastgelegd met behulp van een EVOS FL cell imaging systeem (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM uitgerust met een Plan Apochromat 63x 1.4 NA olie objectief	Zeiss	citaat van fabrikant	Confocale beelden werden vastgelegd met behulp van een Zeiss LSM 880 CLSM uitgerust met een Plan Apochromat 63x 1.4 NA olie objectief. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline en HeNe 594nm lasers werden gebruikt om respectievelijk Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 en DAPI te exciteren. Voor elke afbeelding werd een enkele representatieve optische sect