Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Time-lapse 2D-beeldvorming van fagocytische activiteit in M1 macrophage-4T1 muis borstkanker cellen in co-culturen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) zijn geïdentificeerd als een belangrijk onderdeel voor tumorgroei, invasie, metastase, en resistentie tegen kankertherapieën. Echter, tumor-geassocieerde macrofagen kunnen schadelijk zijn voor de tumor afhankelijk van de tumor micro omgeving en kunnen reversibel veranderen hun fenotypische kenmerken door ofwel van de cytotoxische activiteit van immune cellen of verbetering van de anti-tumor reactie. De moleculaire acties van macrofagen en hun interacties met tumorcellen (bijv. fagocytose) zijn niet uitvoerig bestudeerd. Daarom is de interactie tussen immune cellen (M1/M2-subtype TAM) en kankercellen in de tumor micro omgeving nu een focus van kanker immunotherapie onderzoek. In de huidige studie werd een levend celcocultuurmodel van geïnduceerde M1 macrofagen en muizen borst 4t1 carcinoom ontwikkeld om de fagocytische activiteit van macrofagen te beoordelen met behulp van een time-lapse video-functie met behulp van phase-contrast, fluorescerende en differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie. De huidige methode kan multipoint Live-celbeeldvorming van phagocytose observeren en documenteren. Fagocytose van 4T1 cellen door M1 macrofagen kan worden waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie voordat kleuring 4T1 cellen met carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). De huidige publicatie beschrijft hoe macrofagen en tumorcellen samen te brengen in een enkele beeldvormings schotel, polariseren M1 macrofagen, en opnemen multi punt gebeurtenissen van macrofagen engulfing 4T1 cellen tijdens 13 h van coculture.
Inleiding
Macrofagen zijn de eerste regel van immuun verdediging en spelen een rol bij het indelen van immuunresponsen tegen pathogenen en vreemde materialen, met inbegrip van kankercellen. Ze zijn een gespecialiseerde fagocyte die vernietigt en verlost van ongewenste deeltjes in het lichaam. Macrofagen dragen defensieve functies zoals de klaring van apoptotische cellen en micro-organismen en de werving van andere immuuncellen1. Macrofagen kunnen zich onderscheiden in twee verschillende types, M1 en m2 macrofagen, als reactie op omgevings signalen2. M1-gepolariseerde macrofagen (d.w.z. klassiek geactiveerde macrofagen) worden geac....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: secties 1 − 6 beschrijven het cocultuurmodel van 4T1 muis-borstkanker cellen en RAW 264,7 muis macrofagen. Sectie 7 beschrijft de time-lapse-beoordeling van M1 macrofagen phagocyted 4T1 cellen.
1. culturing 4T1 muis borstkanker cellen en RAW 264,7 muis macrofagen
- Ontdooien een flacon met cryogene conserven 4T1 en RAW 264,7 passage 6 cellen door zachte opwinding in een waterbad bij 37 °C of de normale groei temperatuur voor de cellijnen.
Opmerking: ontdooien moet snel worden gedaan, ongeveer binnen 2 min. Om verontreiniging te voorkomen, verwijdert u de injectieflacon uit het waterbad en ontsmet u deze door te spuiten....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De time-lapse tweedimensionale (2D) beelden van het cocultuurmodel van 4T1 muis borstkanker cellijnen tonen de 4T1 cellen die worden overspoeld door M1 macrofagen gedurende een periode van 13 uur. Het is belangrijk om te zorgen voor een volledige polarisatie van de M1 macrofagen door het uitvoeren van immunokleuring. De resultaten (Figuur 1) tonen aan dat de concentratie van 100 ng/ml lipopolysacchariden (LPS) en 20 ng/ml IFN-γ gepolariseerde RAW 264,7 macrofagen in de M1 staat. Het labelen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het beschreven protocol vereist twee stappen: 1) cocultuur van 4T1 muizen-borstkanker cellen en M1-gepolariseerde macrofagen, en 2) beoordeling van de macrofaag fagocytische activiteit met behulp van timelapse-microscopie. Live Cell coculture wordt veel gebruikt in fagocytose en Migratietesten. Het Live Cell coculture model hier is een eenvoudige, aanpasbare in vitro procedure (Figuur 2) die gebruik maakt van een fluorescerende kleurstof, CFSE, die wordt gebruikt om de 4T1-doelcellen te labe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel gefinancierd door Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. We willen graag het agro-biotechnologie Instituut, Maleisië (ABI) laboratoria en microscopie Imaging Facility bedanken. Speciale dank aan Mohd Daniel Hazim voor hulp bij het bewerken en opnemen van de experimentele video voor dit werk.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Referenties
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
