Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Summary

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Abstract

Binnen meercellige organismen vertonen rijpe weefsels en organen een hoge mate van orde in de ruimtelijke ordening van hun samenstellende cellen. Een opmerkelijk voorbeeld wordt gegeven door zintuiglijke epithelia, waar cellen van dezelfde of verschillende identiteiten worden samengebracht via celcelhechting met zeer georganiseerde planaire patronen. Cellen uitlijnen op elkaar in dezelfde richting en tonen gelijkwaardige polariteit over grote afstanden. Deze organisatie van de rijpe epithelia wordt opgericht in de loop van morfogenese. Om te begrijpen hoe de vlakke opstelling van de volwassen epithelia wordt bereikt, is het cruciaal om celoriëntatie en groeidynamiek te volgen met een hoge spatiotemporale getrouwheid tijdens de ontwikkeling in vivo. Robuuste analytische instrumenten zijn ook essentieel om lokale-naar-wereldwijde overgangen te identificeren en te karakteriseren. De Drosophila pop is een ideaal systeem om georiënteerde celvormveranderingen te evalueren die ten grondslag liggen aan epitheelmorogenese. Het pupale ontwikkelende epitheel vormt het buitenoppervlak van het onbeweeglijke lichaam, waardoor op lange termijn beeldvorming van intacte dieren mogelijk is. Het hier beschreven protocol is ontworpen om celgedrag op zowel mondiaal als lokaal niveau in de pop abdominale opperhuid te beeld en te analyseren terwijl het groeit. De beschreven methodologie kan gemakkelijk worden aangepast aan de beeldvorming van celgedrag in andere ontwikkelingsstadia, weefsels, subcellulaire structuren of modelorganismen.

Introduction

Om hun rol te bereiken, epitheelweefsels volledig vertrouwen op de ruimtelijke organisatie van hun cellulaire componenten. In de meeste epithelia, cellen zijn niet alleen verpakt tegen elkaar om een nauwkeurige kasseienlaag te creëren, maar ze oriënteren zich ten opzichte van het lichaam assen.

Het functionele belang van nauwkeurige weefselorganisatie is duidelijk in zintuiglijke epithelia, zoals het gewervelde binnenoor en het netvlies. In het eerste geval richten haar- en ondersteunende cellen zich in een specifieke axiale richting om mechanische ingangen zoals geluid en beweging^1,2

Protocol

OPMERKING: Dit protocol is verdeeld in vijf stappen: (1) het ensceneren van de poppen, (2) het voorbereiden van de poppen voor beeldvorming, (3) live beeldvorming van de groeiende buikelia, (4) generatie van genetische mozaïeken, (5) gegevensverwerking en -analyse (inclusief secties die beschrijven hoe de celoriëntatiedynamiek te analyseren vanuit de contouren van de celverbinding en de groei van de groei van celklonen).

1. Enscenering van Drosophila pop voor beeldvorming

1. Kweekvliegen van het juiste genotype op standaardmedium in plastic flacons bij 25 °C gedurende 5 dagen (±12 uur) na het leggen van eieren (AEL).
   OPME....

Results

Het hierboven beschreven protocol heeft betrekking op de bereiding van Drosophila-poppen voor langdurige live beeldvorming en de procedures voor de analyse van celoriëntatie en groeidynamiek van de buikopperken. Door het toepassen van deze methode is het mogelijk om hoge resolutie films van de zich ontwikkelende poppen te genereren voor perioden van maximaal 48 uur zonder significante fotobleaching of fototoxiciteit. Snapshots met de buikopperhuid (bijvoorbeeld histoblasten en LE.......

Discussion

De orde van de lange afstand is een essentieel kenmerk van de meeste functionele fysiologische eenheden. Tijdens morfogenese wordt de orde bereikt door de integratie van complexe instructies die met hoge temporele en ruimtelijke precisie worden uitgevoerd. Meerdere en multilevel beperkingen zijn geïntegreerd in gestereotypeerde weefsel regelingen.

Polariteit en directionaliteit zijn cruciaal voor de geordende ruimtelijke ordening tijdens de ontwikkeling. Polariteit impliceert symmetrie breken .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis Software	-	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	-	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	-	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection