Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Samenvatting

Candida albicans is een schimmel component van de darm microbiota bij de mens en vele andere zoogdieren. Hoewel C. albicans geen symptomen in de meeste gekoloniseerde hosts veroorzaken, het commensale reservoir fungeert als een opslagplaats voor besmettelijke ziekte, en de aanwezigheid van hoge schimmel Antilichaamtiters in de darm wordt geassocieerd met inflammatoire darmziekte. Hier beschrijven we een methode om C. albicans celmorfologie en lokalisatie in een muismodel van stabiele gastro-intestinale kolonisatie te visualiseren. De kolonisatie wordt vastgesteld met behulp van een enkelvoudige dosis van C. albicans bij dieren die zijn behandeld met orale antibiotica. Segmenten van het weefsel van de darmen zijn vastgesteld op een manier die de architectuur van luminal inhoud (micro-organismen en slijm), evenals de gastheer slijmvlies behouden. Tot slot wordt fluorescentie-in-situ hybridisatie uitgevoerd met behulp van sondes tegen schimmel-rRNA tot vlek voor C. albicans en Hyphae. Een belangrijk voordeel van dit protocol is dat het toelaat om gelijktijdige observatie van C. albicans celmorfologie en zijn ruimtelijke associatie met gastheer structuren tijdens gastro-intestinale kolonisatie.

Inleiding

Candida albicans is een schimmel commensaal en een opportunistisch humaan pathogeen. Deze gist mist een gedefinieerde milieu-niche en in plaats daarvan propageert binnen de gastro-intestinale (GI) tractus, huid, en urogenitaal tractus van mensen en andere zoogdieren¹. Terwijl vroeg onderzoek naar C. albicans zich voornamelijk richtte op zijn virulentie potentieel, suggereren verschillende recente rapporten dat commensally teelt organismen in de darmen belangrijke rollen kunnen spelen in de normale gezondheid, met inbegrip van de immuunontwikkeling van de host^2,3,4. Om onderzoek van C. albicans commensalism binnen de zoogdier darm te vergemakkelijken, ontwikkelden we een muismodel van stabiele GI-kolonisatie en een fluorescentie in situ hybridisatie (vis)-gebaseerde methode om schimmel gistcellen en schimmeldraden te visualiseren binnen de intestinale lumen.

Met enkele uitzonderingen⁵, laboratorium-gefokte muizen vertonen meestal weerstand tegen schimmel kolonisatie van het spijsverteringskanaal. Kolonisatie resistentie wordt verondersteld te worden bemiddeld door specifieke bacteriële soorten; Dit kan echter worden overwonnen door de behandeling van de dieren met antibiotica^6,7 of het gebruik van een chemisch gedefinieerd dieet dat vermoedelijk bacteriesoorten samenstelling^8,9verandert. Evenzo is bij mensen het gebruik van breedspectrum antibiotica in verband gebracht met C. albicans begroeiing en verspreiding¹⁰. Ons model van de kolonisatie van de Murine maakt gebruik van breedspectrum antibiotica om C. albicans kolonisatie van immunocompetente, conventioneel gehouden muizen te vestigen. Penicillaire en streptomycine worden in het drinkwater van de dieren aangeboden gedurende een week voorafgaand aan de maagsonde met 10⁸ kolonie vormende eenheden (cfus) van C. albicans. Zolang het antibioticum-geïnfundeerd water wordt voortgezet, C. albicans zal propageren door de GI tractus, het bereiken van fecale Antilichaamtiters van 10⁶− 10⁸ cfus/g. Ondanks de hoge mate van schimmel kolonisatie, dieren blijven gezond en gewichtstoename tegen dezelfde snelheid als niet-geïnfecteerde controles. Dit model is met succes gebruikt om te schermen voor en karakteriseren meerdere C. albicans commensalism factoren^11,12.

Net als andere leden van het schimmel rijk, C. albicans is geschikt voor enorme morfologische plasticiteit¹³. Onder in vitro omstandigheden is aangetoond dat het een overgang is tussen ten minste zes unicellulaire gistcellen, evenals multicellulaire schimmeldraden en pseudo-schimmeldraden. De gist-naar-hypha-overgang is een van de best gekenmerkte virulentie kenmerken, en schimmeldraden en pseudo-schimmeldraden domineren in de meeste zoogdieren ziekte modellen, evenals in geïnfecteerde menselijke weefsels. Om de lokalisatie en celmorfologie van C. albicans in het spijsverteringskanaal van Murine te bepalen, ontwikkelden we een vistechniek voor het verkleuren van gisten en schimmeldraden in vaste histologische secties. De sondes bestaan uit fluorescently gelabelde DNA-oligonucleotiden die hybridiseren om 23S ribosomaal RNA (rRNA), die wordt verspreid over het gehele schimmel cytoplasma. Omdat gastheer weefsels zijn vastgesteld op een manier die de driedimensionale architectuur van de darm behoudt, met inbegrip van de gastheer mucosa, spijsvertering materiaal, de bacteriële microbiota, en slijm in de darm lumen, deze techniek maakt de lokalisatie van schimmel cellen met betrekking tot deze bezienswaardigheden wanneer gekleurd. De VISTECHNIEK vergelijkt gunstig met traditionele histologische vlekken voor schimmels, zoals periodieke acid Schiff (PAS) of Gomori's methenamine-zilver (GMS), evenals in de handel verkrijgbare schimmelwerende antilichamen, omdat deze reagentia niet specifiek zijn voor C. albicans. Bovendien verwijderen standaard Fixatieven de slijm-laag en verstoren ze andere inhoud van het darm lumen^14,15.

In dit artikel, bieden we gedetailleerde instructies voor het opzetten van high-grade C. albicans kolonisatie van de muis GI tractus, voor dissectie van het spijsverteringskanaal van geëugiseerde dieren, voor weefsel fixatie op een manier die luminal behoudt architectuur, en voor de detectie van C. albicans binnen gastheer weefsels met behulp van vis. Naast wild type en Mutant stammen van C. albicans, kan de maagsonde techniek worden gebruikt om andere micro-organismen te leveren. De fixatie techniek zou nuttig zijn voor elke studie waarin het behoud van de darminhoud gewenst is. De VISPROCEDURE kan binnen een dag worden voltooid en kan worden gebruikt om meerdere schimmelsoorten te lokaliseren met behulp van meerdere, differentieel gelabelde sondes.

Protocol

De hieronder beschreven stappen zijn goedgekeurd door het UCSF institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).

1. gastro-intestinale kolonisatie van muizen met C. albicans met behulp van orale gavage

1. Voorzie in huisvesting voor 18 − 21 g mannelijke of vrouwelijke muizen (8 − 10 weken oud) zoals goedgekeurd door de lokale IACUC. Gebruik geautoclaveerd voedsel en water vanaf de eerste dag.
   Opmerking: Het gebruik van gesteriliseerde kooien, beddengoed, voedsel en water vermindert het risico van besmetting met antibiotica-resistente milieu bacteriën die C. albicans mogelijk van de darm kunnen verdringen. Verder moet, afhankelijk van de experimentele vraag, individuele huisvesting van dieren worden overwogen, omdat muizen coprofagisch zijn en de darminhoud wordt gedeeld tussen de huisdieren.
2. De volgende dag, vervang het geautoclaveerd drinkwater met geautoclaveerd water met 5% glucose, 1.500 U/mL penicillaire G, en 2 mg/mL streptomycine.
3. Bereid voor het gemak 200x antibiotica voorraadoplossingen (tabel 1) van tevoren, filter steriliseren en Vries bij-20 °c.
4. Gedurende één weekdieren op antibiotica te houden.
   1. Op de dagen 3 en 6 nadat antibiotica zijn gestart, beoordelen de ontlasting van elk dier voor besmetting met antibiotica-resistente aërobe bacteriën. Het houden van een dier met één hand, plaats een niet-afgetopte microfugebuis buis in de buurt van de anus en het verzamelen van ten minste één fecale pellet.
   2. Respendeer elke fecale pellet in 1 ml steriel water en plaat 100 μL op Luria Bouillon (lb), gistextract pepton dextrose (yepd) of hersen hart infusie (BHI) plus bloedagar platen. Incubeer de platen 's nachts in een standaard incubator (niet anaerobe) bij 37 °C en evalueer de bacteriegroei.
      Opmerking: Platen moeten een minimale groei vertonen (0 − 20 kolonies). Als > 20 kolonies bacteriën worden teruggewonnen uit dieren die met penicilin en streptomycine worden behandeld, is het onwaarschijnlijk dat de kolonisatie op hoog niveau met C. albicans zal worden vastgesteld en het experiment moet worden afgebroken.
5. Drie dagen voor de gavage, streak C. albicans van bevroren glycerol voorraden tot YEPD + 2% agar platen en inincuberen bij 30 °c gedurende 2 dagen.
6. Een dag voor de sonde, inoculeren één kolonie van elke C. albicans stam te worden getest in 5 ml vloeibare YEPD. Incuberen bij 30 °C 's nachts met schudden.
7. De ochtend van de maagsonde, Verdun de verzadigde cultuur van C. albicans tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) van 0,1 in 100 ml yepd voorverwarmd tot 30 °c. Schud in een rondschudapparaat bij 200 rpm bij 30 °C voor tussen 4 uur en 5 uur tot OD₆₀₀ 1 (Mid-log groei) bereikt.
8. Breng elke 100 mL cultuur over naar 2 50 mL conische buizen en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   Opmerking: C. albicans propageert relatief langzaam bij RT. Bij de aanpassing van dit protocol aan een andere soort moet de entmateriaal mogelijk op ijs worden gehouden om verdere groei te voorkomen.
9. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de gepelleteerde cellen in 20 mL steriele zoutoplossing per 50 mL van de cultuur, en pool de dubbele geresuspendeerde pellets in enkele conische buizen. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 min.
10. Gooi de supernatant weg en regeer in 20 mL steriele zoutoplossing. Vortex kort en verwijder 20 μL voor OD₆₀₀ meting. Verdun 1:50 in steriele normale zoutoplossing. Centrifugeer de overgebleven resuspendeerde cellen bij 3.000 x g gedurende 5 minuten.
11. Gooi het supernatant weg. Voor een entmateriaal grootte van 1 x 10⁸ CFU, respendeert de gepileerde cellen tot ongeveer 5 x 10⁸ cfus/ml in steriele normale zoutoplossing op basis van de geschatte concentratie bepaald door od₆₀₀ meting.
    Opmerking: Typisch, een OD₆₀₀ van 1 komt overeen met ~ 1 x 10⁷ gistcellen/ml. Deze waarde kan variëren per spectrofotometer en moet worden geverifieerd. Als een verandering in de concentratie gewenst is voor infecties met een ander micro-organisme, plan dan een entmateriaal volume van ≤ 10 μL/g muis om het ongemak voor het dier te minimaliseren.
12. Controleer de concentratie van het entmateriaal door een 1:1000 verdunning met een hemocytometer te tellen. Stel het volume van de cellen die worden gavaged op basis van de concentratie bepaald met behulp van de hemocytometer.
13. Gebruik een naald voor het voederen van dieren (Figuur 1A) en voer elk dier een maagsonde met het berekende volume van een gegeven entmateriaal. Zie de stappen 1.13.1 − 1.13.8 voor de maagsonde procedure.
    Opmerking: training voor maagsonde moet worden verkregen van een ervaren beoefenaar, en de procedure moet vooraf worden beheerst. Een succesvolle procedure voor een enkel dier duurt doorgaans niet langer dan 1 minuut.
    1. Bevestig een geautoclaveerd diervoeder naald aan een 1 ml spuit en vul de spuit met één maagsonde volume en verwijder eventuele luchtbelletjes om een onnauwkeurige dosis te voorkomen. Plaats op een steriel oppervlak.
    2. Verzeker het dier voor de maagsonde. Houd het dier aan de voet van de staart met de dominante hand en schuif niet-dominante hand omhoog van het dier terug naar de losse huid net achter de oren.
    3. Met behulp van de wijsvinger en duim van de niet-dominante hand, de losse huid samen te verzamelen strak; Dit is de "Scruff". Pak het dier door zijn Scruff en lus kleine vinger van dezelfde (niet-dominante) hand rond de staart om het dier te immobiliseren tegen de Palm van de hand. Strek het hoofd van het dier voorzichtig uit zodat het hoofd en het lichaam (en dus de nek en de slokdarm) zich in een rechte lijn bevinden.
       Opmerking: Het proberen van een maagsonde terwijl het lichaam van het dier is gebogen of gedraaid kan leiden tot complicaties zoals oesofageale perforatie en overlijden van het dier.
    4. Neem de spuit met de dominante hand op en houd loodrecht op het dier, waarbij de gebogen naald naar beneden wijst (Figuur 1B). Met behulp van de bal van de naald, zachtjes haken een binnenste hoek van de mond, voorzichtig de naald langs de zijkant van de mond naar de achterkant van de keel, en tenslotte Beweeg de naald naar het centrum.
       Opmerking: Het introduceren van de naald langs een laterale pad helpt om weerstand van de tanden en tong van het dier te voorkomen.
    5. Wanneer de bal van de naald zich aan de achterkant van de keel bevindt, tilt u de naald omhoog zodat deze parallel is met de lichaams lijn van het dier (Figuur 1C).
       Opmerking: Op dit punt zal het dier een gag reflex vertonen. Dit is een goed teken dat aangeeft dat de naald correct gepositioneerd is, en de kokhalzen beweging helpt om de naald langs de slokdarm te leiden. Als er geen gag reflex, de naald kan worden in de luchtpijp in plaats van de slokdarm. Trek de naald voorzichtig uit en ga terug naar stap 1.13.1.
    6. Laat het dier het entmateriaal door slikken tot slechts enkele millimeter zichtbaar blijven (Figuur 1D). De naald soepel te laten verlopen.
       Opmerking: Als de naald niet verder, Vermijd het gebruik van kracht, die de slokdarm kan beschadigen. Soms is het voor de laatste halve centimeter een extra grote gag van het dier nodig. Als de naald lijkt vast te zitten, trekt u deze langzaam in en probeert u het opnieuw vanaf stap 1.13.4.
    7. Test of de bal van de naald zich op de juiste plaats bevindt (maag) door de zuiger zachtjes te bewegen. Als er geen weerstand is, blijf het inoculum leveren. Zodra het entmateriaal is toegediend, trekt u de naald langzaam terug.
    8. Vervang het dier in zijn kooi en blijf het dier gedurende 5 − 10 minuten controleren op tekenen van moeizame ademhaling of nood. Controleer of het dier de normale activiteit snel na de maagsonde hervat.
    9. Als hetzelfde entmateriaal met het volgende dier wordt gebruikt, reinig dan de naald met een alcoholdoekje. Ga terug naar stap 1.13.1. Als een ander entmateriaal wordt gebruikt, gebruik dan een nieuwe naald en ga terug naar stap 1.13.1.
       Opmerking: Het is belangrijk om dieren te inspecteren de dag na de maagsonde. Dieren die tekenen van nood vertonen (bijv. gejakte houding, moeizame ademhaling) moeten humaan worden geëoeid, omdat ze waarschijnlijk oesofageale breuk, beschadiging van de longen of een ander intern letsel hebben opgelopen waarvan het herstel onwaarschijnlijk is.
14. Na de maagsonde van de dieren, plaat verdunningen van de entmateriaal voor dosis verificatie.
    1. Bereid 10-voudige seriële verdunningen tot 1:10⁵. Plaat één maagsonde volume van de 1:10⁵ verdunning op een 100 mm plaat van sabouraud dextrose agar.
    2. Incuberen de plaat gedurende 2 dagen bij 30 °C. Graaf CFUs om de dosis van het entmateriaal te bevestigen.

2. bereiding van gastro-intestinale weefsels voor histologie

Opmerking: Dit deel van het protocol is aangepast van Johansson en Hansson¹⁶.

1. Bereid 500 mL methacarn-oplossing (60% methanol, 30% chloroform, 10% ijsazijn) in een grote schroefdop plastic potje voor elke 2 dieren ontleed.
   Let op: Methanol en chloroform zijn schadelijk bij inademing en dienen te worden gemanipuleerd in een chemische afzuigkap. Ijsazijn kan corrosief zijn en moet worden behandeld met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Methanol, chloroform en ijsazijn moeten als gevaarlijk afval worden weggegooid.
2. Op het experimentele eindpunt, euthaniteren dieren humaan volgens een protocol goedgekeurd door de lokale IACUC.
   Opmerking: Bij met antibiotica behandelde dieren varieert de kolonisatie van C. albicans meestal van ~ 10⁶ cfus/g op dag 5 tot ~ 5 x 10⁷ cfus/g op dag 25.
3. Steriliseer dissectie gereedschap met 10% bleekwater en spoel met 70% ethanol.
4. Beveilig elk dier tot een dissectie oppervlak, met een ventrale kant naar boven gericht. Gebruik 30 G naalden om de ledematen op het dissectie oppervlak te zetten (Figuur 2A). Spray het dier met 70% ethanol om de vacht te reinigen en het vasthouden aan de gereedschappen te minimaliseren.
5. Knijp met een stompe-ended pincet in een gedeelte van de buikhuid met een niet-dominante hand. Met behulp van een schaar met een dominante hand, de huid en de onderliggende fascia in de buurt van de basis van het bekken. Strek de incisie in een U-vorm langs elke kant van de peritoneale Holte en tot aan de ribbenkast. Til de huid uit de weg.
6. Met behulp van een potlood, prelabel histologie cassettes voor de te beoordelen GI-segmenten. Bijvoorbeeld, voor elk dier, label afzonderlijke cassettes als "maag," "proximale dunne darmen," "Mid dunne darmen," "distale dunne darmen," "Cecum," en "grote darmen." Plaats een schuimkussen op de onderkant van elke cassette (Figuur 2a).
   Opmerking: afbeelding 2B schetst voorgestelde secties om in cassettes te plaatsen.
7. Met behulp van bot-ended Tang, voorzichtig uitpakken van de blindedarm uit de peritoneale holte. Gebruik een schaar om verbindingen tussen de blindedarm en de kleine en grote darmen te verbreken.
   Opmerking: Cecal weefsel is zeer delicaat en gemakkelijk te scheuren. Wees voorzichtig bij het manipuleren.
8. Plaats de hele blindedarm in een histologie cassette zodat deze niet gedraaid is en plat ligt (Figuur 2C). Plaats een tweede schuimrubberen kussentje bovenop en sluit de cassette. Plaats de cassette in een schroefdop pot met methacarn.
9. Accijns een deel van de dikke darmen dat 1 − 2 fecale pellets bevat, met een lengte kleiner dan die van de cassette.
10. Plaats het weefsel gedeelte in de cassette, houd het weefsel plat en onverwrongen. Overlay met een tweede schuimkussen en sluit de cassette. Plaats de cassette in methacarn.
11. Voor elke sectie van de kleine darmen te bemonsteren, accijns een 1 − 2 cm segment dat een aantal spijsverterings materiaal bevat.
12. Plaats het segment in een histologie cassette, zodat het weefsel plat en onverwrongen blijft. Overlay met een tweede schuimkussen en sluit de cassette. Plaats de cassette in methacarn.
13. Voor de maag, verbreken de verbindingen met de slokdarm en dunne darmen. Plaats in een cassette, houd het weefsel plat en onverwrongen. Overlay met een tweede schuimkussen en sluit de cassette. Plaats de cassette in methacarn.
14. Laat de cassettes in methacarn-oplossing bij RT gedurende ten minste 3 uur en minder dan 2 weken.
    Opmerking: Er zijn verschillende punten gedurende welke de vaste GI-segmenten kunnen worden overgebracht naar een commerciële histologie dienst. Deze weefsels kunnen moeilijk in sectie zijn zonder verstoring van de Luminale inhoud, en optimale resultaten zullen worden verkregen door een ervaren technicus. Als de commerciële dienst bereid is om te wassen voordat de weefsels in paraffine worden ingesloten, kunnen de cassettes in dit stadium worden verzonden samen met instructies voor stap 2,16.
15. Begin met het smelten van voldoende paraffinewas om alle weefsel cassettes in een groot bekerglas in een voorverwarmde 70 °C hybridisatie oven te bedekken.
16. Na fixatie, verwijder de schuim pads en retourneer elke intact weefsel sectie terug in de cassette. Was de weefsels met de volgende oplossingen bij RT met schudden: tweemaal voor 35 min in 100% methanol, tweemaal gedurende 25 minuten in 100% ethanol, tweemaal gedurende 20 minuten in xyleen.
    Let op: Xyleen is ontvlambaar, giftig en kan bij inademing schade veroorzaken. Gebruik in een chemische afzuigkap met een goede bescherming. Gooi xyleen weg via gevaarlijke afval procedures.
17. DEP de cassettes droog op een papieren handdoek en plaats deze in pregesmolten paraffinewas voor 2 uur bij 70 °C in een hybridisatie oven. Zorg ervoor dat de cassettes gevuld zijn met paraffine en dat er geen bubbels achterblijven.
    Opmerking: Deze stap stelt de wax in staat om het GI-segment te infiltreren en het weefsel en de inhoud te stabiliseren.
18. Verwijder de cassettes van wax, laat de overtollige Wax uitlekken en bewaar ze bij RT totdat ze in Wax blokken zijn ingebed. Gooi de wax met sporen van xylenen weg als gevaarlijk afval.
    Opmerking: Het Noble Lab gebruikt een commerciële histologie dienst voor het insluiten en snijden van weefsels. Voor standaard visualisatie van C. albicans gisten en Hyphae worden 4 μm secties gebruikt. Voor het evalueren van de connectiviteit van hyphal segmenten, die doorgaans door meerdere vlakken reiken, kunnen 8 μm secties worden gebruikt. Afhankelijk van het vermogen van de VISSONDES om in het preparaat te dringen, kan het mogelijk zijn om nog dikkere delen te gebruiken.

3. validering van nieuw ontworpen sondes

Opmerking: Het volgende protocol voor het valideren van C. albicans probes werd aangepast van Swidsinski et al.¹⁷.

1. Streak C. albicans SC5314 en nauw verwante comparator soorten (bijv. Candida dubliniensis, Candida tropicalis) aan yepd + 2% agar platen. Incuberen gedurende 1 − 2 dagen bij 30 °C.
2. Inoculeren 5 mL vloeibaar YEPD medium met een enkele kolonie.
3. Pipetteer 1 mL van de hangende cellen in een micro centrifugebuis en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 min. Gooi supernatant weg.
4. Respendeer de pellet in 100 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
5. Pipetteer 5 − 10 μL van geresuspendeerde cellen en spot op een glazen glijbaan. Verspreid in een grotere cirkel en laat drogen.
   Opmerking: Als cellen niet zijn aanhandig, gebruik poly-L-lysine gecoate dia's.
6. Omcirkel de celspot met een PAP-pen en dek af met 50 μL 2,5% Paraformaldehyde (PFA) in PBS. Incuberen bij RT gedurende 10 min.
   Let op: PFA is ontvlambaar en kan gezondheidsproblemen veroorzaken bij inademing of contact met de huid. Artikelen die met PFA zijn verontreinigd, moeten als gevaarlijk afval worden weggegooid.
7. Was 3x met PBS. Tik op vloeistof uit op een papieren handdoek en dek af met 100 μL PBS. Herhaal dit twee keer. Gooi de laatste wasbeurt weg.
8. Dia's voorbereiden voor meerdaagse opslag. Als u vis op dezelfde dag uitvoert, gaat u verder met stap 3,9 zonder de stappen in deze sectie.
   Opmerking: het verdient de voorkeur om de hybridisatie onmiddellijk uit te voeren, maar als kort op tijd Volg stap 3,8 voordat u opslaat. Dia's kunnen meerdere dagen op 4 °C worden bewaard.
   1. Bedek de spot met 60% ethanol. Incuberen bij RT gedurende 3 min. Gooi de oplossing weg.
   2. Bedek de spot met 80% ethanol. Incuberen bij RT gedurende 3 min. Gooi de oplossing weg.
   3. Bedek de spot met 100% ethanol. Incuberen bij RT gedurende 3 min. Gooi de oplossing weg. Ga verder naar stap 3,9.
9. Plaats de lantaarnplaten afgedekt in een hybridisatie oven bij 50 °C gedurende 1 uur. Als stap 3,8 werd opgevolgd, bewaar de dia's op 4 °C. Zo niet, ga dan naar stap 4,2 om het hybridisatie-protocol uit te voeren.

4. vis Skleuring in GI Tract weefsels

1. Dewax paraffine-ingesloten histologische secties.
   1. In een hybridisatie oven preverwarm een Coplin jar gevuld met xyleen tot 60 °C.
   2. Plaats de glaasjes in de pot met xylene. Plaats bij 60 °c gedurende 10 min. Gooi de xyleen Wash weg. Bewaar de glaasjes in de pot en giet de xyleen in een afvalbak.
   3. Giet de verse RT xyleen in de pot en inincuberen bij 60 °C gedurende 10 min. Gooi de tweede xyleen was weg.
   4. Vul de pot met 100% ethanol en inincuberen bij RT gedurende 5 min. Verwijder de glaasjes uit de pot en de lucht drogen.
   5. Stel de hybridisatie oven in op 50 °C voor stappen in paragraaf 4,2.
2. Vlek C. albicans met de vissonde.
   1. Bereid 1 mL verse hybridisatieoplossing (20 mM tris – HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS], 1% formamide in RNase-vrij water). Zie tabel 1 voor voorbeeld berekeningen.
   2. Meng samen 50 μL hybridisatieoplossing met 1 μL C. albicans sonde (5 ' CY3-ACAGCAGAAGCCGTGCC 3 '; 50 μg/ml in RNase-vrij water) voor een laatste sonde van 0,5 μg per dia.
      Opmerking: Veel laboratorium-gefokte muizen bevatten geen schimmels onder hun microbiota. In dit geval is het mogelijk om een pan-schimmel sonde (5 ' Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3 ') te vervangen die 23S rRNA van de meeste schimmelsoorten herkent, niet alleen C. albicans. In de ervaring van de auteurs levert de panschimmel sonde helderdere kleuring dan de C. albicans-specifieke sonde.
   3. Bescherm de oplossing tegen licht en prewarm tot 50 °C.
   4. Teken met een PAP-pen een cirkel rond de weefsel sectie van punt 4,1.
   5. Pipetteer 50 μL sonde-bevattende hybridisatieoplossing op het vaste weefsel en verdeel zachtjes over de weefsel sectie met een pipetpunt. Overlay de vloeistof met een hybridisatie afdek waardoor bellen te voorkomen.
   6. DICHTING schuift in een waterdichte hybridisatie kamer en inbroed de delen gedurende 3 uur bij 50 °C in het donker in een hybridisatie oven.
   7. Bereid ondertussen 50 mL VISWASOPLOSSING (20 mM tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl in RNase-vrij water). Zie tabel 1 voor voorbeeld berekeningen.
   8. Breng de wasoplossing naar 50 °C om te prewarmen.
   9. Voeg na 3 uur de wasoplossing toe aan een Coplin potje. Verwijder vervolgens voorzichtig de Afdeklijst van de glijbaan met de Tang en plaats de glijbaan in de wasoplossing.
   10. Bedek de pot met aluminiumfolie en inincuberen bij 50 °C gedurende 20 minuten.
   11. Bereid tijdens deze incubatie de mucin-nuclei-kleurings oplossing (20 ng/ml 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI], 1,6 μg/ml fluoresceïne isothiocyanaat [FITC]-lectin in PBS). Zie tabel 1 voor voorbeeld berekeningen. Voor maag en grote darmen, gebruik FITC-ulex europaeus agglutinines 1 (UEA-1). Voor kleine darmen en Cecum, gebruik een combinatie van FITC-UEA-1 en FITC-tarwekiemen agglutinines (WGA).
       Opmerking: Lectines van verschillende soorten herkennen verschillende suiker modificaties van glycoproteïnen zoals mucine. De hier aanbevolen lectine combinaties werden empirisch bepaald voor optimale kleuring van slijm in verschillende GI compartimenten.
   12. Was de glijbanen door de VISWASOPLOSSING af te gieten en de pot opnieuw te vullen met RT PBS. Giet de PBS onmiddellijk af en vul aan met PBS. Giet de PBS af voor in totaal 2 wases.
   13. Weg de PBS met een delicate taak ruitenwisser weefsel en cirkel de intestinale weefsel sectie met een PAP pen. Plaats de dia's in een ondoorzichtige plastic container en voeg 50 μL mucin-nuclei-kleurings oplossing toe aan de weefsel sectie. Bedek de container met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht. Inincuberen bij 4 °C gedurende 45 min.
   14. Plaats de dia's in een Coplin jar en was snel tweemaal in PBS bij RT.
   15. Tik op een papieren handdoek op de overtollige PBS en geef de laatste druppels PBS met een tissue weg.
   16. Plaats één druppel afdekmedium op elke sectie en overlay met een glazen dekglaasje, voorkomt bubbels. Laat het afdekmedium zich onder de gehele Afdeklijst verspreiden. Voor onmiddellijke beeldvorming anker je de dekslip op zijn plaats met nagellak op de hoeken. Voor lange termijn opslag, afdichting rond de dekslip met nagellak.
   17. Afbeelding van de dia's met behulp van een fluorescerende Microscoop.

Resultaten

Volgens de instructies, zal de uitkomst van deze techniek fluorescerende etikettering van kernen in het gastheer epitheel, slijm, en C. albicans in gesectioneerde GI weefsels. Wild type Candida albicans cellen moeten verschijnen als ronde, unicellulaire gistcellen of zeer langwerpig, soms vertakkingen, multicellulaire schimmeldraden (celceldeling zal niet duidelijk zijn in de schimmeldraden). Mutanten van C. albicans kunnen bovendien verschijnen als kleinere, licht langwerpige "grijze" gisten of als grotere, licht langwerpige "darm" (gastro-intestinale geïnduceerde overgang) of "ondoorzichtige" gisten.

Figuur 1 toont de voeder naald die wordt gebruikt voor orale maagsonde, evenals belangrijke posities van de naald tijdens de maagsonde procedure. Figuur 2 biedt een typische setup die wordt gebruikt voor orgel dissectie en het uiterlijk van GI-segmenten van de muis.

Figuur 3 toont de vis kleuring van verschillende C. albicans celtypen na vermeerdering in vitro en binnen het muismodel. Figuur 3A toont fluorescentie-en fase beelden van vaste, permeabilized, in vitro-gepropageerde Hyphae. Hypha vorming werd geïnduceerd met vloeibare Lee's medium¹⁸ met 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8 bij 37 °c. Figuur 3B toont fluorescentie-en fase beelden van vaste, permeabilized, in vitro gepropageerde gistcellen. Figuur 3C, D toont vaste, permeabilized, in vitro-gepropageerde darmcellen en ondoorzichtige cellen, respectievelijk. DARMEN en ondoorzichtige celtypen zijn morfologisch niet te onderscheiden, behalve wanneer gevisualiseerd door het scannen van elektronenmicroscopie. Houd er rekening mee dat vis kleuring van in vitro gepropageerde cellen suboptimaal zal zijn als de cellen niet goed doordoorlatiseerd zijn. Een voorbeeld van zwakke en diffuse kleuring wordt weergegeven in Figuur 3C. Voor de beste resultaten moeten de celfixatie-en permeabilization condities empirisch worden bepaald voor elk celtype en elke soort die moet worden onderzocht. Gelukkig produceert het aanbevolen protocol voor het visualiseren van C. albicans in gesectioneerde weefsels een consistentere permeisatie.

Figuur 3e-G verbeelden C. albicans in muis grote darmen, gekleurd met de C. albicans-specifieke sonde (Figuur 3E) of de panschimmel sonde (Figuur 3F, G). C. albicans lijkt rood in deze afbeeldingen, host celkernen zijn blauw, en de slijm-laag is groen. Zowel ronde gisten als zeer langwerpige schimmeldraden (witte pijlpunten) komen voor in de dikke darm. Houd er rekening mee dat kleuring helderder is met de panschimmel sonde. Figuur 3G toont een ume6 mutant in hetzelfde compartiment, gekleurd met de panfungale probe. ume6 codeert een transcriptiefactor die nodig is voor hypha vorming onder in vitro condities¹⁹ . Interessant is dat het gist-Locked fenotype dat door deze Mutant onder in vitro omstandigheden wordt weergegeven, niet in de darm wordt gerecapitculeerd, wat suggereert dat een redundante factor moet worden geactiveerd binnen de host¹². Figuur 4 toont de verschijning van wild type C. albicans in verschillende segmenten van de Murine GI tractus, met inbegrip van de regio's direct grenzend aan de gastheer mucosa en meer centrale gebieden van de darm lumen.

Figuur 1: belangrijke toevoer naaldposities tijdens de maagsonde. A) toevoer naald. B) het voeden van de naald kogel die aan de zijkant van de tong wordt ingebracht. C) toevoer naald in de rechtopstaande positie met inbrengen in de slokdarm. (D) toevoer naald ingebracht in de maag met enkele millimeter zichtbaar boven de neus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Afbeelding 2: voorbeeld dissectie layout. A) dissectie-pad en gereedschap. B) de GI-darmkanaal is weggesneden. Proximale (slokdarm) tot distale (anus) secties: I. maag. II. proximale dunne darmen. III. mediale dunne darmen. IV. distale dunne darmen. V. Cecum. VI. dikke darm. Roze onderbroken rand vakken geven de te fixen weefsels aan. C) weefsels die in cassettes zijn geplaatst. Romeinse cijfers zijn hetzelfde als in panel B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: representatieve beelden van vis-gebeitst c. albicans. a) visvan c. albicans schimmeldraden geteeld in vloeibare lee's media¹⁸ met 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8. B) vis van C. albicans ronde gistcellen geteeld op yepd + 2% agar-platen. C) vis van C. albicans gut Cells (ySN1045), geteeld op yepd + 2% agar-platen. D) vis van C. albicans ondoorzichtige cellen geteeld op yepd + 2% agar-platen. E) wild type C. albicans (ySN250) in grote darmen, gekleurd met de C. albicans-specifieke sonde. F) wild type C. albicans in dikke darmen, gekleurd met de panschimmel sonde. (G) Ume6 Mutant (ySN1479) in dikke darmen, gekleurd met de panfungale Probe: rood is C. albicans, blauw is gastheer epitheel kernen, en groen is mucin. Pijlpunten geven Hyphae aan. Pijlen geven gist aan. Schaal staven = 20 μm. afbeeldingen F en G zijn aangepast van Witchley et al.¹². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: verschijning van vis-gebeitst C. albicans in verschillende gut compartimenten. Wild type C. albicans wordt weergegeven in de aangegeven segmenten van de muis GI tractus. Binnen elk compartiment, beelden verbeelden het gebied grenzend aan de gastheer mucosa en de centrale regio van de darm lumen. Kleuring werd uitgevoerd met de panfungale probe. Schaalbalk = 20 μm. afbeeldingen zijn aangepast van Witchley et al.¹². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Antibiotica bestanden (200x)
Penicillaire G	181 mg/mL
Streptomycine	400 mg/μL
Methacarn
Voorraad	Eindconcentratie	Volume	Eenheden
Methanol	60%	300	Ml
Chloroform	30	150	Ml
Ijsazijn	10	50	Ml
Hybridisatieoplossing
Voorraad	Eindconcentratie	Volume	Eenheden
1 M Tris-HCl, pH 7,4	20 mM	20	μL
5 M NaCl	0,9 M	180	μL
10% SDS	0,10%	10	μL
100% formamide	1,00%	10	μL (in kleine aliquots bij-20 °C tussen toepassingen)
RNase-vrij water		780	μL
Oplossing voor het wassen van vis
1 M Tris-HCl, pH 7,4	20 mM	1	Ml
5 M NaCl	0,9 M	9	Ml
RNase-vrij water		40	Ml
Mucin-nuclei-kleurings oplossing
DAPI, 10 μg/mL	20 ng/mL	2	μL
Lectine, 40 μg/mL	1,6 μg/mL	40	μL
PBS, pH 7,4		958	μL

Tabel 1: typische volumes en concentraties van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

Discussie

De hier beschreven methode maakt visualisatie van C. albicans gisten en schimmeldraden in de GI Tracts van commensally gekoloniseerd muizen van elk geslacht of stam. De vissen sonde hybridizes tot 23S rRNA, die wordt verspreid over het gehele schimmel cytoplasma. Onze methode werd aangepast van een eerder gerapporteerd protocol voor het visualiseren van darmbacteriën²⁰. Omdat C. albicans zijn morfologie binnen de gastheer verandert, is de methode nuttig om schimmel celvorm en lokalisatie te bewaken. We hebben deze methode bijvoorbeeld gebruikt om de hypothese te ontzien dat gisten het hele spijsverteringskanaal domineren, en om discrepanties bloot te leggen tussen de in vivo en in vitro fenotypes van bepaalde "filamentatie-defecte" mutanten¹².

Er bestaan verschillende Muismodellen voor C. albicans commensale kolonisatie. De microbiota van laboratorium muizen en-mensen is verschillend en bij muizen is het gebruik van antibiotica of een gespecialiseerd dieet nodig om een stabiele kolonisatie te bewerkstelligen. Behandeling met antibiotica verbetert ook C. albicans kolonisatie van de mens en is een belangrijke risicofactor voor verspreide ziekte¹⁰. De antibiotica gebruikt in deze studie zijn relatief goedkoop en rendement betrouwbare dalingen in de bacteriële microbiota. Merk op dat antibiotica worden gebruikt om de last van antagonistische bacteriesoorten te verminderen, niet om alle bacteriën van de dieren te elimineren. Als onderzoekers willen studeren C. albicans-gastheer interacties bij afwezigheid van bacteriën of om het gebruik van antibiotica of een speciaal dieet te voorkomen, kunnen kiemvrije dieren worden vervangen door conventioneel gekweekte dieren; echter, gnotobiotische muizen vertonen bepaalde immuun en anatomische afwijkingen en daarom mogelijk niet geschikt voor alle doeleinden.

Verschillende stappen zijn belangrijk voor succesvolle viskleuring: de aanbevolen fixatie methode is essentieel om de structurele integriteit van GI-weefsels te behouden, met name de fragiele inhoud van het darm lumen, zoals de slijm-laag en de driedimensionale organisatie van schimmels en bacteriën¹⁶. Houd er rekening mee dat veel veelgebruikte fixatie oplossingen die water bevatten, zeer schadelijk zijn voor de luminal-architectuur. De Fixatieven en oplossingen voor na fixatie wast die in dit protocol worden aanbevolen, bevatten geen water en het is belangrijk om verontreiniging met water te voorkomen. Een andere kritieke stap is de hybridisatie stap, waarbij het belangrijk is om verdamping van de hybridisatieoplossing te voorkomen tijdens de incubatie van dia's in de hybridisatie oven. We raden aan om de dia's in een waterdichte container te plaatsen om dit probleem te voorkomen. Als alternatief kan men gebruik maken van waterdichte hybridisatie kamers zoals die oorspronkelijk werden gebruikt voor hybridisatie van micro arrays.

Een C. albicans-specifieke vissonde wordt beschreven in dit protocol. Omdat veel in het laboratorium gehouden muizen echter geen c. albicans of andere schimmels bevatten als onderdeel van hun natuurlijke darm microbiota, kan een panschimmel sonde specifiek c. albicans in experimenteel gekoloniseerde dieren bevlekken. Vervanging van een panschimmel sonde kan wenselijk zijn vanwege de superieure hybridisatie eigenschappen en een hogere signaal-ruis verhouding. Als de panschimmel sonde wordt gebruikt als een pseudo-specifieke sonde voor C. albicans, is het belangrijk om een gebrek aan kleuring te documenteren in niet-geïnfecteerde dieren (d.w.z. behandeld met antibiotica maar niet C. albicans). Kleuring van een niet-gekoloniseerd controle dier is ook nuttig om achtergrondkleuring te beoordelen die kan voortvloeien uit het vasthouden van VISVOELERS aan voedseldeeltjes. Over het algemeen biedt het gebruik van VISVOELERS een verbeterde specificiteit ten opzichte van de meeste andere methoden van kleurings schimmels, zoals Calcofluor White (die chitin vlekken, een celwand component die kan variëren tussen celtypen), GMS of commercieel verkrijgbare schimmelwerende antilichamen. Bovendien maakt VISKLEURING het mogelijk om meerdere organismen te cokleuring met behulp van differentiaal gelabelde visvoelers op soortspecifieke Rrna's.

Een voorbehoud van deze techniek is dat bepaalde C. albicans gist celtypen lijken zeer VERGELIJKBAAR door vis (bijvoorbeeld, de ondoorzichtige en gut celtypen). Om onderscheid te maken tussen deze celtypen, zou het nuttig zijn om hybridisatie voelers te ontwikkelen naar celtypespecifieke schimmel Mrna's. Niettemin heeft de vistechniek in zijn huidige vorm al verrassende verschillen onthuld tussen de in vivo en in vitro gedrag van C. albicans mutanten geëvalueerd onder beide omstandigheden¹², wat duidt op complexe interacties in de natuurlijke commensale omgeving die niet adequaat worden geïmbootst door bestaande in vitro assays. Verdere studies van verschillende C. albicans vlekken in extra wild type en Mutant hosts zijn waarschijnlijk extra inzicht in de interacties van schimmel-host opleveren. In het bijzonder, het zal leerzaam zijn voor profiel c. albicans in modellen van inflammatoire darmziekte, die wordt geassocieerd met hoge Antilichaamtiters van c. albicans bij de mens²¹, en andere modellen van c. albicans overgroei en ziekte. De VISTECHNIEK kan ook worden gecombineerd met immunohistochemie om specifieke hostcellen te vlekken. Over het algemeen biedt de hier gepresenteerde methode een redelijk snel en betrouwbaar middel om de lokalisatie en morfologie van C. albicans in het darmkanaal van zoogdieren te bepalen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL spuit	BD	309659	kan worden vervangen door elke leverancier
BHI bloed agar			kan worden vervangen door elke leverancier
C. albicans FISH probe	IDT DNA Technologies	op bestelling
Kamer voor hybridisatie-incubatie			waterdichte kamer bedoeld om verdamping te verminderen
Chloroform	Sigma	C2432	>=99.5%
DAPI	Roche	10236276001	kan worden vervangen door elke leverancier
Delicate task wiper tissues	Kimberley-Clark	34256CT	Kimwipes
D-glucose	Sigma	G7021-5KG	kan worden vervangen door elke leverancier
Ethanol	Sigma	E7023	moleculaire biologie kwaliteit
Voedingsnaalden	Cadence, Inc.	7910	metaal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; kan worden geautoclaveerd om te steriliseren
FITC-UEA-1	Sigma	L9006-1MG	andere fluoroforen beschikbaar
FITC-WGA	Sigma	L4895-2MG	andere fluoroforen beschikbaar
Schuimkussentjes	Fisher	22038221	Bestel schuimkussentjes die passen in cassettes
Formamide	Sigma	47671	moleculaire biologie kwaliteit
Glazuur azijnzuur	Macron Fine Chemicals	MK881746	ACS reagens, >=99.5%
Glas Coplin pot	Fisher	08-815	houdt tot 10 dia's rug aan rug
Histologie cassettes	Simport	M512	Diepe cassettes zodat cecum niet wordt verpletterd
Hybridisatie dekglasjes	Sigma	GBL712222	RNase-vrij
Hybridisatie oven			kan worden vervangen door elke leverancier
LB			kan worden vervangen door elke leverancier
Lee's media			bereid zoals beschreven in Lee et al. 1975
Methanol	Sigma	179337	ACS reagens, >=99.8%
Muizen	Charles River Laboratories	028	volwassen BALB/c; 18-21 gram (8-10 weken)
Paraformaldehyde	Fisher	50-980-487	16% oplossing
Paraffinewas	Sigma	P3558-1KG	Paraplast voor weefsel inbedding
PBS, pH 7.4	UCSF Cell Culture Facility Media Productie Unit	CCFAL003	calcium, magnesium-vrij; kan worden vervangen door elke leverancier
Penicilline G	Sigma	PENNA-100MU
Sabouraud dextrose agar			kan worden vervangen door elke leverancier
Zoutoplossing	Baxter	2F7123	steriel, kan worden vervangen door elke leverancier
Natriumchloride (NaCl)	Sigma	S3014	kan worden vervangen door elke leverancier; RNase-vrij onderhouden
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma	L3771	kan worden vervangen door elke leverancier; RNase-vrij onderhouden
Streptomycine	Sigma	S9137-100G
Super PAP pen	Life Technologies	8899	kan worden vervangen door elke leverancier
Tris-HCl	Sigma	T3253	kan worden vervangen door elke leverancier; RNase-vrij onderhouden
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	bevat geen DAPI
Xyleen	Sigma	214736	reagenskwaliteit
YEPD			kan worden vervangen door elke leverancier