Methodenartikel

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

DOI:

10.3791/60287

⸱

25 september 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zeer beweeglijke dendritische filopodia zijn op grote schaal aanwezig in neuronen in vroege ontwikkelingsstadia. Deze verkennende dynamische takken proeven de omgeving en initiëren contacten met potentiële synaptische partners. Hoewel de verbinding tussen dendritische tak dynamiek en synaptogenese is goed vastgesteld, hoe ontwikkelings-en activiteitsafhankelijke processen reguleren dendritische tak dynamiek is niet goed begrepen. Dit is deels te wijten aan de technische moeilijkheden in verband met de Live beeldvorming en kwantitatieve analyses van deze fijne constructies met behulp van een in vivo systeem. We hebben een methode opgezet om dendriet-dynamiek te bestuderen met behulp van Drosophila larvale ventrale laterale neuronen (Lnv's), die individueel kunnen worden geëtiketteerd met behulp van genetische benaderingen en toegankelijk zijn voor Live beeldvorming. Door gebruik te maken van dit systeem hebben we protocollen ontwikkeld om de tak dynamiek van de hele dendritische Arbor van één gelabeld LNv te veroveren door middel van time-lapse Live beeldvorming. Vervolgens hebben we nabewerking uitgevoerd om de beeldkwaliteit te verbeteren door middel van drift correctie en deconvolutie, gevolgd door het analyseren van de vertakkings dynamiek op het single-Branch niveau door de ruimtelijke posities van alle filiaal terminals te annoveren. Ten slotte ontwikkelden we R-scripts (aanvullend bestand) en specifieke parameters om de vertakkings dynamiek te kwantificeren met behulp van de coördinaten informatie die wordt gegenereerd door de Terminal tracering. Collectief, dit protocol stelt ons in staat om een gedetailleerde kwantitatieve beschrijving van de tak dynamiek van de neuronale dendritische Arbor met hoge temporele en ruimtelijke resolutie te bereiken. De methoden die we ontwikkelden zijn over het algemeen toepasbaar op dungelabelde neuronen in zowel in vitro als in vivo condities.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendrites zijn gespecialiseerde neuronale compartimenten die ontvangen en verwerken van sensorische en synaptische input. De complexe en stereotiepe structuur van dendritische Arbors is sinds hun ontdekking intensief onderzocht. Een aantal modelsystemen, waaronder Xenopus optische tectale neuronen, Chick retinale ganglioncellen en dendritische arborization (da) neuronen in het Drosophila systeem, zijn opgericht om de ontwikkeling, verbouwing en plasticiteit van neuronale dendrites1,2,3,4. Drosophila ventrale laterale neuronen (Lnv's) zijn een groep visuele projectie neuronen die aanvankelijk werden geïdentificeerd voor hun belangrijke functies in de circadiane regulatie van vlieggedrag5. Studies onthulde ook de rol van larvale lnvs als de directe postsynaptische doelstelling van de larvale fotoreceptoren (PRS)6,7. Belangrijk is dat het kweken van larven in verschillende licht regimes sterk van invloed is op de grootte van Lnv's ' dendritische Arbors, die de geschiktheid van LNvs aantonen als een nieuw model voor het bestuderen van dendritische plasticiteit7. Recent werk van onze groep wijst er verder op dat zowel de grootte van de LNV dendriet als het dynamische gedrag van de dendritische takken ervaring-afhankelijke plasticiteit weergeven8,9. Als onderdeel van dit werk ontwikkelden we een nieuw live beeld-en kwantificerings protocol om analyses uit te voeren over de dendriet-dynamiek van Lnv's van 2ND of 3RD instar larven.

De transparante aard van de hersenen Drosophila larvale maakt het ideaal voor Live beeldvorming. Echter, de dendritische Arbors van lnvs bevinden zich in de dichtbevolkte larvale optische neuropil (LON) in het midden van de larvale hersenen kwab6. Om beelden van fijne dendriet takken en filopodia in het intacte hersenweefsel vast te leggen, gebruiken we twee-photon microscopie, die de diepte van licht penetratie verhoogt en de fototoxiciteit vermindert tijdens Live Imaging experimenten10. Met behulp van deze instellingen hebben we met succes Live Imaging experimenten uitgevoerd op Lnv's voor meer dan 30 minuten zonder de duidelijke morfologische verslechtering van het neuron te observeren. Bovendien hebben genetische manipulaties met behulp van de flip-out techniek ons in staat om de individuele lnv's te labelen met een membraan gelabeld GFP, dat ook cruciaal is voor het bewaken van de bewegingen van individuele takken11,12,13 .

Om het dynamische gedrag van alle takken op de LNv dendritische Arbor met optimale optische resolutie vast te leggen, hebben we time-lapse 3D-beeldvorming uitgevoerd op vers ontleed larvale hersen explanten met een hoge ruimtelijke resolutie op 1 min per frame voor 10 tot 30 min. ontwikkelen van LNv dendrites zijn zeer dynamisch, met een groot percentage van de takken weergegeven waarneembare veranderingen binnen de 10 min venster. Dit leidt tot een van de belangrijkste technische uitdagingen bij het bestuderen van dendriet-dynamiek, het kwantificeren van vertakkings gedrag op basis van de 4D-beeldgegevens sets. Eerder vastgestelde methoden hebben verschillende beperkingen, waaronder gebrek aan nauwkeurigheid en buitensporige tijd vereiste. Daarom hebben we een semi-automatische methode ontwikkeld die de nabewerking van afbeeldingen, handmatige markering van de aftakkingen van de filialen en automatische 4D-spot tracering met behulp van een afbeelding aantekening software combineert. We berekenen de bewegingen van de filialen op verschillende tijdstippen op basis van de 3D-coördinaten van de spots. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd en geanalyseerd om kwantitatieve metingen van de vertakkings dynamiek te produceren. Deze methode beoordeelt nauwkeurig de duur en omvang van de uitbreiding en terugtrekking gebeurtenissen van bestaande takken, evenals de vorming van nieuwe takken, waardoor we de dendriet dynamiek in een groot aantal neuronen bewaken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Let op: Dit protocol heeft betrekking op het gebruik van klasse IV-lasers en vereist goede opleidings-en veiligheidsrichtlijnen die moeten worden nageleefd. Vermijd blootstelling van ogen of huid aan direct of verstrooid laserlicht.
Opmerking: Het protocol bevat zes stappen. De werkstroom wordt weergegeven in afbeelding 1A.

1. labelen van individuele neuronen met behulp van de flip-out techniek

Opmerking: De enkele labeling van Lnv's wordt bereikt door het uitdrukken van mCD8:: GFP in enkele Lnv's met behulp van flippase-gemedieerde stochastische labeling. Het genotype van de vlieglijn is: HS-FLP; PDF-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8:: GFP11,12,13. De frequentie van het verkrijgen van één gelabeld LNv is ongeveer 10%. Vlieg voorraden worden gehandhaafd in standaard medium in circadiane-en vochtigheids-gecontroleerde 25 ° c incubators.

  1. Verzamel 100-200 eieren binnen een venster van 2 uur na de bevruchting op een druivensap plaat met gist supplement. Inbroed de embryo's bij 25 °C gedurende 24 uur en verzamel nieuw uitgekomen eerste instar larven voor de volgende stap.
  2. Hitteschok de nieuw uitgekomen eerste instar larven bij 37,5 °C gedurende 40 min twee keer, met een herstelperiode van 40 min daartussenin.
  3. Kweek de larven bij 25 °C met circadiane en vochtigheidscontrole op de gewenste ontwikkelingsfase (en).

2. ontleden en monteren van larvale hersen Explants

  1. Dissect larvale hersenen in de fysiologische externe zoutoplossing (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 3 mm KCl, 10 mm NaHCO3, 10 mM glucose, 10 mM SUCROSE, 5 mM tes, 10 mm Hepes, 2 mm ca2 +, pH 7,2) onder een dissectie Microscoop (4.5 x vergroting met twee paar #5 standaardtip dissectie Tang (11 cm). Gebruik één paar tang om het larvale lichaam op zijn plaats te houden en de andere om de hersenen voorzichtig te ontleden. Bewaar de oogschijven, hersen lobben en het ventrale zenuw snoer. Verwijder bijgevoegde spieren om monster bewegingen tijdens beeldvorming te minimaliseren.
  2. Maak een glazen glijbaan (25 x 75 x 1,0 mm3) en gebruik een spuit om een vierkante kamer te tekenen met vacuüm vet.
  3. Voeg 20 μL externe zoutoplossing toe aan de vierkante kamer met vetbarrières.
  4. Overdracht ontleed larvale hersenen in de kamer op de glazen dia met behulp van de Tang. Pas de positie van de hersenen onder het dissectie bereik aan om ervoor te zorgen dat de rugzijde omhoog kijkt.
  5. Bedek de kamer met een glazen afdekplaat (22 x 22 x 0,15 mm3). De larvale hersenen zijn nu gemonteerd op de glijbaan in een kamer gevuld met de externe zoutoplossing (Figuur 1B).
    Opmerking: Zachtjes op de dekslip drukken beperkt de hersenen en vermindert de monster drift in de daaropvolgende beeldvormings sessie.

3. time-lapse Live beeldvorming

Opmerking: We voeren time-lapse Imaging-experimenten uit met een confocale Microscoop die is uitgerust met een multiphoton-laser. De overname parameters moeten worden aangepast voor andere beeldvormings instellingen.

  1. Identificeer hersen explanten met individueel gelabelde neuronen met behulp van een 40X water onderdompeling doel (NA 1,3) en een epifluorescerende lichtbron. Gebruik voor het verzamelen van afbeeldingen een twee-foton laser die is afgestemd op 920 nm en een niet-gedescande (NDD) detector.
  2. Verzamel beelden op 512 x 512 pixels per frame en 1 min per Z-stack gedurende 10 min. Pas de optische en digitale zoom aan om een voldoende x-y-Z-resolutie te bereiken, terwijl de dekking van het hele dendritische prieel binnen 1 minuut wordt verzekerd (afbeelding 2, aanvullende video 1). de instellingen genereren beelden met een typische x-y-z resolutie van 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3.
  3. Verzamel de timelapse-beelden reeks binnen 30 minuten van de hersen dissectie. Gegevens met overmatige drift of duidelijke morfologische achteruitgang moeten worden uitgesloten van nabewerking en kwantificering.

4. drift correctie en deconvolutie

Opmerking: Afhankelijk van de beeldkwaliteit zijn beide stappen optioneel, maar sterk aanbevolen.

  1. Open een overgenomen afbeeldingsbestand met een drift correctie software. Bewerk microscopische parameters die worden gebruikt voor het experiment. Voor de software (Zie tabel met materialen) klikt u op bewerken | Bewerk microscopische parameters. Stel Microscoop type in als Widefield voor twee-photon-afbeeldingen als er geen twee-photon-optie is en volg de werkstroom die door de software is gedefinieerd. Open bijvoorbeeld het tabblad Deconvolution | Object stabilisatoren kies tijdframes stabiliseren.
  2. Open de door drift gecorrigeerde afbeelding in de deconvolutie-software en volg de workflow. Voor de software (Zie tabel met materialen), selecteer de gestabiliseerde afbeelding en klik vervolgens op Deconvolution | Deconvolution Express. Om een beter resultaat te krijgen, u de parameters verfijnen met de wizard Deconvolution.
  3. Sla de deconvolved afbeelding op in een bestandstype dat wordt ondersteund door de daaropvolgende afbeelding aantekening software die in staat is om 4D-gegevens te analyseren en de ruimtelijke coördinaten van gedefinieerde vlekken in de afbeelding te rapporteren (Zie tabel met materialen).

5. aantekening bij afbeelding

  1. Open de deconvolved afbeelding in de afbeelding aantekening software. Bekijk en markeer de vertakkings tips op alle tijdstippen in 3D. De afbeelding aantekening software rapporteert en slaat de ruimtelijke en tijdelijke coördinaten van de gemarkeerde vertakking tips. Exporteer de coördinaten gegevens als CSV-bestand voor volgende berekeningen.
    Opmerking: De volgende twee stappen zijn specifiek voor de aantekening software die we hebben gebruikt (Zie tabel met materialen). De werkstroom kan afwijken voor andere software.
  2. Klik binnen de module spots op "automatisch maken overslaan, handmatig bewerken" en vink het vakje "automatisch verbinden met geselecteerde plek" aan (afbeelding 3A). Ga over de frames in de tijdreeks en selecteer een vertakking voor aantekening. Houd de Shift-toets ingedrukt en klik op de punt van de filiaal terminal om een plek toe te voegen. Klik op alle tijdpunten.
    Opmerking: De afbeelding aantekening software verbindt de vlekken tussen frames en genereert een traject automatisch. De ruimtelijke en temporele informatie van de vertakkings tips is nu gekoppeld aan gemarkeerde vlekken. Herhaal deze stappen totdat alle vertakkings tips zijn geannoleerd (Figuur 3B).
  3. Klik in de module spots op het tabblad Statistieken , kies gedetailleerd en selecteer specifieke waarden | Positie. De geregistreerde informatie over ruimtelijke en temporele coördinaten wordt weergegeven. Klik op de onderkant Opslaan om die informatie te exporteren als een CSV-bestand (afbeelding 3C).

6. berekening van de dendritische tak dynamiek

Opmerking: Met behulp van de coördinaten informatie kan de verplaatsing van de vertakkings tips in 3D eenvoudig worden berekend. In onze studie zijn alle dendritische vertakkings bewegingen gecategoriseerd als uitbreiding of terugtrekking. In de onderstaande stappen wordt beschreven hoe u de CSV-bestanden verwerkt met aangepaste geschreven R-scripts (aanvullend bestand) en door de richtings informatie toe te voegen via handmatige bewerking.

  1. Open het CSV-bestand als een werkblad. Selecteer de kolom track-id , klik op de optie kleinste tot grootste sorteren en accepteer de selectie uitvouwen. Na het sorteren identificeert de track-ID elke unieke dendritische vertakking en plaatsen uit dezelfde vertakking delen dezelfde track-ID. In de tijd kolom worden de gegevens van verschillende tijdsperioden opgeslagen.
  2. Voeg in het werkblad een afstands kolom toe. Bereken de afstand van elke twee tijdelijk aangrenzende plekken met behulp van hun coördinaten en plaats de waarden in de afstand kolom (Figuur 4A).
  3. Kleine bewegingen op de enkele Voxel-niveau. Op basis van de Imaging-instellingen zijn 0,3 μm meestal artefacten van niet-gecorrigeerde drifting of onvolmaakte beeld aantekening. Filter deze bewegingen op door alle afstand waarden te resetten die kleiner zijn dan 0,3 μm tot 0. Meerdere CSV-bestanden handmatig verwerken of gebruik onze R script batch kolom filtering. R (aanvullend dossier).
  4. Genereer handmatig een nieuwe kolom met de naam verplaatsing in het werkblad. Kopieer de waarden van de afstand kolom naar de verschuivings kolom. Handmatig toewijzen van de extensie en intrekking gebeurtenissen voor elke vertakking tip. Als het een extensie is, laat u de verplaatsings waarde ongewijzigd, wat een positieve waarde is. Als het een intrekking is, wijzigt u de corresponderende verplaatsings waarde in een negatieve waarde (bijvoorbeeld 0,35 tot-0,35) (Figuur 4B).
  5. Genereer een nieuwe kolom met de naam Event. In deze kolom worden de verplaatsings waarden voor afzonderlijke uitbreidings-en terugtrek gebeurtenissen handmatig opgeteld (Figuur 4B).
  6. De gewijzigde spreadsheet verwerken en de extensie-en terugtrek gebeurtenissen kwantificeren op basis van hun verplaatsingswaarden met behulp van de R-script batch kolom sum. R (aanvullend dossier). De uitvoerparameters omvatten het aantal uitbreidings gebeurtenissen, het aantal retractie gebeurtenissen, de cumulatieve lengte verlengd, de cumulatieve lengte ingetrokken, de netto lengte gewijzigden de totale afgelegde lengte .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het hierboven beschreven Live Imaging protocol, leggen we een hoge resolutie beeld stapels vast voor de daaropvolgende analyses en kwantificering. Aanvullende video 1 toont de reeks met maximale intensiteit geprojecteerd (MIP) die is verzameld van een vertegenwoordiger afzonderlijk gelabeld LNV. afbeelding 2B toont de corresponderende montage van acht frames van de beeld reeks. In beide deelvensters markeren pi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol dat we hebben ontwikkeld om het dynamische gedrag van dendritische takken in individueel gelabelde neuronen in Drosophila larvale hersenen op te nemen en te kwantificeren. Met name ons Live Imaging protocol bevat specifieke parameters die ons in staat stellen om het hele dendritische prieel van een larvale LNV vast te leggen en een globaal beeld te bieden van de dynamische toestand van haar dendriet takken. Omdat onze kwantificeringsmethoden echter sterk afhankelijk zijn van de a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte, National Institutes of Health. Project nummer 1ZIANS003137.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chameleon Vision II multiphoton laserCoherent
High vacuum greaseDow Corning79751-30
LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscopeCarl Zeissupright configuration
Microscope Cover GlassFisher Scientific12-544-E
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Software
ExcelMicrosoftvoor het verwerken van.csv bestanden
Huygens ProfessionalScientific Volume Imagingvoor driftcorrectie en deconvolutie
ImarisOxford Instrumentsvoor 3D visualisatie en beeldannotatie
Reagentia
Glucose
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sucrose
TES

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
  2. Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
  3. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316(2010).
  4. Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
  5. Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
  6. Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
  7. Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
  8. Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362(2018).
  9. Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
  10. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  12. Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
  13. del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47(2011).
  14. Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
  15. Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
  16. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  17. Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
  18. Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387(2017).
  19. Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66(2013).
  20. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
  21. Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila NeuronsDendritic Branch DynamicsTime lapse Live ImagingDrift CorrectionDeconvolutionImage AnnotationBranch Tip TrackingR ScriptsVentral Lateral Neurons4D Data Analysis

Gerelateerde artikelen