Methodenartikel

Betrouwbare isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel in vijf gewervelde groepen

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 januari 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is het isoleren van micro vaartuigen uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel van lissencefische en gyrencephalic vertebraten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatie van micro vaten van het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt vaak uitgevoerd door het combineren van corticale weefsel van meerdere dieren, meestal knaagdieren. Deze aanpak beperkt de ondervraging van bloed-hersen barrière (BBB) eigenschappen tot de cortex en staat niet toe voor individuele vergelijking. Dit project richt zich op de ontwikkeling van een isolatiemethode die het mogelijk maakt voor de vergelijking van de neurovasculaire eenheid (NVU) uit meerdere gebieden van de CNS: cortex, cerebellum, Optic kwbe, hypothalamus, hypofyse, hersenstam, en ruggenmerg. Bovendien, dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld voor Murine monsters, werd met succes aangepast voor gebruik op CNS weefsels van kleine en grote gewervelde soorten waaruit we ook in staat zijn om micro vaten te isoleren van hersen halfrond witte materie. Deze methode, wanneer gekoppeld met immunolabeling, maakt kwantificering van eiwit expressie en statistische vergelijking tussen individuen, weefseltype of behandeling mogelijk. We bewees deze toepasbaarheid door veranderingen in de eiwit expressie te evalueren tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), een muriene model van een neuroinflammatoire ziekte, multiple sclerose. Bovendien kunnen micro tanks die door deze methode worden geïsoleerd, onder andere worden gebruikt voor downstreamtoepassingen zoals qPCR, RNA-SEQ en Western Blot. Hoewel dit niet de eerste poging is om CZS-micro vaartuigen te isoleren zonder het gebruik van ultracentrifugatie of enzymatische dissociatie, is het uniek in zijn bedrevenheid voor de vergelijking van individuele personen en meerdere CZS-regio's. Daarom is het mogelijk voor onderzoek van een aantal verschillen die anders mogelijk onduidelijk blijven: CNS porties (cortex, cerebellum, optiek kwabben, hersenstam, hypothalamus, hypofyse, en ruggenmerg), CNS weefseltype (grijze of witte stof), individuen, experimentele behandelingsgroepen en soorten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons brein is het belangrijkste orgaan in ons lichaam. Om deze reden, houden van de hersenen homeostase ondanks externe factoren die een afwijking van normaliteit kan leiden is een prioriteit. Volgens sommige geleerden, ongeveer 400 – 500 miljoen jaar geleden1, gewervelde dieren ontwikkeld wat we nu kennen als de bloed-hersen barrière (BBB)2,3. Deze beschermende "hek" oefent de grootste invloed op homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS) en functies door het transport van ionen, moleculen en cellen tussen bloed en CNS parenchym strak te reguleren. Wanneer de BBB wordt verstoord, de hersenen wordt vatbaar voor toxische blootstelling, infectie, en ontsteking. Daarom, BBB dysfunctie wordt geassocieerd met vele, zo niet alle, neurologische en neurodevelopmental aandoeningen4,5,6.

De verfijnde functie van de BBB wordt toegeschreven aan de unieke CNS Microvasculatuur aan normen voldoende door de neurovasculaire eenheid (NVU)2,3. Zeer gespecialiseerde endotheliale cellen, pericytes en astrocytische eind voeten zijn de cellulaire componenten van de nvu2,3. De extracellulaire matrix gegenereerd door deze cellen is ook essentieel voor de nvu en BBB fysiologie2,3. Hoewel essentiële cellulaire en moleculaire componenten van de nvu onder gewervelde dieren worden bewaard, wordt heterogeniteit gerapporteerd bij orders en soorten7,8. Technische beperkingen belemmeren echter ons vermogen om deze verschillen in neurobiologie, biomedisch of translationeel onderzoek volledig te overwegen.

Daarom hebben we een regiospecifieke microvessel-isolatiemethode voor het CZS uitgebreid om het toepasbaar te maken op tal van soorten uit alle vijf gewervelde groepen: vissen, amfibieën, reptielen, vogels en zoogdieren. Het protocol wordt beschreven voor gebruik op kleine lissencefale en groot-gyrencephalic Vertebraten, met inbegrip van soorten met translationele relevantie9. Bovendien, we nemen andere regio's van het CZS niet eerder onderzocht in deze context, maar relevant voor neurofysiologie en met enorme klinische implicaties: de hypothalamus, hypofyse, en witte materie. Tot slot testten we de capaciteit van deze isolatiemethode als een betrouwbaar hulpmiddel om veranderingen in eiwit expressie langs de nvu en/of BBB9,10,11te identificeren. Als proof-of-concept hebben we laten zien hoe veranderingen in VCAM-1 en JAM-B-expressie tijdens EAE kunnen worden vastgesteld met behulp van de isolatiemethode gevolgd door immunofluorescentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures van de huidige studie zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Universiteit van Californië (UC), Davis institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC). Animal Care bij UC Davis wordt gereguleerd door verschillende onafhankelijke bronnen en is volledig geaccrediteerd door de vereniging voor beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC) sinds 1966. De weefsels van varkens CNS werden verkregen van het UCD-departement van Dierwetenschappen, het laboratorium voor vlees wetenschappen. CNS weefsels van rhesus makaken werden verkregen van de California National Primate Research Center pathologie Department (NIH P51OD011107). Er werd geen verdoving, euthanasie of obductie uitgevoerd door laboratoriummedewerkers op varkens en makachtigen. Daarom zijn er geen specifieke aanbevelingen met betrekking tot deze kwesties.

Opmerking: deze methode is gevalideerd voor meerdere soorten, maar het opgegeven protocol komt meer rechtstreeks overeen met muizen en varkens weefsels. Details met betrekking tot de optiek kwab zijn niet van toepassing bij gebruik van zoogdier monsters. Alle biogevaarlijke materialen moeten worden behandeld in een passende faciliteit voor bioveiligheidsniveau (BSL). Alle acuut giftige materialen moeten worden behandeld onder een rook afzuigkap. Alle biologisch gevaarlijke medische afvalstoffen en acuut giftig afval moeten naar behoren worden afgevoerd.

1. voorbereiding

  1. Bereid oplossingen (tabel 1) ten minste één dag vooruit.
    Opmerking: het is zeer moeilijk om 70 kDa molecuulgewicht (MW) dextran op te lossen. Het is efficiënter om de oplossing 's nachts te laten roeren met een paraffine film of folie. Het protocol vereist het gebruik van twee verschillende MV-2-oplossingen, afhankelijk van het onderzochte model. De 18% dextran scheidt de myeline efficiënt van de microvat pellet bij het uitvoeren van het protocol op kleine lissencefische specimens. Echter, het ontwikkelt een uitstrijkje van myeline binnen de interface van CNS weefsels van grote gyrencephalic specimens, evenals de hypothalamus en de hypofyse uit kleine specimens. Dit uitstrijkje wordt voorkomen door 20% dextran te gebruiken.
  2. Maak goed dia's door het laden van 50 μL per put van poly-D-Lysine en laat drogen voor 2 h bij kamertemperatuur (RT), bij voorkeur in een biologische veiligheidskast-klasse 2 (BSC-2). Niet overdrogen. Spoel tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar in de koelkast tot het klaar is voor gebruik.

2. CNS weefsel dissectie van kleine Lissencephalic gewervelde specimen

Opmerking: het artikel toont de toepassing van het protocol op een C57BL6/J, 10 week-oud, ~ 25 g, mannelijke muis.

  1. Bereid de conische buizen van 2 15 mL en een micro centrifugebuis van 1,7 mL met respectievelijk 5 mL en 1 mL van de MV-1 oplossing per preparaat. Houd tubes op ijs.
  2. Esthetisering
    1. Anesthetize muizen door intraperitoneale injectie van een ketamine, xylazine, en Acepromazine anestheticum cocktail op 100/10/3 mg per kg lichaamsgewicht en spray met 70% ethanol. Bevestig anesthesie door de afwezigheid van palpebrale en pedaal reflexen te beoordelen door het aanraken van een oog en het knijpen van een voet, respectievelijk.
    2. Anesthetize duiven door inademing van 5% Isofluraan met behulp van een inductie anesthesie doos.
    3. Anesthetiseren vis en kikkers in 1% tricaïne in ofwel een vis houden watertank of amfian Ringer-oplossing (tabel van materialen), respectievelijk.
    4. Anesthetiseer hagedissen door te koelen bij 4 °C voorafgaand aan euthanasie.
  3. Onthooi het dier met een chirurgische schaar, Pel de huid weg met een tang om de schedel bloot te leggen en snijd met LaGrange-schaar door het foramen magnum (Figuur 1A).
  4. Dissteer de hersenen uit met een spatel en breng over naar een conische buis van 15 mL met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.
  5. Haal de hypofyse uit de Sella turcica van de schedel met een tang en breng over naar een micro centrifugebuis van 1,7 ml met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.
  6. Verwijder de huid en spieren om de wervelkolom bloot te leggen. Knip de ledematen, ribbenkast en inwendige organen uit (Figuur 1B).
  7. Ontleden het ruggenmerg door een van de twee methoden die hieronder worden beschreven. Breng vervolgens over naar een conische buis van 5 mL met MV-1-oplossing. Houd Tube op ijs.
    1. Voer laminectomie uit door in een rostrale migratoire naar caudale richting te snijden met LaGrange-schaar, beginnend door het halswervel foramen, totdat het lumbale koord wordt bereikt.
    2. Voer doorspoelen in een caudal tot rostrale richting door de lumbale Vertebrale foramen met een 18 G naald en 10 ml spuit geladen met MV-1 oplossing (Figuur 1C, D).
      Let op: deze methode werkt alleen met zeer kleine specimens, meestal knaagdieren (< 100 g).
  8. Snijd met behulp van een ontleed bereik de durale zak van het ruggenmerg met veer schaar en verwijder de overgebleven hersenvliezen met een dubbele uitsteken (Figuur 2).
  9. Breng de hersenen over naar een Petri schaaltje en verwijder met een ontleed bereik de hersenvliezen met een dubbele uitsnede (Figuur 2a – C).
  10. Accijnzen de olfactorische bollen en thalamus met Tang, Iris schaar, en veer schaar. Gebruik de dubbele-pronged pick, verwijder de vaatvlies plexus uit alle hersenventrikels. Zorg ervoor dat u alle vaatvlies plexus verwijdert.
    Let op: de vaatvlies plexus en olfactorische bollen vormen een enorme bron van verontreiniging. In tegenstelling tot de BBB, deze capillairen zijn zeer fenestrated en de resultaten van de daaropvolgende experimenten zullen worden aangetast als ze niet worden verwijderd.
  11. Met behulp van Tang, scheiden de verschillende CNS regio's: cortex, cerebellum, hersenstam, optiek kwal (niet op zoogdieren specimens), en hypothalamus.

3. CNS weefsel dissectie van een grote Gyrencephalic gewervelde specimen

Opmerking: dit protocol maakt gebruik van varkens CNS weefsels verkregen uit een abattoir. Daarom wordt geen verdoving, euthanasie of obductie beschreven of hier getoond.

  1. Transport van varkens CNS weefsels in een 0,946 L (32 oz) histologie container geladen met MV-1 oplossing in een ijskist/emmer.
  2. Met behulp van een ontleed bereik, verwijder de hersenvliezen met een dubbele-pronged pick, Tang, Iris schaar, en veer schaar van elk CZS weefsel. Zorg ervoor dat u alle stukjes vaatvlies plexus uit de hersenventrikels verwijdert.

4. homogenisatie van het CZS-weefsel

Opmerking: het is efficiënter wanneer twee onderzoekers zich bezighouden met het homogenisatie proces: één ontleden van de hersenvliezen onder de stereoscoop en de andere die de fijngehakte weefsels homogeniseren. Op deze manier worden de weefsels snel teruggevoerd naar de ijsemmer en koud gehouden.

  1. Plaats elke CNS regio op een Petri schaaltje met ~ 1 mL MV-1 oplossing. Met behulp van een single-Edge Blade, gehakt het weefsel om 1 – 2 mm stukken te verkrijgen.
    1. Voor een klein gewervelde specimen, gebruik een 100 mm x 20 mm Petri schaaltje.
    2. Voor een groot gewervelde specimen, gebruik een 150 mm x 15 mm Petri schaal.
  2. Homogenisatie van een klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)
    1. Breng de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg over naar ~ 1 mL MV-1 oplossing in een individuele 10 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper met behulp van een transfer pipet. Voeg 5 mL MV-1 oplossing toe en homogeniseren elk weefsel (~ 10 slagen). Breng aan op individuele conische buizen van 15 mL. Houd tubes op ijs.
      Opmerking: voor een kleine gewervelde, 5 of 4, met of zonder optiek, respectievelijk, 10 ml Potter-elvehjem slijpmachines en 15 ml conische buizen zijn nodig.
    2. Breng de hypothalamus en hypofyse met de Tang naar ~ 100 μL MV-1 oplossing in een individuele 1,7 mL buis en zorgvuldig homogeniseren met een glazen micro stamper. Spoel elke micro stamper af met ~ 1 mL MV-1 oplossing. Houd Tube op ijs.
      Opmerking: voor een kleine gewervelde zijn 2 glazen micro pestles en 1,7 mL tubes nodig.
  3. Homogenisatie van een groot gewervelde specimen (tabel 4 en tabel 5)
    1. Gebruik een pipet voor overdracht en breng het fijngehakte weefsel over naar een 55 mL Potter-Elvehjem glas slijpmachine met een PTFE-stamper en Bevestig aan bovengrondse roerder. Voeg de helft van het aanbevolen volume MV-1-oplossing toe, volgens het specifieke CZS-gedeelte (tabel 5).
    2. Zet de Bovenroerder op zeer lage snelheid (~ 150 rpm) en beweeg de glazen buis voorzichtig op en neer voor ongeveer 30 s.
    3. Schakel de overhead roerder uit, voeg meer MV-1-oplossing toe en herhaal stap 4.3.2 totdat een homogene slurry wordt verkregen.
    4. Breng over naar een conische buis van 50 mL. Houd Tube op ijs.
    5. Was de molen met gedeïoniseerd water tussen de homogenisatie van het CZS-weefsel.
      Opmerking: voor een groot gewervelde 5 of 4, met of zonder witte stof, respectievelijk, zijn 50 mL conische buizen nodig. Evenzo, twee (2) 15 mL conische buizen zijn nodig voor de hypothalamus en hypofyse.

5. zuivering van micro vaten

  1. Centrifugeer weefsel homogeniteert als gevolg van stap 4.2.1, 4.2.2 of 4.3.4 bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Een grote witte interface van myeline zal op de top van de pellets van de roodachtige micro vaten worden vormgegeven. Gooi de supernatants weg.
    1. Klein gewervelde specimen (tabel 2 en tabel 3)
      1. Respendeer de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en ruggenmerg pellets in 5 mL ijskoude MV-2-oplossing met een serologische Pipet van 5 mL (~ 10 flushes). Voeg 5 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan elke suspensie en meng zorgvuldig door de buizen te spiegelen.
      2. Respendeer de hypothalamus en hypofyse pellets met 1 mL MV-2 oplossing.
    2. Groot gewervelde specimen (tabel 4 en tabel 5)
      1. Voeg 20 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan de cortex, cerebellum, hersenstam en pellets van ruggenmerg microvaten. Resuspendeer de pellets door te mengen op een buis revolver Shaker, roeren bij 40 rpm gedurende ~ 5 min. balanceer de volumes van de conische buizen van de cortex, cerebellum, hersenstam en suspensies van het ruggenmerg door meer MV-2-oplossing toe te voegen.
      2. Respendeer de hypothalamus en hypofyse-microvat pellets in 5 mL MV-2-oplossing met een serologische Pipet van 5 mL (~ 10 flushes). Voeg 5 mL ijskoude MV-2-oplossing toe aan de suspensies en meng zorgvuldig door de buis te spiegelen.
  2. Centrifugeer bij 4.400 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
  3. Verwijder voorzichtig de dikke en dichte myeline laag op de vloeistof interface van de wanden van elke buis door de buizen langzaam te roteren en de supernatant langs de wanden te laten passeren.
  4. Gooi de myeline en vloeibare interface weg en DEP de binnenwand van elke buis met een spatel gewikkeld met een laag-pluis papier doekje. Voor kleine gewervelde specimens, verwijder de myeline laag uit elke hypothalamus en hypofyse buis door voorzichtig te zuigen met een pipet voor overdracht.
  5. Veeg overtollige vloeistof af met een gedraaid, laag pluis papier doekje. Respendeer elke pellet met 1 mL MV-3 oplossing met behulp van low-binding tips. Houd tubes op ijs.

6. elutie en filtratie van micro vaten

  1. Giet ijskoude MV-3 oplossing in individuele bekers voor elke CNS-regio. Bewaren bij 4 °C.
    1. Voor kleine gewervelde specimens, gebruik 10 mL MV-3 oplossing per 50 mL bekerglas. Een totaal van 6 – 7 bekers is noodzakelijk, afhankelijk van of de optiek kwab is opgenomen.
    2. Voor grote gewervelde specimens, gebruik 30 mL MV-3 oplossing per 100 mL bekerglas. Een totaal van 6 – 7 bekers is nodig, afhankelijk van of witte stof is opgenomen.
  2. Plaats een celzeef bovenop een conische buis van 50 mL. Gebruik één per CZS-regio. Gebruik een 100 μm zeef voor de cortex, hersenstam, optiek kwal, ruggenmerg en hypofyse. Gebruik een 70 μm celzeef voor de cerebellum en de hypothalamus.
  3. Bevochtig elke zeef met 1 mL ijskoude MV-3 oplossing.
  4. Voeg meer MV-3 oplossing toe aan de suspensies bereid in stap 5,5 met een serologische pipet tijdens het mengen om aggregaten te voorkomen. Micro vaten op de zeef zorgvuldig laden. Spoel af met ijskoude MV-3 oplossing.
    1. Voeg voor kleine gewervelde specimens (tabel 2 en tabel 3) 10 – 15 ml MV-3-oplossing met een serologische Pipet toe en spoel af met 5 ml MV-3-oplossing.
    2. Voeg voor grote gewervelde specimens 20 mL MV-3-oplossing toe met een serologische pipet en spoel met 10 mL MV-3 oplossing.
  5. Monteer de filtratie-eenheid door een nylon netfilter van 20 μm op een gemodificeerde filterhouder (Figuur 2D) te plaatsen, één per CZS-gebied.
    1. Voor kleine gewervelde specimens (tabel 2 en tabel 3), gebruik 25 mm gemodificeerde filterhouders voor de cortex, cerebellum, hersenstam, optische LOB en het ruggenmerg. Gebruik 13 mm gemodificeerde filterhouders voor de hypothalamus en hypofyse.
    2. Voor grote gewervelde specimens (tabel 4 en tabel 5), gebruik 47 mm gemodificeerde filterhouders voor de cortex, cerebellum, hersenstam en het ruggenmerg. Gebruik 25 mm voor de hypothalamus en hypofyse.
  6. Plaats het filter bovenop een conische buis van 50 mL en een natte filter met 5 mL ijskoude MV-3-oplossing, waardoor de filterhouder naar de conische buis stroomt.
  7. Breng de eluteerde micro vaten (vanaf stap 6,4) bovenop de 20 μm nylon netfilter en spoel de micro vaten af met 5 – 10 mL ijskoude MV-3-oplossing.
  8. Herstel het filter met behulp van een schone Tang en dompel het in het bekerglas met de ijskoude MV-3 oplossing, bereid in stap 6,1.
  9. Maak de micro vaten los van het filter door het zachtjes schudden voor ongeveer 30 s. Giet voor kleine gewervelde specimens het bekerglas in een conische buis van 15 mL. Giet voor grote gewervelde specimens het bekerglas in een conische buis van 50 mL.
  10. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en breng de pellet in 1 ml IJSKOUDE MV-3-oplossing door met een laag bindende pipetpunt.
    1. Voor kleine gewervelde specimens, breng de suspensie (vanaf stap 6,10) over in een micro centrifugebuis van 1,7 mL en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
      Opmerking: deze spin wordt uitgevoerd op een tafel-centrifuge op maximale snelheid (~ 20.000 x g) om een robuuste opbrengst te garanderen.
    2. Voor grote gewervelde specimens, breng de suspensie van stap 6,10 over in een micro centrifugebuis van 5,0 mL, Voeg 4 mL MV-3-oplossing toe en centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.

7. immunokleuring

Opmerking: de kleuring van HEMA Oxylin en eosine (H & E) werd uitgevoerd op reptielen, amfian en visspecimens als een proof-of-concept van de haalbaarheid van het protocol. Daarom is er geen aanbeveling voor immunolabeling voor deze specimens.

  1. Verwijder de supernatant van de micro centrifugebuizen.
  2. Rebreng de pellet in 1x steriele PBS met een laag bindende pipetpunt (tabel met materialen). Houd de micro vaten van het vormen van aggregaten door meerdere malen te pipetten. Gebruik voor kleine gewervelde specimens (tabel 3) ~ 100 μl – 2000 μl volgens de korrelgrootte. Gebruik bij grote gewervelde specimens (tabel 5) ~ 1.000 μl – 4000 μl volgens de korrelgrootte.
  3. Gebruik een low-binding pipetpunt, breng de micro vaten over naar goed dia's, wees voorzichtig om ze toe te voegen aan het midden van elke put, waarbij de zijwanden worden vermeden.
  4. Stel de goed glijbanen, blootgelegd, in een BSC-2, en laat drogen voor 20 aan 30 min bij RT.
    Opmerking: een relatief hoog volume van 1x PBS wordt gebruikt om geaggregeerde vorming te voorkomen. Daarom is het noodzakelijk om de glaasjes voorafgaand aan fixatie te laten drogen om ervoor te zorgen dat de micro vaten worden vastgehouden door de poly-D-Lysine coating.
  5. Verwijder de resterende 1x PBS door pipetteren met een pipet voor overdracht, voeg 200 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) toe en inbroed gedurende 30 minuten bij RT.
  6. Pipetteer de fixatieve oplossing en spoel 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT.
    Opmerking: H & E kleuring op vissen, amfian, en reptiel CNS micro vaartuigen werd uitgevoerd op dit punt.
  7. Voeg 200 μL blokkerende buffer toe aan de put-Slide en inincubatie voor 60 min bij 37 °C.
  8. Verwijder de blokkerende buffer met een pipet voor overdracht en voeg 200 μL van de cocktail van het primaire antilichaam toe in antilichaam verdunningsmiddel (tabel met materialen). Incuberen bij 4 °C 's nachts.
  9. Pipetteer de cocktail van het primaire antilichaam en spoel 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT.
  10. Laad de cocktail van het secundaire antilichaam (tabel met materialen), verdund in 1x PBS, en inincuberen voor 2 uur bij RT, beschermd tegen licht.
  11. Pipetteer de cocktail van het secundaire antilichaam en was 3x met 200 μL 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Na de laatste Wash los het frame van de goed-Slide en dep-droog elke overmaat 1x PBS met een laag pluis papier doekje.
  12. Voeg een dekslip, vloeibaar antifade inbedmiddel medium, en 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring. Laat 's nachts drogen op RT beschermd tegen licht.
  13. Eenmaal droog, blijf beschermd tegen licht op een Slide box bij 4 °C tot het klaar is voor confocale microscopie en data-acquisitie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micro vaten geïsoleerd uit Murine CNS toonde alle intrinsieke cellulaire componenten van de neurovasculaire eenheid2,3. Met behulp van ofwel bloedplaatjes endotheliale cel adhesie molecuul-1 (PECAM, ook bekend als CD31) of isolectine IB4 (een glycoproteïne dat de endotheel cel glycocalyx bindt) voor endotheel cellen, trombocyten afgeleide groeifactor-β (PDGFRβ) of neuron-glial antigeen 2 (NG2) voor pericytes en aquaporin-4 (AQP4) ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De BBB omvat de unieke eigenschappen van de hersenen microcirculatiebed endotheliale cellen in combinatie met een verfijnde architectuur van strakke-, aanhangers-, "Peg-socket"-knooppunten, en adhesie plaques kritisch voor CNS homeostase2,3,19. Endotheliale cellen eigenschappen worden geïnduceerd en onderhouden door pericytes en de omringende astroglia eind-voet processen2,3

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Cruz-Orengo werd gesteund door de Universiteit van Californië, Davis, de school van de veterinaire geneeskunde start up fondsen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10X PBSThermoFisherBP39920Gebaten voor blokkering en antilichaamverdunner.
20% PFAElectron Microscopy Sciences15713-SGebaten als fixeermiddel (4% PFA)
70,000 MW DextranMillipore Sigma9004-54-0Gebaten voor MV-2 oplossing
Adson ForcepsFine Science Tools (FST)11006-12Gebaten voor verwijdering van spier en huid
Adson Forceps, student qualityFST91106-12Hetzelfde als hierboven maar goedkoper
Bovine serum albumin (BSA)Millipore SigmaA7906-100GGebaten voor MV-3 oplossing, blokkering en antilichaamverdunner
Corning 100 μm Cell strainerMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μm Cell strainerMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork low-binding tipsMillipore SigmaCLS4151Hetzelfde als hieronder maar goedkoper.
Cultrex Poly-D-LysineR&D3439-100-01Gebaten voor het coaten van slides
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555ThermoA21432Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488ThermoA21202Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488ThermoA21206Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647ThermoA31573Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Double-Pronged Tissue PickFST18067-11Gebaten voor verwijdering van meninges en choroïde plexus
Dumont #3c ForcepsFST11231-20Gebaten voor delicate en/of kleine CNS weefselbehandeling (zoals hypofyse)
Dumont #7 ForcepsFST11274-20Gebaten voor CNS weefseldissociatie en behandeling
Dumont #7 Forceps, studentFST91197-00Hetzelfde als hierboven maar goedkoper
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008Betere kwaliteit dan de tips hierboven (duurder).
Extra Fine Graefe Forceps, serratedFST11151-10Gebaten voor botverwijdering
Fine Scissors, sharpFST14060-09Gebaten voor verwijdering van durale zak bij varkens en apen
Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Gebaten voor kleine vertebraten hypothalamus en hypofyse.
Goat anti-CXCL12, biotinylatedPeproTech500-P87BGBTGebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle specimens. Aanbevolen verdunning: 1:20.
Goat anti-JAM-BR&DAF1074Gebaten als primair antilichaam om neuro-inflammatie te beoordelen. Aanbevolen concentratie: 5 μg/mL.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488ThermoA11001Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555ThermoA21424Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Goat anti-PDGFRβR&DAF1042Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle specimens. Aanbevolen concentratie: 5 μg/mL.
Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555ThermoA21249Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488Thermo35552Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Goat anti-Rat IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Gebaten als secundair antilichaam. Aanbevolen verdunning van 1:200.
Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teethFST11054-10Gebaten voor nylon filternet vasthouden en schudden
HBSS, 1X buffer with calcium and magnesiumCorning21-022-CMGebaten voor MV-1 oplossing
HEPES, 1M liquid bufferCorning25-060-CIGebaten voor MV-1 oplossing
Isolectin GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glycoproteïne geïsoleerd uit de peul Griffonia simplicifolia dat zich bindt aan D-galactosylresiduen van endotheelcel glycocalysx. Gebaten voor vogel- en varkens-CNS microvaten. Aanbevolen concentratie: 5 μg/mL.
LaGrange Scissors, serratedFST14173-12Gebaten voor schedeldissectie en laminectomie (behalve varkens en apen)
Millicell EZ slide 8-well unitMillipore SigmaPEZGS0816
Mouse anti-CLDN5Thermo35-2500Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle specimens. Aanbevolen concentratie: 5 μg/mL.
Mouse anti-GGT1Abcamab55138Gebaten als primair antilichaam op CNS microvaten van alle

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eigenschappen van de bloed hersenbarri revergelijking van de neurovasculaire eenheidtechniek voor isolatie van microvatendissectie van weefsel van het centrale zenuwstelselhomogenisatie in MV 1 oplossingprotocol voor zuivering van microvatendetectiemethoden voor immunolabelingexperimentele auto immuun encefalomyelitiskwantificering van eiwitexpressie

Gerelateerde artikelen