Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Samenvatting

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Samenvatting

Rol van hersenvasculatuur in de ontwikkeling van het zenuwstelsel en etiologie van hersenaandoeningen krijgt steeds meer aandacht. Onze recente studies hebben een speciale populatie van vasculaire cellen geïdentificeerd, de periventrtriculaire endotheelcellen, die een cruciale rol spelen bij de migratie en distributie van voorhersenen GABAergic interneuronen tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit, in combinatie met hun cel-autonome functies, zinspeelt op nieuwe rollen van periventricular endotheliale cellen in de pathologie van neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie, epilepsie en autisme. Hier hebben we drie verschillende in vitro tests beschreven die gezamenlijk de functies van periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen evalueren. Het gebruik van deze tests, met name in een menselijke context, zal ons in staat stellen om het verband tussen periventricular endotheliale cellen en hersenaandoeningen te identificeren. Deze tests zijn eenvoudig, lage kosten, en reproduceerbaar, en kan gemakkelijk worden aangepast aan elk aanhangend celtype.

Inleiding

Endotheelcellen vormen het slijmvlies van bloedvaten en bemiddelen belangrijke functies zoals het onderhoud van de doorlaatbaarheid van de vaatwand, regulering van de bloedstroom, bloedplaatjesaggregatie en vorming van nieuwe bloedvaten. In de hersenen maken endotheelcellen deel uit van een kritische bloed-hersenbarrière die de uitwisseling van materialen tussen de hersenen en de bloedbaan strak controleert¹. Onze studies in het afgelopen decennium hebben nieuwe neurogene rollen van hersenendotheliale cellen geïdentificeerd die aanzienlijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van de hersenen en gedrag^2,

Protocol

1. Cultuur en opslag van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen

1. Handhaven van menselijke periventrtriculaire endotheelcellen op keldermembraan matrix-gecoate (zie Tabel van Materialen) 6-put platen in periventricular endotheliale celmedium (E6 medium met 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 en 5 μM GABA) bij 37 °C en 5% CO₂. Verander elke dag van medium.
2. Ontdooi keldermembraanmatrix in 4 °C en maak een 1:100 oplossing door deze te verdunnen in koud DMEM/F12 medium. Bestrijk elke put van een 6-put met 1 mL matrixoplossing. Incubeer platen bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
3. Laat menselijke ....

Resultaten

De stappen voor het opzetten van een een-goed cultuur insert in een 35 mm schotel zijn weergegeven in figuur 1. Lange afstand migratie test en co-cultuur migratie test gebruikt een een-goed insert om het gewenste aantal cellen zaad in het midden van een poly-L-ornithine / laminin gecoate 35 mm schotel. Op dag 0 waren cellen aanwezig als rechthoekige patch(figuur 2A,C). In beelden van dag 0 kan de lijn van dag 0 g.......

Discussie

Hier beschreven we drie in vitro tests die samen kwantitatieve beoordeling van menselijke periventricular endotheliale cel-specifieke eigenschappen bieden. Deze tests zullen waardevol zijn bij het verkrijgen van mechanistische inzichten in de interactie van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen met menselijke interneuronen. Experimenten met liganden, remmers of cellen met genspecifieke knockdown of overexpressie zullen moleculaire spelers identificeren of valideren die endotheliale celgestuurde interneuronmi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Accutase dissociatieoplossing	Millipore Sigma	SCR005	Celdissociatieoplossing (voor periventriculaire endotheliale cellen, stap 1.4)
Anti-human β-Tubuline antilichaam	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antilichaam	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antilichaam	Neuromics	CH22103
Anti-actieve Caspase 3 antilichaam	Millipore Sigma	AB3623
Controle humane endotheliale cellen	Cellular Dynamics	R1022
Controle endotheliale cellen Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogene flacons	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectine	Thermofisher Scientific	33016-015
Vriescontainer	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Humane GABAerge neuronen	Cellular Dynamics	R1013
Humane GABAerge neuronen basismedium	Cellular Dynamics	M1010
Humane GABAerge neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminine	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basale membraanmatrix
Montage Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornitine	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blauw	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Celdissociatieoplossing (voor GABAerge interneuronen en endotheliale cellen, secties 3 en 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component van controle humaan endotheliale celmedium
2-puts siliconen kweek-Insert	ibidi	80209
3-puts siliconen kweek-Insert	ibidi	80369
35 mm schotel	Corning	430165
15-ml conische buis	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA oplossing	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-puts weefselkweekplaat	Fisher Scientific	14-832-11
Inverte fasecontrastmicroscoop	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescentiemicroscoop	Olympus	FSX-100