Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60295

⸱

23 januari 2020

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Samenvatting

Rol van hersenvasculatuur in de ontwikkeling van het zenuwstelsel en etiologie van hersenaandoeningen krijgt steeds meer aandacht. Onze recente studies hebben een speciale populatie van vasculaire cellen geïdentificeerd, de periventrtriculaire endotheelcellen, die een cruciale rol spelen bij de migratie en distributie van voorhersenen GABAergic interneuronen tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit, in combinatie met hun cel-autonome functies, zinspeelt op nieuwe rollen van periventricular endotheliale cellen in de pathologie van neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie, epilepsie en autisme. Hier hebben we drie verschillende in vitro tests beschreven die gezamenlijk de functies van periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen evalueren. Het gebruik van deze tests, met name in een menselijke context, zal ons in staat stellen om het verband tussen periventricular endotheliale cellen en hersenaandoeningen te identificeren. Deze tests zijn eenvoudig, lage kosten, en reproduceerbaar, en kan gemakkelijk worden aangepast aan elk aanhangend celtype.

Inleiding

Endotheelcellen vormen het slijmvlies van bloedvaten en bemiddelen belangrijke functies zoals het onderhoud van de doorlaatbaarheid van de vaatwand, regulering van de bloedstroom, bloedplaatjesaggregatie en vorming van nieuwe bloedvaten. In de hersenen maken endotheelcellen deel uit van een kritische bloed-hersenbarrière die de uitwisseling van materialen tussen de hersenen en de bloedbaan strak controleert1. Onze studies in het afgelopen decennium hebben nieuwe neurogene rollen van hersenendotheliale cellen geïdentificeerd die aanzienlijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van de hersenen en gedrag2,3,4,5. We hebben aangetoond dat de embryonale voorhersenen van de muis gevasculariseerd is door twee verschillende subtypen vaten, de pialvaten en de periventrculaire vaten, die verschillen in anatomie, oorsprong en ontwikkelingsprofiel2. Endotheelcellen langs deze twee soorten vaartuigen vertonen duidelijke verschillen in hun genexpressieprofielen. Terwijl piale endotheelcellen meestal genen met betrekking tot ontsteking en immuunrespons uitdrukken, zijn periventrtriculaire endotheelcellen uniek verrijkt in expressie van genen die vaak geassocieerd worden met neurogenese, neuronale migratie, chemotaxis en axonbegeleiding3. Periventricular endotheliale cellen ook huis een nieuwe GABA signalering pad dat is onderscheiden van de traditionele neuronale GABA signalering pad5. Gelijktijdig met zijn genexpressie bleken periventrtriculaire endotheelcellen de migratie en distributie van GABAergic interneuronen in de zich ontwikkelende neocortex te reguleren. Tijdens de embryonale ontwikkeling ondergaan periventricular endotheliale cellen langdurige migratie langs een ventrale ruggradiënt om het periventrtriculaire vasculaire netwerk vast te stellen2,3. Deze migratieroute wordt een dag later gespiegeld door interneuronen. Migrerende interneuronen interageren fysiek met het vooraf gevormde periventrtriculaire vasculaire netwerk en gebruiken het als een geleiderail om hun eindbestemming in de neocortex te bereiken. Naast het fungeren als een fysiek substraat, periventricular endotheliale cellen dienen als de bron van navigatie signalen voor migrerende neuronen. Periventricular endotheliale cel-uitgescheiden GABA gidsen interneuron migratie en reguleert hun uiteindelijke distributie patronen4. Defecten in interneuron migratie en distributie worden geassocieerd met neuropsychiatrische stoornissen zoals autisme, epilepsie, schizofrenie en depressie6,7,8,9,10. Daarom wordt studie van periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuronmigratie in menselijke context van cruciaal belang voor het aanpakken van de pathogenese van deze aandoeningen.

We hebben menselijke periventrtriculaire-achtige endotheelcellen gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen in ons laboratorium11, met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie12,13. Om te valideren of menselijke periventricular endotheelcellen getrouw muisperiventricular endotheliale cellen nabootsen, en om hun invloed op interneuronmigratie kwantitatief te beoordelen, ontwikkelden we drie in vitro tests: een lange afstandsmigratietest, een co-cultuurmigratietest en een chemo-aantrekkelijkheidstest. Hier beschrijven we protocollen voor deze testen in detail. Alle drie de tests zijn gebaseerd op het gebruik van siliconen cultuur inserts om een kleine rechthoekige patch van cellen (van vaste afmetingen) omgeven door celvrije ruimte te creëren. Migratieafstand wordt geëvalueerd door de afstand tussen de eindposities van cellen te meten vanaf de rand van de rechthoekige patch die op dag 0 is beschreven. In de lange afstand migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen worden gezaaid als een patch in het midden van een 35 mm schotel, en de afstanden afgelegd door de cellen over een lange reeks van tijd worden berekend. In de co-cultuur migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen zijn co-gezaaid met menselijke interneuronen als een patch in een 35 mm schotel. Deze opstelling maakt het mogelijk om het effect van directe fysieke interacties van deze twee celtypen op de mate van migratie van interneuronen te onderzoeken. De chemo-attractie test meet de migratie van interneuronen in reactie op chemo-aantrekkelijke signalen afgescheiden door menselijke periventricular endotheliale cellen. Interneuronen worden gezaaid als een rechthoekige patch, met menselijke periventrtriculaire endotheelcellen en controle niet-perivefntricular endotheliale cellen gezaaid als vergelijkbare grootte patches aan weerszijden. Elk van de celpleisters wordt gescheiden door een celvrije kloof van 500 μm. De respons van interneuronen wordt beoordeeld door het aantal cellen te kwantificeren dat naar periventricular endotheliale cellen is gemigreerd in vergelijking met de controle van niet-periventrtriculaire endotheelcellen.

Deze tests bieden een robuuste beoordeling van menselijke periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuron migratie. De nieuwe opzet van lange afstand test en co-cultuur migratie test biedt cel-vrije ruimte in het bereik van centimeters (~ 1-1,5 cm) om detectie van lange afstand migratie mogelijk te maken. Een samenvatting van de kenmerken van onze tests in vergelijking met andere populaire tests wordt gepresenteerd in tabel 1. Gezamenlijk, de testen hier beschreven zal dienen als een platform voor de beoordeling van "zieke" periventricular endotheliale cellen en interneuronen gegenereerd uit iPSCs van hersenaandoeningen zoals schizofrenie, autisme of epilepsie. Deze tests kunnen ook worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende aandoeningen (bijvoorbeeld remmers, liganden, RNAi) de celmigratie beïnvloeden. Ten slotte kunnen deze tests worden geoptimaliseerd voor andere celtypen om migratie over lange afstand, chemo-aantrekkingskracht of celcelgemedieerde migratie te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cultuur en opslag van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen

  1. Handhaven van menselijke periventrtriculaire endotheelcellen op keldermembraan matrix-gecoate (zie Tabel van Materialen) 6-put platen in periventricular endotheliale celmedium (E6 medium met 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 en 5 μM GABA) bij 37 °C en 5% CO2. Verander elke dag van medium.
  2. Ontdooi keldermembraanmatrix in 4 °C en maak een 1:100 oplossing door deze te verdunnen in koud DMEM/F12 medium. Bestrijk elke put van een 6-put met 1 mL matrixoplossing. Incubeer platen bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
  3. Laat menselijke periventricular endotheliale cellen om een samenvloeiing van 80%-90% te bereiken. Aanzuigenmedium uit de put. Was de putten één keer met 1 mL steriele 1x PBS per put.
  4. Maak cellen los door 1 mL celdissociatieoplossing toe te voegen (zie Materiaaltabel)per put. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Voeg na 5 min 1 mL periventricular endotheliale celmedium toe. Breng de celoplossing over in een conische buis van 15 mL.
    OPMERKING: We gebruiken Accutase voor celdissociatie hier, in tegenstelling tot TrypLE in de secties 3 en 4.
  5. Centrifugecellen bij 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur, zuigen de supernatant aan en schorsen de celpellet in 1 mL periventricular endothelial cell medium.
  6. Tel levende cellen met de trypanblauwe uitsluitingsmethode. Zaadcellen in verse matrixgecoate platen met een dichtheid van 1,2 x 105 cellen/cm2. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
  7. Bewaar menselijke periventrtriculaire endotheelcellen door cryopreserving in vriesmedium (90% periventrtriculair endotheel celmedium en 10% DMSO).
    1. Los en verzamel cellen na de stappen 1.3 en 1.4 hierboven. Tel cellen in de oplossing met de trypan blauwe uitsluitingsmethode.
    2. Centrifugecellen bij 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Aanzuigen van de supernatant en opnieuw opschorten van de cel pellet op 5 x 106 cellen / mL van bevriezing medium.
    3. Doseer 1 mL vriesmedium plus cellen per cryovial. Plaats de flesjes in isopropanol gevulde kamer en koel 's nachts af in -80 °C bij 1 °C/min. Breng vials op de volgende dag over naar een vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag.

2. Voorbereiding van menselijke periventricular endotheliale cellen voor test

  1. Laat menselijke periventricular endotheliale cellen te bereiken 70%-80% samenvloeiing.
  2. Decellen scheiden naar aanleiding van de stappen 1.3 tot en met 1.5, zoals hierboven beschreven. Tel cellen met de methode trypan blauwe uitsluiting.

3. Voorbereiding van menselijke GABAergic Interneuronen voor Test

OPMERKING: Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide GABAergic interneuronen en het neuronale medium werden commercieel aangekocht (zie Tabel met materialen). De neuronen worden gegenereerd door het differentiëren van een menselijke fibroblast-afgeleide iPSC lijn na een protocol ontwikkeld door de fabrikant. De cellen werden ontdooid en gekweekt volgens het protocol van de fabrikant.

  1. Ontdooi menselijke GABAergic interneuronen en kweek ze in 12-put plaat gedurende twee weken tot een samenvloeiing van 70%-80%.
  2. Op de dag van de test, warme celdissociatieoplossing (zie Tabel met materialen) en een aliquot van neuronal medium bij 37 °C gedurende 10 minuten voor gebruik.
  3. Aanzuigenmedium uit elke put die de cellen bevat. Was cellen met 1 mL steriele 1x PBS per put.
  4. Maak cellen los door 0,5 mL voorverwarmde dissociatieoplossing per put toe te voegen en uit te broeden bij 37 °C gedurende 5 min. Voeg 1 mL neuronalmedium per put toe. Breng celoplossing over in een conische buis van 15 mL. Voorzichtig triturate om celklontjes te scheiden.
  5. Centrifugecellen bij 380 x g voor 5 min bij kamertemperatuur, zuigen de supernatant aan en schorsen de celpellet in 1 mL neuronal medium. Tel levende cellen met de trypanblauwe uitsluitingsmethode.

4. Voorbereiding van controle menselijke endotheliale cellen voor test

OPMERKING: Controle menselijke iPSC-afgeleide endotheelcellen en endotheel celmedium werden commercieel gekocht (Tabel met materialen). Deze endotheelcellen worden gegenereerd door het differentiëren van een menselijke fibroblast-afgeleide iPSC lijn endotheel lot na een protocol ontwikkeld door de fabrikant. De cellen werden ontdooid en gekweekt op Fibronectin substraat volgens het protocol van de fabrikant. Fibronectin-gecoate platen werden bereid volgens het protocol van de fabrikant.

  1. Dooi controle menselijke endotheelcellen en cultuur ze in 6-put plaat tot een samenvloeiing van 80%-90%.
  2. Op de dag van de test, warme celdissociatieoplossing (zie Tabel met materialen) en een aliquot van endotheelmedium bij 37 °C gedurende 10 minuten voor gebruik.
  3. Aanzuigen van het medium uit elke put met de cellen. Was cellen met 1 mL steriele 1x PBS per put.
  4. Maak cellen los door 0,5 mL voorverwarmde dissociatieoplossing per put toe te voegen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 1 mL endotheel celmedium per put toe om de dissociatieoplossing te neutraliseren. Breng celoplossing over in een conische buis van 15 mL.
  5. Centrifugecellen bij 200 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Aanzuigen supernatant en opnieuw opschorten van de cel pellet in 1 mL van endotheel celmedium. Tel levende cellen met de trypanblauwe uitsluitingsmethode.

5. Voorbereiding van een-goed cultuur inserts

  1. Ontdooi 1 mg/mL laminineoplossing bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
  2. Bestrijk een passend aantal 35 mm gerechten met 0,01% poly-L-ornithine oplossing (1 mL per schotel). Incubeer de gerechten in kamertemperatuur voor ten minste 1 uur.
  3. Verdun 1 mg/mL laminineoplossing 1:300 in steriel water tot een eindconcentratie van 3,3 μg/mL onmiddellijk voor gebruik.
  4. Volledig aanzuigen poly-L-ornithine van elke schotel. Spoel elke schotel grondig 3x met steriel water en aanzuigen volledig om poly-L-ornithine-geïnduceerde cel toxiciteit te voorkomen.
  5. Voeg 1 mL laminineoplossing van 3,3 μg/mL aan elke schotel toe en incubeer 's nachts bij 37 °C of ten minste 1 uur. Verwijder laminineoplossing uit de schaal vlak voor gebruik.
    LET OP: Bewaar de laminhoudende gerechten ook in 4 °C. Equilibrate de gerechten in een 37 °C cel kweek incubator voor gebruik.
  6. Snijd drie zijden van een put van een twee-goed siliconen cultuur insert(figuur 1A) met behulp van een steriel blad om een een-goed insert(figuur 1B)te genereren.
    OPMERKING: Houd de twee-goed insert stevig bevestigd aan het oppervlak van de originele verpakking tijdens het snijden om een gladde snede te garanderen en de kleefkracht van de wisselplaat te beschermen.
  7. Aanzuigen lamininoplossing van de gerechten.
    LET OP: Was de afwas niet met steriele PBS of water na de incubatievan lamine. Natte oppervlakken voorkomt een strakke hechting van de kweekinsert.
  8. Verwijder een goed insert met steriele pincet en plaats het in het midden van de poly-L-ornithine / laminin gecoate schotel. Druk langs de randen van de insert om het te bevestigen aan het oppervlak van de schotel.
  9. Draai de schotel voorzichtig ondersteboven om te controleren of de wisselplaat stevig is vastgezet.
  10. Houd de schotel ondersteboven en markeer de grens van het wisselplaatvak met behulp van een permanente zwarte markering met een ultrafijne punt(figuur 1C).

6. Lange-afstandsmigratietest

  1. Schort menselijke GABAergic interneuronen op bij een concentratie van 3 x 104 cellen/70 μL neuronalmedium. Zaad 70 μL celoplossing in elke eenputcultuurinsert.
    OPMERKING: De zaaidichtheid van interneuronen is volgens de aanbeveling van de fabrikant.
  2. Schorsen de menselijke periventricular endotheelcellen bij een concentratie van 3 x 104 cellen/70 μL periventricular endotheelcelmedium. Zaad 70 μL celoplossing in elke eenputcultuurinsert.
    OPMERKING: Het aantal menselijke periventrtriculaire endotheelcellen gezaaid op een 1:1 verhouding met het aantal gezaaide neuronen.
  3. Voeg 1 mL neuronale medium in neuron schotel om het gebied rond de insert te vullen en te voorkomen dat de coating drogen. Voeg ook 1 mL periventricular endotheliale celmedium toe in periventrtriculaire endotheelcelschotel.
    OPMERKING: Voeg medium langzaam langs de rand van de schotel, zodat de insert niet wordt verstoord.
  4. Controleer onder een microscoop om te controleren of cellen niet uit het wisselruimtecompartiment lekken.
  5. Incubeer cellen voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur incubatie onder de microscoop om te controleren of de cellen goed zijn bevestigd en er is geen nachtelijk lek.
  6. Na 48 uur zaaien, verwijder de insert voorzichtig met behulp van een steriele pincet. Controleer onder de microscoop om te controleren of de cellaag ongestoord blijft (dag 0).
  7. Verwijder medium uit het neuron schotel en voeg 1 mL van verse neuronale medium. Verwijder ook medium uit de periventricular endotheel celschotel en voeg 1 mL verse periventricular endotheliale celmedium toe.
    LET OP: Zet een verplicht aantal gerechten opzij en bevestig met 4% PFA voor dag 0-afbeeldingen.
  8. Incubeer cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Na 5 dagen, verwijder medium, bevestig cellen met 4% PFA gedurende 10 min en was 3x met 1x PBS.
  9. Vlekneuronen met anti-menselijke β-tubulin of anti-menselijk MAP2-antilichaam, en endotheliale cellen met anti-menselijk CD31-antilichaam. Voeg aan het einde van immunovlekken 1 mL antifade montagemedium toe aan elk gerecht.

7. Co-cultuur Migratie Assay

  1. Co-suspend 3 x 104 GABAergic interneuronen en 3 x 104 menselijke periventrtriculaire endotheelcellen in 70 μL co-kweekmedium (50% periventricular onderhoudsmedium zonder GABA en 50% neuronal medium). Zaai deze celoplossing in het eenputwisselvak. Bereid een passend aantal van dergelijke voorbeeldgerechten.
    OPMERKING: GABA is niet toegevoegd in het co-cultuurmedium om het effect van exogene GABA op migratie uit te sluiten.
  2. Controleer onder een microscoop om te controleren of cellen niet uit het wisselruimtecompartiment lekken.
  3. Voeg langzaam 1 mL co-kweekmedium aan de zijkant van de schotel toe om te voorkomen dat de coating droogt.
    OPMERKING: Voeg medium langzaam langs de rand van de schotel, zodat de insert niet wordt verstoord.
  4. Als eerste controle, zaad 3 x 104 menselijke GABAergic interneuronen alleen in 70 μL co-kweekmedium per eengoed wisselplaat. Bereid een passend aantal van dergelijke gerechten.
  5. Als tweede controle, co-seed 3 x 104 GABAergic menselijke interneuronen met 3 x 104 controle menselijke endotheliale cellen in 70 μL co-cultuur medium per een-goed insert. Bereid een passend aantal gerechten.
  6. Incubeer de gerechten voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur incubatie onder een microscoop of cellen goed zijn bevestigd en er is geen lek.
  7. Na 48 uur zaaien, verwijder de insert voorzichtig met behulp van een steriele pincet. Controleer onder de microscoop of de cellaag niet wordt verstoord (dag 0).
  8. Verwijder medium en voeg 1 mL verse co-cultuur medium.
    LET OP: Zet een passend aantal gerechten opzij voor het verkrijgen van dag 0 beelden.
  9. Incubeer cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
  10. Na 5 dagen, verwijder medium, bevestig cellen met 4% PFA gedurende 10 min en was 3x met 1x PBS.
  11. Vlek met anti-menselijke β-Tubulin of anti-menselijk MAP2 antilichaam om de neuronen te etiketteren. Voeg aan het einde van immunovlekken 1 mL antifade montagemedium toe aan elk gerecht.

8. Chemo-attractie Assay

  1. Plaats een drie-goed kweek insert in het midden van een poly-L-ornithine / laminin gecoate 35 mm schotel met behulp van steriele pincet.
  2. Draai de schotel ondersteboven. Markeer de grens rond het middelste compartiment van de wisselplaat met behulp van een permanente zwarte markering met ultrafijne punt.
  3. Zaad 3 x 104 menselijke GABAergic interneuronen in het middelste compartiment in 70 μL neuronalmedium (figuur 3A).
  4. Zaad 104 menselijke periventrtriculaire endotheelcellen in respectievelijk 70 μL periventricular endothelial cell medium en 104 controle-endotheliale cellen in 70 μL van controle-endotheelcelmedium in de twee buitenste compartimenten (figuur 3A).
  5. Voeg 1 mL co-kweekmedium (50% periventrtriculair onderhoudsmedium zonder GABA en 50% neuronal medium) toe aan de zijkant van de schotel om te voorkomen dat de coating op de schotel droogt.
  6. Controleer onder de microscoop om te controleren of cellen niet uit het wisselruimtecompartiment lekken.
  7. Incubeer cellen voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur incubatie onder een microscoop of cellen goed zijn bevestigd en er is geen lek.
  8. Na 48 uur zaaien, verwijder de insert voorzichtig met behulp van een steriele pincet. Controleer onder de microscoop of de cellaag niet wordt verstoord (dag 0).
  9. Verwijder medium en voeg 1 mL verse co-cultuur medium.
    LET OP: Zet het vereiste aantal gerechten opzij voor dag 0-afbeeldingen.
  10. Incubeer cellen voor 36 uur bij 37 °C en 5% CO2. Na 36 uur, aanzuigen medium, vast te stellen cellen met 4% PFA voor 10 min, en was 3x met 1x PBS.
  11. Vlek menselijke GABAergic interneuronen met anti-menselijke β-Tubulin of anti-menselijke MAP2 antilichaam. Aan het einde van de kleuringsprocedure, voeg 1 mL van antifade montage medium in elke schotel.

9. Beeldvorming en gegevensanalyse

  1. Plaats de met immuno bevlekte testschotel onder een microscoop bij 4X vergroting.
  2. Houd een lange rand van de rechthoekige grens (gemaakt in stap 5.10 hierboven) in het gezichtsveld. Maak foto's van cellen in de celvrije ruimte naast die grens. Afbeeldingen verkrijgen langs de rechter rand en de linker lange rand van de rechthoekige grens(figuur 2B).
    OPMERKING: Cellen die diagonaal zijn geplaatst ten opzichte van de rechthoek worden niet in aanmerking genomen vanwege onduidelijkheid bij het selecteren van de korte of lange rand als startmerk. Ook zijn aantallen cellen die over de korte rand migreren vaak aanzienlijk minder (mogelijk als gevolg van minder startcellen langs de korte rand) en worden ze niet overwogen.
  3. Open de afbeeldingen in ImageJ. Bereken de afstand tussen elke cel en het grensmarkeringsmerk (figuur 2D)met ImageJ.
  4. Als u migratie wilt beoordelen in termen van celnummers, stelt u een specifieke afstand in van de grens in het verkregen beeld in ImageJ. Tel het aantal cellen dat aanwezig is binnen deze afstand. Bereken het gemiddelde aantal, destandaarddeviatie en statistische significantie met behulp van geschikte software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De stappen voor het opzetten van een een-goed cultuur insert in een 35 mm schotel zijn weergegeven in figuur 1. Lange afstand migratie test en co-cultuur migratie test gebruikt een een-goed insert om het gewenste aantal cellen zaad in het midden van een poly-L-ornithine / laminin gecoate 35 mm schotel. Op dag 0 waren cellen aanwezig als rechthoekige patch(figuur 2A,C). In beelden van dag 0 kan de lijn van dag 0 g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschreven we drie in vitro tests die samen kwantitatieve beoordeling van menselijke periventricular endotheliale cel-specifieke eigenschappen bieden. Deze tests zullen waardevol zijn bij het verkrijgen van mechanistische inzichten in de interactie van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen met menselijke interneuronen. Experimenten met liganden, remmers of cellen met genspecifieke knockdown of overexpressie zullen moleculaire spelers identificeren of valideren die endotheliale celgestuurde interneuronmi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door prijzen van het National Institute of Mental Health (R01MH110438) en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) aan AV.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accutase dissociatieoplossingMillipore SigmaSCR005Celdissociatieoplossing (voor periventriculaire endotheliale cellen, stap 1.4)
Anti-human β-Tubuline antilichaamBiolegend802001
Anti-human CD31 antilichaamMillipore SigmaCBL468
Anti- MAP2 antilichaamNeuromicsCH22103
Anti-actieve Caspase 3 antilichaamMillipore SigmaAB3623
Controle humane endotheliale cellenCellular DynamicsR1022
Controle endotheliale cellen Medium SupplementCellular DynamicsM1019
Cryogene flaconsFisher Scientific03-337-7Y
DMEMF/12 mediumThermofisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
E6 mediumThermofisher ScientificA1516401
FGF2Thermofisher ScientificPHG0261
FibronectineThermofisher Scientific33016-015
VriescontainerThermofisher Scientific5100
GABASigma-AldrichA2129
HemacytometerSigma-AldrichZ359629
Humane GABAerge neuronenCellular DynamicsR1013
Humane GABAerge neuronen basismediumCellular DynamicsM1010
Humane GABAerge neuron Neural supplementCellular DynamicsM1032
LaminineSigmaL2020
MatrigelCorning356230Basale membraanmatrix
Montage MediumVector laboratoriesH-1200
poly-L-ornitineSigmap4957
PBSThermofisher Scientific14190
Trypan blauwThermofisher Scientific15250061
TrypLEThermofisher Scientific12563011Celdissociatieoplossing (voor GABAerge interneuronen en endotheliale cellen, secties 3 en 4)
VEGF-APeprotech100-20
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeline Cell TechnologiesLL-0003Component van controle humaan endotheliale celmedium
2-puts siliconen kweek-Insertibidi80209
3-puts siliconen kweek-Insertibidi80369
35 mm schotelCorning430165
15-ml conische buisFisher Scientific07-200-886
4% PFA oplossingFisher ScientificAAJ19943K2
6-puts weefselkweekplaatFisher Scientific14-832-11
Inverte fasecontrastmicroscoopZeissZeiss Axiovert 40C
FluorescentiemicroscoopOlympusFSX-100

Referenties

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149(2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356(2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Menselijke periventriculaire endotheelcellenGABAerge interneuronenmigratie assayco cultuur assaychemo attractie assaycelmigratiecelisolatietrypaanblauw uitsluitingimmunocytochemische kleuringneuropsychiatrische stoornissen
Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.