Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

Summary

Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.

Abstract

Primaire myoblasten zijn niet-gedifferentieerde prolifererende precursoren van skeletspieren. Ze kunnen worden gekweekt en bestudeerd als spier precursoren of geïnduceerd om te differentiëren in latere stadia van spierontwikkeling. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een robuuste methode voor de isolatie en cultuur van een zeer proliferatieve populatie van Myoblast cellen van jonge volwassen muis skeletspieren explanten. Deze cellen zijn nuttig voor de studie van de metabolische eigenschappen van de skeletspieren van verschillende muismodellen, evenals in andere downstream toepassingen zoals transfectie met exogene DNA of transductie met virale expressie vectoren. Het niveau van differentiatie en metabole Profiel van deze cellen is afhankelijk van de lengte van de blootstelling, en de samenstelling van de media die worden gebruikt voor het opwekken van Myoblast differentiatie. Deze methoden bieden een robuust systeem voor de studie van muis spiercellen metabolisme ex vivo. Belangrijk is dat, in tegenstelling tot in vivo-modellen, de hier beschreven methoden zorgen voor een celpopulatie die kan worden uitgebreid en bestudeerd met hoge reproduceerbaarheids niveaus.

Introduction

Hoewel vaak aangehaald als een indicatie van de algehele metabole gezondheid, meerdere studies hebben aangetoond dat body mass index (BMI) bij oudere volwassenen is niet consistent geassocieerd met een hoger risico van sterfte. Tot op heden is de enige factor die consistent is met verminderde sterfte in deze populatie toegenomen spier massa¹. Spierweefsel vertegenwoordigt een van de grootste bronnen van insuline-gevoelige cellen in het lichaam, en is daarom kritisch in het onderhoud van de totale metabole homeostase². Activering van skeletspier weefsel via oefening wordt geassocieerd met stijgingen van zowel de lokale insulinegevoeligheid en de algehele metabole gezondheid³. Terwijl in vivo modellen zijn essentieel voor het bestuderen van de spier fysiologie en de impact van de spierfunctie op geïntegreerde metabolisme, primaire culturen van myotubes bieden een Tractable systeem dat de complexiteit van dierproeven vermindert.

Myoblasten afgeleid van postnatale spieren kunnen worden gebruikt om de impact van talrijke behandelings-en groeicondities op een zeer reproduceerbare manier te bestuderen. Dit is al lang erkend en verschillende methoden voor Myoblast isolatie en cultuur zijn beschreven^4,5,6,7,8,9. Sommige van deze methoden gebruiken neonatale spieren en leveren relatief lage aantallen myoblasten op,^5,8, waarvoor meerdere dieren nodig zijn voor grootschalig onderzoek. Ook de meest gebruikte methoden voor het kweken van myoblasten gebruiken "pre-plating" om te verrijken voor myoblasten, die minder hecht zijn dan andere celtypen. We hebben geconstateerd dat de alternatieve verrijkings methode die hier wordt beschreven veel efficiënter en reproduceerbaar is voor het verrijken van een zeer proliferatieve Myoblast populatie. Samengevat, dit protocol maakt de isolatie van zeer proliferatieve myoblasten van jonge volwassen spier Explants, via uitgroei in cultuur media. Myoblasten kunnen herhaaldelijk worden geoogst, gedurende meerdere dagen, snel uitgebreid, en geïnduceerd om te differentiëren in myotubes. Dit protocol reproduceerd genereert een groot aantal gezonde Myoblast cellen die krachtig differentiëren in spontaan trekkingen myotubes. Het heeft ons in staat om metabolisme en circadiane ritmes te bestuderen in primaire myotubes van muizen van een verscheidenheid van genotypes. Tot slot, we omvatten methoden voor de voorbereiding van myotubes voor de studie van oxidatieve metabolisme, met behulp van metingen van de zuurstofverbruik in 96-goed platen.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van Scripps onderzoek.

1. inzameling en verwerking van spierweefsel Explants

1. De dag voorafgaand aan de sectie, Steriliseer alle dissectie apparatuur (Tang, scheermesjes en schaar) en bereid alle benodigde media: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), MB plating media (12,5 mL DMEM, 12,5 mL hammen F12, 20 mL van warmte-geïnactiveerde foetale runderen serum (FBS), 5 mL amniotische vloeistof medium supplement), en coating oplossing (24 mL DMEM, 24 mL hammen F12, 1,7 mL collageen, 1 mL matrigel).
2. De dag van dissectie, vacht een 6-cm schaal met coating oplossing voor elke spier te worden ontleed. Voeg 2 mL coating oplossing aan het oppervlak van elke plaat toe, schud zachtjes om een gelijkmatige vacht op het oppervlak te maken en inbroed de platen met oplossing bij 4 °C gedurende 1 uur.
3. Verwijder de coating oplossing van de platen en keer terug naar de stockoplossing.
   Opmerking: Coating oplossing kan worden hergebruikt voor maximaal zes maanden en moet worden bewaard bij 4 °C.
4. Spoel de platen tweemaal af met 2 mL PBS om ongebonden collageen en matrigel te verwijderen.
5. Plaats de platen in een incubator voor weefselkweek van 37 °C tijdens dissecties.
6. Maak een vochtige kamer door 2-3 vellen dik absorberend papier in een plastic zak of een steriele 15 cm schaal te plaatsen en gebruik een pipet om het oppervlak van het papier met steriel water te nat te maken.
7. Plaats de kamer gedurende 5 minuten onder UV-licht om te steriliseren.
8. Ontleden de gewenste spieren van een 4 tot 8 weken oude muis. Om spierweefsel te steriliseren, spoel voorzichtig in PBS met 40 μg/mL gentamicine.
   Opmerking: Voor quadriceps en gastrocnemius spieren, plaat één spier per plaat. Voor soleus, de en EDL, combineren spieren van beide benen in één plaat.
9. Gebruik steriele tang om de spier over te brengen naar een steriel 10 cm niet-gecoat Petri schaaltje. Voeg 0,5-1,0 mL uitplatings media toe over de spier, zodat het weefsel vochtig is, maar niet zweeft (Figuur 1a).
10. Gebruik een steriel scalpel of scheermesje om de spier voorzichtig in kleine fragmenten te snijden (ongeveer 1-3 mm³).
    Opmerking: Het is belangrijk om te minimaliseren van de behandeling van het spierweefsel voor de beste resultaten.
11. Gebruik een tang of een pipet om de spier fragmenten over te brengen op het oppervlak van een voorgecoate plaat van 6 cm. Zeer voorzichtig bedekken een extra 0,8 mL van de plating media over het weefsel. Er moeten voldoende media zijn om de weefsel stukken gehydrateerd te houden, maar niet zwevend (Figuur 1B).
12. Plaats de 6-cm gerechten met de spier fragmenten in de vochtige kamer en keer terug naar een incubator (37 °C, 5% CO₂) voor 48 h (Figuur 1C).
    Opmerking: Het is van vitaal belang dat spier fragmenten zich aan het oppervlak van de plaat hechten om Myoblast-uitgroei mogelijk te maken. Verplaats de platen/kamer niet voor ten minste 48 uur.
13. Na 48 h, Controleer zorgvuldig de platen om ervoor te zorgen dat de spier fragmenten hebben nageleefd. Overlay met 2 mL plating media, het verzorgen van de fragmenten niet te ontzetten.
    Opmerking: Als er zichtbare verontreiniging of vuil op de platen, zorgvuldig wassen de spier stukken. Plaat 2 mL PBS/gentamicin-oplossing aan de rand van de plaat en tip zachtjes om over het spierweefsel te spoelen. Verwijder de PBS en herhaal de Wash-stap. Na de tweede spoeling, overlay 2 mL van de plating media.
14. Bewaar de platen in de incubator van 37 °C tot een extra 3 dagen (5 dagen na de oorspronkelijke dissectie) voordat u myoblasten oogst. Controleer om de andere dag voor uitgroei van myoblasten.
    Opmerking: Het verschijnen van cellen die ontstaan uit spier explanten zal variabel en heterogeen zijn. Primaire myoblasten worden weergegeven als kleine, ronde en heldere cellen. Het is echter niet nodig noch betrouwbaar om ze te identificeren door hun verschijning in dit stadium (Figuur 2).

2. het oogsten van uitgroeiende Myoblasten

1. Bereiden en voorverwarmen Myoblast media (17,5 mL DMEM, 17,5 mL hammen F12, 10 mL FBS, 5 mL amniotische vloeistof medium supplement), trypsine, en PBS/gentamicin. Vacht één T25 kolf per spiergroep die wordt geoogst met coating oplossing en zoals beschreven in stap 1,2 (Zie tabel 1).
2. Verwijder de afplatings media en spoel de spier explantaten voorzichtig af met 2 ml PBS/gentamicine. Verwijder snel PBS (spoel één plaat tegelijk af en laat de plaat niet in PBS zitten bij deze stap).
3. Voeg zachtjes 1 mL PBS/gentamicin toe en plaats de plaat gedurende 1 minuut in de incubator van 37 °C.
4. Gebruik een P1000 pipet om PBS/cellen te verzamelen in een centrifugebuis van 15 mL.
5. Voeg 1 mL trypsine toe aan de plaat en keer 3 minuten terug naar de incubator van 37 °C. Tik zachtjes op de platen om myoblasten te verdoezelen. Verzamel de trypsine/cellen en combineer deze met de PBS-collectie. Voeg 8 mL Myoblast media toe aan de centrifugebuis en keer zachtjes om te mengen.
6. Overlay 2 mL van de beplating oplossing op de spier platen en keer terug naar de incubator van 37 °C.
7. Draai de centrifuge buisjes met cellen in een centrifuge gedurende 3 minuten bij 200 x g.
8. Aspireren de supernatant tot ~ 1 mL, voorzichtig om te voorkomen dat celpellet. Voeg voorzichtig Myoblast media (Zie tabel 1) toe en breng de cellen over naar de voorgevulde kolf en plaats deze in de 37 °c-incubator. Dit is de P0 oogst. Indien waargenomen onder een Microscoop, kunnen er zeer weinig cellen zijn (Figuur 3).
9. Herhaal de hierboven beschreven oogst om de twee dagen tot drie keer. Gooi na de derde oogst de Explants weg.

3. uitbreiding en verrijking van prolifererende Myoblasten

Opmerking: De P0 oogst zal heterogeen zijn (~ 60% myoblasten). De volgende 2 passages gebruiken PBS om myoblasten selectief te oogsten. Veel van de meer aanhangende cellen zullen achterblijven en de snel prolifererende myoblasten zullen ≥ 95% zuiver zijn binnen 2 passages. Zodra myoblasten zijn vastgesteld, moeten ze met een lage dichtheid worden gehandhaafd om spontane differentiatie te voorkomen.

1. Voor elke T25 kolf van ~ 40-50% confluente cellen uit rubriek 2, vacht één T75 kolf met 5 mL coating oplossing en plaats bij 4 °C voor 1-4 h.
2. Verwijder de coating oplossing uit de kolven en ga terug naar de stockoplossing. Spoel de kolven tweemaal af met 2 mL PBS/gentamicin en plaats deze in de incubator van 37 °C.
3. Zuig de media op uit P0-kolven in de oblast T25 Spoel de cellen kort af met 2 mL warme PBS/gentamicine. Naar PBS uit de kolf.
   Opmerking: Het doel van deze stap (3,3) is het verminderen van de mogelijkheid van bacteriële besmetting. Als het snel en voorzichtig wordt uitgevoerd, mag dit niet leiden tot verlies van myoblasten. Het kan worden weggelaten om te maximaliseren Myoblast behoud indien gewenst.
4. Pipetteer 2 mL warme PBS (geen trypsine) in elke kolf die myoblasten bevat. Plaats de kolven met PBS in de incubator van 37 °C gedurende 3 min.
   Opmerking: Myoblasten moeten gemakkelijk van kolven met PBS worden losgekoppeld. Het gebruik van PBS in plaats van trypsine bij deze stap is van cruciaal belang voor het verminderen van de verontreiniging van de Myoblast populatie met andere celtypen.
5. Verwijder de cellen uit de incubator van 37 °C en druk stevig op de zijkant van de kolven om de cellen te Verdoe- Controleer onder een lichte Microscoop voor vrij zwevende myoblasten.
6. Plaats de kolven rechtop in een weefselkweek kapje en spoel de bodem van de kolven af met 10 mL Myoblast Media 2-3 keer om ervoor te zorgen dat alle cellen worden ontzet.
7. Verzamel het celmengsel in een centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer 3 min bij 200 x g.
8. Aspireren de media tot ongeveer 1 mL, voorzichtig om te voorkomen dat de celpellet. Voeg voorzichtig een geschikt volume Myoblast media toe aan centrifugebuis en meng zachtjes.
9. Verdeel het celmengsel naar de nieuwe T75 kolven. Voeg 10 mL Myoblast media toe aan elke nieuwe T75 kolf. Schud de kolven horizontaal om de cellen 's nachts te verdelen en in de 37 °C-incubator te plaatsen.
10. Twee dagen later, door de passage opnieuw met PBS, splitst u elke T75 kolf op in drie T75 kolven.
    Opmerking: Sta myoblasten niet toe om meer dan 50%-60% Confluent te worden, omdat dit ertoe zou leiden dat ze beginnen te differentiëren en de capaciteit van de prolifaterive verliezen.
11. Voor extra passages, gebruik trypsine. Tweemaal met PBS-opbrengst > 95% myoblasten; pogingen om de zuiverheid verder te verbeteren neigt tot een slechtere differentiatie.

4. differentiatie van primaire Myoblasten voor Myotubes

1. Plaat P2 (of latere passage) myoblasten in Myoblast media op gecoate platen (Zie tabel 1 voor voorgestelde coating-en plating volumes en celnummers). Twee of drie dagen later, wanneer cellen 70-80% confluency zijn, verander de media in differentiatie media (24 mL DMEM, 24 mL hammen F12, 1,5 mL warmte geïnactiveerd paarden serum, 0,5 mL insuline-selenium-Transferrin).
2. Verander differentiatie media om de andere dag tijdens differentiatie van primaire myoblasten in myotubes. Differentiatie is meestal voltooid door dag 4-5 en zal worden gemarkeerd door langwerpige, gesmolten cellen die spontaan twitch. Voer experimenten uit op gedifferentieerde myotubes binnen 6 dagen. Doorgaans worden cellen vijf of zes dagen na het starten van differentiatie getest.

5. meten van het zuurstofverbruik in Myoblasten of Myotubes in 96-well Plates

1. Coat 96-well platen met 25 μL coating oplossing per put. Centrifugeer de platen op 58 x g gedurende 1 minuut om eventuele bubbels te verwijderen.
2. Inbroed de platen in coating oplossing voor 1-4 h bij 4 °C. Gebruik meerkanaals pipet om de coating oplossing te verwijderen en was driemaal in 25 μL koude PBS/gentamicine. Centrifugeer ten minste één van deze wasses om ervoor te zorgen dat er geen bubbels gevangen zitten.
3. Voeg aan elke put 40 μL differentiatie media toe. Centrifuge de media op de gecoate plaat zonder cellen gedurende 1 minuut bij 58 x g om bubbels te voorkomen en oppervlaktespanning te verwijderen om een uniforme laag van media te krijgen.
4. Voeg cellen die zijn opgehangen in een extra 40 μL media toe aan elke put. Draai opnieuw op 58 x g.
   Opmerking: Consistentie in plating is belangrijk voor de beste resultaten en het aantal cellen per put moet worden geoptimaliseerd voor elke experimentele Setup, en zal waarschijnlijk worden in het bereik van ~ 10000-25000 myoblasten verguld in differentiatie media per put van een 96-goed plaat.
5. Verander de media tijdens het differentiëren dagelijks zachtjes. Zuig de media niet op, maar verwijder deze liever met een pipet, laat een klein volume achter om te voorkomen dat de cellen worden ontlucht of blootstelling aan de Air. Vervang bijvoorbeeld 50 μL per keer voor drie herhalingen in plaats van alle 80 μL tegelijk.
6. Gebruik 8-15 Wells per conditie. Het kan nodig zijn om sommige putten achterwege te laten als cellen geen uniforme laag van myotubes vormen.
   Opmerking: Laat putten weg op de randen van de plaat omdat ze zeer gevoelig zijn voor verdamping. Varieer de plaat opstelling voor experimentele replicaten om systematische fouten te voorkomen.
7. Voer de gewenste test uit op gedifferentieerde myotubes binnen 1-2 dagen na volledige differentiatie (dag 4-6 vanaf begin van differentiatie). De aanbevolen instrumenten en reagentia voor het meten van het zuurstofverbruik worden vermeld in de tabel met materialen.

Results

In de volgende sectie 1 van het opgegeven protocol moeten primaire cellen worden bereikt die uit de explantaten komen die zichtbaar zullen zijn onder een standaard lichtmicroscoop (Figuur 2). Er zal een heterogene celpopulatie worden gezien die groeit uit en rond elke spierweefsel explant. Myoblasten zullen verschijnen als kleine, ronde, heldere bollen. Na deel 2 van het Protocol zullen vroege oogsten van myoblasten uit weefsel Explants opleveren, die weinig ...

Discussion

Skeletspieren is van vitaal belang voor de oprichting en het onderhoud van metabole homeostase¹¹. De studie van spier fysiologie is gecompliceerd door interindividuele variabiliteit, evenals moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, met name in het geval van menselijke studies. Gekweekte primaire myotubes is aangetoond dat het even vele kenmerken van spier fysiologie, met inbegrip van calcium homeostase¹², regeneratie van beschadigde spierweefsel⁵

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 12,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 12,5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; kan worden gekocht als reguliere FBS en warmte-geïnactiveerd door 20 minuten in een 40 °C waterbad te plaatsen
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 17,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 17,5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; kan worden gekocht als reguliere FBS en warmte-geïnactiveerd door 20 min in een 40 °C waterbad te plaatsen
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Voeg altijd voor gebruik gentamicine toe (1:1.000 op volume); 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum	Sigma	H1138	1,5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin	Life Technologies	41400045	0,5 mL
Other Materials:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Bereid als 10% DMSO in Myoblast Media voor het invriezen van cellen
Forceps	Any
Razor Blades	Any
Scissors	Any
Whatman paper	VWR	21427-648
60 mm plate	VWR	734-2318
10 cm plate	VWR	25382-428 (CS)
T25 Flasks	ThermoFisher	156367
T75 Flasks	ThermoFisher	156499
Centrifuge Tubes (15 mL)	BioPioneer	CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	Instrument gebruikt om zuurstofconsumptiepercentages te meten, uitgelezen door acidificatie van de extracellulaire media
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-well platen voor gebruik in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	onderdelen kunnen worden gekocht bij andere leveranciers zodra het assay is vastgesteld; enkele aanbevelingen staan hieronder vermeld
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	onderdelen kunnen worden gekocht bij andere leveranciers zodra het assay is vastgesteld; enkele aanbevelingen staan hieronder vermeld
Palmitic acid	Sigma	P5585-10G	voor het meten van vetzuuroxidatie
Carnitine	Sigma	C0283-5G	voor het meten van vetzuuroxidatie
Etomoxir	Sigma	E1905	voor het meten van vetzuuroxidatie
BSA	Sigma	A7030	gebruikt als controle of in combinatie met palmitinezuur voor het meten van vetzuuroxidatie