Methodenartikel

Virale RNA/DNA in situ hybridisatietoepassingen van de volgende generatie in onderzoek naar humaan immunodeficiëntievirus/simian immunodeficiëntievirus

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60318

⸱

17 juni 2020

 ,  ,  , 
1AIDS and Cancer Virus Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research Inc., 2Vaccine and Gene Therapy Institute and Oregon National Primate Research Center (ONPRC), Oregon Health and Science University (OHSU)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een in situ hybridisatietest van de volgende generatie om specifieke virale RNA- of DNA-sequenties te identificeren in in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. Deze benadering maakt visualisatie mogelijk van lage kopieën van RNA en DNA in minder dan 24 uur met een zeer hoge gevoeligheid en specificiteit.

Samenvatting

In situ hybridisatie is een krachtige techniek om specifieke RNA- of DNA-sequenties in individuele cellen in weefselsecties te identificeren, wat belangrijke inzichten oplevert in fysiologische processen en pathogenese van de ziekte. In situ hybridisatie (ISH) wordt al vele jaren gebruikt om de locatie van door virussen geïnfecteerde cellen te beoordelen, maar onlangs is een ISH-benadering van de volgende generatie ontwikkeld met een unieke sondeontwerpstrategie die gelijktijdige signaalversterking en achtergrondonderdrukking mogelijk maakt om visualisatie van één molecuul te bereiken met behoud van weefselmorfologie. Deze ISH van de volgende generatie is gebaseerd op een benadering zoals vertakte PCR, maar dan in situ uitgevoerd en is gemakkelijker, gevoeliger en reproduceerbaarder dan klassieke ISH-methoden of in situ PCR-benaderingen bij het routinematig detecteren van RNA of DNA in formaline-gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. De afgelopen jaren heeft ons laboratorium dit ISH-platform toegepast voor de detectie van humaan immunodeficiëntie (HIV) en simian immunodeficiency (SIV) viraal RNA (vRNA) en/of viraal DNA (vDNA) positieve cellen in een groot aantal FFPE-weefsels. Met dit gedetailleerde technische manuscript willen we onze kennis en advies delen met alle individuen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de volgende generatie ISH in hun onderzoek.

Inleiding

ISH is de experimentele benadering die wordt gebruikt voor het richten en visualiseren van complementaire DNA-, RNA- of gemodificeerde nucleïnezuurstrengen (d.w.z. sondes) voor specifieke DNA- of RNA-sequenties in een cel of weefselsectie. ISH maakt de specifieke lokalisatie en visualisatie van specifieke nucleïnesequenties in weefsels mogelijk, wat belangrijk is om het expressieniveau, de organisatie, de distributie en de interacties tussen het doelwit en zijn cellulaire omgeving te begrijpen, wat waardevolle informatie is die niet kan worden verkregen met het gebruik van andere populaire technieken, zoals qPCR. Tot voor kort werd ISH vaak uitgevoerd met een gelabeld complementair DNA of een complementair RNA (riboprobe). Deze sondes werden ofwel direct geconjugeerd met radio-, fluorescentie- of antigeen-gelabelde basen (bijv. 35S, FITC en digoxigenine) en vervolgens gelokaliseerd en gekwantificeerd in het weefsel met behulp van respectievelijk autoradiografie, fluorescentiemicroscopie of immunohistochemie detectiebenaderingen. Hoewel deze in-situ technologieën waardevolle benaderingen blijven, is er voldoende ruimte voor verbetering om benaderingen te ontwikkelen die minder arbeidsintensief, eenvoudiger, sneller, gevoelig en specifiek zijn.

Een alternatieve commerciële ISH-benadering van de volgende generatie (bijv. RNAscope-test), voor het eerst beschreven in 2012, voor de detectie van host messenger RNA (mRNA) is gebaseerd op vertakte PCR. De mRNA-detectie wordt uitgevoerd in FFPE-cellen en -weefsels, met een gevoeligheid die de visualisatie van een enkelvoudig RNA-molecuul in individuele cellenbenadert 1. De specificiteit van deze benadering wordt bereikt onder de unieke voorwaarde dat twee dubbel-Z-doelsondes aaneengesloten binden aan hun respectievelijke complementaire RNA- (of DNA)-sequenties voor een signaalvoorversterker om achtereenvolgens1 te binden. Dit maakt het mogelijk om een signaalversterkingscascade te initiëren via daaropvolgende hybridisatiestappen die vergelijkbaar zijn met vertakt DNA (bDNA)1,2. Bovendien is deze aanpak opmerkelijk snel en gemakkelijk, met resultaten verkregen in slechts 1 dag (<8 uur), een aanzienlijk voordeel in vergelijking met maximaal 4 weken met alternatieve technieken, waaronder Radio-ISH 1,2. Deze next-generation ISH heeft nieuwe perspectieven en kansen geopend voor HIV/SIV-onderzoek. De belangrijkste obstakels voor een hiv-genezing zijn de cellulaire en weefselreservoirs die tijdens de vroege stadia van de ziekte worden aangelegd 3,4. Het algemene doel van deze techniek is het identificeren, lokaliseren en uiteindelijk begrijpen van de belangrijkste weefselcompartimenten die fungeren als een viraal reservoir en persistent zijn in een geïnfecteerde gastheer. Dit zal op zijn beurt helpen bij de ontwikkeling van effectieve genezingsstrategieën tegen HIV.

In dit manuscript leggen we ons duplex next-generation RNA/DNA multiplex ISH-protocol (bijv. RNAscope/DNAscope) in detail uit en leggen we uit hoe we het bestaande RNA ISH-protocol hebben aangepast om de ISH van de volgende generatie te optimaliseren voor onze monsters en specifieke doelen. Dit protocol maakt visualisatie, lokalisatie en kwantificering van HIV/SIV viraal RNA en viraal DNA mogelijk binnen weefselsecties van 5 μm. Gelijktijdige visualisatie van zowel vRNA als vDNA wordt uitgevoerd door twee aangepaste sondesets te combineren: één sense, gericht op de vDNA-coderende streng (C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense-sonde [416141-C1]), en één anti-sense, gericht op vRNA-transcripten (C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense-sonde [416131-C2]) die verschillende regio's van het virale genoom bestrijkt (Tabel 1), met behulp van twee verschillende visualisatiekanalen, C1 en C2. In dit protocol stellen de kanalen C1 en C2 ons in staat om signalen in verschillende kleuren te visualiseren (d.w.z. AP in rood en HRP in bruin) en de sondes met verschillende benaderingen te detecteren. Exclusief de weefselfixatie, verwerking en snijden duurt deze test 2 dagen. Hier wordt het duplex vRNA en vDNA in situ hybridisatieprotocol gepresenteerd dat kan worden uitgevoerd op celpellets of weefselsecties.

Protocol

1. Voorbereiding van secties en dia's

  1. Snijd de paraffineblokken af en snijd met een microtoom 5 secties van +/-1 μm. Monteer de secties of celpellets op geladen microscoopglaasjes in een RNasevrij waterbad van 40-45 °C. Laat de glaasjes een nacht aan de lucht drogen bij 37 °C of RT.
    OPMERKING: De objectglaasjes kunnen maximaal 3 maanden worden bewaard bij kamertemperatuur (RT) en 6 maanden bij 4 °C.
  2. Deparaffinize FFPE glaasjes.
    1. Bak de glacanades 1 uur in een droge oven op 60 °C.
    2. Vul in een zuurkast twee dia-kleurschaaltjes met ~200 ml vers xyleen en twee extra kleurschaaltjes met ~200 ml verse 100% ethanol. Dek de bakjes af met deksels.
    3. Plaats de glaasjes in een rooster en dompel ze onder in de eerste xyleenhoudende schaal. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij RT met agitatie.
    4. Plaats de glaasjes in de tweede xyleenhoudende schaal en incubeer gedurende 5-10 minuten bij RT met roeren.
    5. Plaats de glaasjes onmiddellijk in de schaal met 100% ethanol. Incubeer de dia's gedurende 5-10 minuten bij RT met agitatie.
    6. Plaats de objectglaasjes onmiddellijk in de tweede schaal met 100% ethanol en incubeer gedurende 5-10 minuten bij RT met roeren.
    7. Verwijder het rek van de ethanol, tik voorzichtig op de zijkant van het rek om overtollige ethanol te verwijderen en spoel 5-15 minuten af met RNasevrij water.

2. Bereiding van de oven

  1. Zet de hybridisatieoven aan en stel de temperatuur in op 40 °C.
  2. Leg een doek of stevige absorberende papieren handdoek in een bakje en maak volledig nat met dubbel gedestilleerd water om de vochtigheid te kunnen regelen.
  3. Plaats de afgedekte bakplaat in de oven en sluit de ovendeur. Verwarm de bakplaat voor gebruik minimaal 30 minuten op 40 °C. Bewaar de bakplaat in de oven als deze niet in gebruik is.

3. Door hitte geïnduceerde epitoopextractie

  1. Bereid een op 0,5x citraat gebaseerde ISH-hybridisatiebuffer voor het ophalen van doelen voor (10 nmol/L, pH = 6, zie materiaaltabel). Breng het in een bekerglas op de verwarmingsplaat aan de kook.
  2. Voer door warmte geïnduceerde epitoopverwijdering uit door de objectglaasjes gedurende 30 minuten in de kokende buffer voor het ophalen van het doel te plaatsen.
  3. Verwijder de dia's uit de buffer voor het ophalen van het doel en was ze onmiddellijk in dubbel gedestilleerd water. Dehydrateer 5 minuten in 100% ethanol voordat u het aan de lucht droogt.
  4. Zodra de objectglaasjes aan de lucht zijn gedroogd, brengt u een hydrofobe barrièrepen aan om het weefselgedeelte op de objectglaasje te omsluiten. Zorg ervoor dat de hydrofobe barrière volledig aan de lucht droogt.

4. Protease voorbehandeling

  1. Plaats de gedroogde objectglaasjes op een rek met vergrendelbare dia's en bereid vervolgens de protease-voorbehandelingsreagentia (protease-digestieoplossing, 2,5 μg/ml) voor door ze te verdunnen met steriele, koude, PBS in een verhouding van 1:5. Meng goed.
    OPMERKING: Drie verschillende proteaseragentia met verschillende concentraties worden meegeleverd in de in de handel verkrijgbare kit. Protease III (standaard), Protease IV (sterk) en Protease Plus (mild). Test empirisch de verteringstijd en verdunning van protease voorafgaand aan implementatie in een onderzoek, omdat optimale omstandigheden zullen variëren op basis van weefseltype, fixatie en dikte (zie Discussie).
  2. Doseer de verdunde proteaseoplossing op objectglaasjes om de weefselcoupes volledig te bedekken. Incubeer de objectglaasjes onmiddellijk 20 minuten bij 40 °C in een oven (voorbereid in stap 1.4) en zorg ervoor dat de objectglaasjes in de vochtige hybridisatiebak worden verzegeld. Laat de weefselsecties niet uitdrogen voor de rest van het protocol.
  3. Spoel onmiddellijk 3x af door het vergrendelbare schuifrek onder te dompelen in een wasbak gevuld met dubbel gedestilleerd water.
  4. Voer het endogene peroxidaseblok uit door de peroxidase-oplossing op elk weefselgedeelte te laten vallen om het volledig te bedekken. Incubeer de dia's gedurende 10 minuten bij RT. Als je klaar bent, spoel je de secties 3x af in dubbel gedestilleerd water.

5. Sondehybridisatie en signaalversterking

OPMERKING: Om verdamping te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de door vocht gecontroleerde bak goed wordt afgesloten, zodat de tissues niet uitdrogen tijdens de incubatiestappen. Plaats de vochtigheidskamer tijdens de wasstap terug in de oven om ervoor te zorgen dat deze op 40 °C blijft.

  1. Meng de C2-sonde en de C1-sonde in een verhouding van 1:50 door 1 volume C2-sonde op 50 volumes C1-sonde in een buis te pipetteren, zoals voorgesteld door de fabrikant. Keer de tube meerdere keren om. Verwarm het mengsel van de doelsonde voor ~10 minuten in een oven van 40 °C om eventueel neerslag op te lossen voor gebruik.
    OPMERKING: De mixed target-sondes kunnen maximaal 4 maanden bij 6 °C worden bewaard.
  2. Haal de glijbanen uit het water. Spoel af en tik of tik op de dia's om overtollig water uit de weefselsecties te verwijderen. Doseer de sonde onmiddellijk op de objectglaasjes en zorg ervoor dat elk weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer het sondemengsel een nacht in de vochtigheidskamer bij 40 °C.
  3. Haal de volgende dag de glaasjes uit de oven en plaats ze 5 minuten in de wasbak met 0,5x wasbuffer bij RT. Herhaal de wasstap nog een keer.
  4. Haal de glaasjes uit de wasbuffer. Spoel af en tik of tik op de dia's om overtollig wasbuffer van de tissuesecties te verwijderen.
  5. Doseer commercieel AMP 1-reagens klaar voor gebruik (2 nmol/L) in hybridisatiebuffer B (20% formamide, 5x SSC, 0,3% lithiumdodecylsulfaat, 10% dextraansulfaat, blokkerende reagentia) op de objectglaasjes, zodat de weefselsectie volledig wordt bedekt zonder luchtbellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 40 °C in de vochtigheidskamer. Herhaal de stappen 1.6.3-1.6.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  6. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 2. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes gedurende 15 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  7. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 3. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes 30 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  8. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 4. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes gedurende 15 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  9. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 5. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes 30 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  10. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 6. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes gedurende 15 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  11. Spoel de objectglaasjes voor detectie één keer af in 1x TBS-Tween 20 (0,05% v/v). Haal de glaasjes uit de wasbuffer, spoel ze af en tik of tik op de dia's om overtollig wasbuffer van de tissuesecties te verwijderen. Plaats direct in de wasbak gevuld met 1x TBS-Tween buffer.

6. Detectie van doelsignaal in kanaal 1 (C1)

OPMERKING: Dit wordt uitgevoerd met behulp van de rode alkalische fosfatase en snelle rode chromogenamplificatie 6 uit 2-plex detectiekits (zie materiaaltabel) die alkalische fosfataselabels en chromogene detectie bevatten. Het gebruikt snel rood als substraat om een rood signaal te genereren.

  1. Bereid snelle rode (FR) werkoplossing met behulp van een verdunning van 1:60 van Fast RED-B tot Fast RED-A. Meng goed. Om neerslag te verminderen en een schoner signaal te verkrijgen, filtreert u de chromogeenoplossing met behulp van een spuit door een MCE-membraan van 0,45 μm.
    OPMERKING: Gebruik de Fast RED-B oplossing binnen 5 minuten. Niet blootstellen aan direct zonlicht of UV-licht.
  2. Verwijder de objectglaasjes van de TBS-Tween, spoel ze af en tik of tik op de objectglaasjes om overtollige buffer van de weefselsecties te verwijderen.
  3. Doseer gemengde, gefilterde FR-oplossing op elke weefselsectie en zorg ervoor dat elke sectie volledig bedekt is. Incubeer 6-8 minuten bij RT. Observeer onder microscoop.
  4. Spoel de dia's 2x uit in 0,5x wasbuffer. Haal de glaasjes uit de wasbuffer, spoel ze af en tik of tik op de dia's om overtollig wasbuffer van de tissuesecties te verwijderen.
  5. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 7. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes gedurende 10 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  6. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 8. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes gedurende 15 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  7. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 9. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes 30 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.
  8. Doseer in de handel verkrijgbare AMP 10. Zorg ervoor dat het weefselgedeelte volledig bedekt is zonder luchtbellen. Incubeer de objectglaasjes 30 minuten in de vochtigheidskamer bij 40 °C. Herhaal stap 5.3-5.4 en voer de wasbeurt elk 2 minuten uit.

7. Kanaal 2 (C2) detectie van doelsignaal

OPMERKING: Dit wordt uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare bruine HRP- en DAB-chromogenkits (zie materiaaltabel). De amplificatie 10 van de 2-plex-detectie bevat mierikswortelperoxidase-labels en chromogene detectie wordt uitgevoerd met behulp van DAB om een bruin signaal te genereren.

  1. Gebruik voor een optimale detectie van het DAB-signaal in de handel verkrijgbare kits en volg de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Observeer onder een microscoop.
    LET OP: DAB is giftig. Volg de juiste voorzorgsmaatregelen en veiligheidsrichtlijnen bij het hanteren en weggooien van deze chemische stof.

8. Tegenbeitsen en monteren

  1. Bestkleur de objectglaasjes met hematoxyline.
    1. Weeg de objectglaasjes gedurende 30 s tegen met 50% vers gefilterd hematoxyline terwijl u de objectglaasjes roert. Dia's worden paars weergegeven. Spoel onmiddellijk af met stromend water terwijl u de glijbanen op en neer beweegt totdat het water helder is. De weefselcoupes blijven paars.
    2. Om een beter contrast te verkrijgen, plaatst u dia's met een tegenslag gedurende 1 minuut in gedestilleerd water dat verzadigd is met lithiumcarbonaat. Spoel minimaal 3x grondig af met stromend water terwijl u de glijbanen roert. Gebruik dubbel gedestilleerd water voor de laatste spoeling.
    3. Omdat FR gevoelig is voor organische oplosmiddelen, moeten objectglaasjes die met FR zijn gekleurd, worden afgedekt met montagemedium op waterbasis en een nacht bij RT worden gedroogd.
  2. Monteer de dia's.
    1. Zorg ervoor dat de weefselsecties bedekt met montagemedium op waterbasis droog zijn.
    2. Dompel dia's in xyleen voordat het deksel wegglijdt met behulp van montagereagens. Zorg ervoor dat u eventuele luchtbellen tussen het dekglaasje en het tissuegedeelte voorkomt of verwijdert en laat 16 uur drogen bij RT.

9. Kwantitatief beeldanalyseprotocol voor RNAscope met behulp van CellProfiler5

  1. Kortom, zorg ervoor dat de software hematoxyline- en FR-vlekken in afzonderlijke afbeeldingen scheidt. Identificeer en meet de objecten van belang: kernen, virionen, positieve cellen en geaggregeerde FR-positieve kleuring. Sla metingen op in een CSV-bestand en sla de geanalyseerde afbeelding op.
  2. Selecteer de optie "Kleuren onmengen", waarmee vlekken worden gescheiden en het oorspronkelijke interessegebied (ROI) wordt opgesplitst in afzonderlijke hematoxyline- en FR-afbeeldingen.
  3. Als hemosiderine, tatoeage of soortgelijke kenmerken de analyse verstoren, voeg dan een tweede "Unmix"-stap toe met hematoxyline, FR en DAB. Gebruik de tweede FR-afbeelding om de meest intense FR-pixels te vinden. Deze tweede afbeelding zal worden gebruikt als een masker voor echte FR-kleuring.
  4. Optioneel kunt u de bevlekte afbeeldingen gladstrijken voordat u ze drempels vastlegt. Dit is een empirische beslissing en niet altijd nodig. Drempelwaarde voor de afzonderlijke gekleurde afbeeldingen met behulp van "IdentifyPrimaryObjects" om positieve pixels te selecteren.
  5. Identificeer de drie verschillende soorten objecten (virion, virion-aggregaten, productieve cel).
    1. Zorg ervoor dat de kernen objecten met een diameter van 4-100 pixels (px) zijn die zijn gekleurd met hematoxyline. Ontklonteren en gaten opvullen na het drempelen. "IntenseFastRed"-objecten hebben een diameter van 4-100 px en omvatten virionen, positieve cellen en geaggregeerde positieve kleuring, zoals te zien op folliculaire dendritische cellen (FDC's) in B-celfollikels (BCF). Deze afbeelding wordt gebruikt om valse positieven (bijv. hemosiderine) uit te filteren.
    2. Zorg ervoor dat FR kleine positieven objecten met een diameter van 2-12 px zijn. Deze meting omvat virionen en vDNA+-cellen. Gooi alle voorwerpen buiten dit bereik weg. Ontklonteren en gaten opvullen na het drempelen.
    3. Zorg ervoor dat FR grote positieven: objecten met een diameter van 9-100 px. Deze meting omvat vRNA+-positieve cellen en geaggregeerde positieve kleuring. Uitklonteren na drempelwaarden. De grootte van kleine en grote FR-positieve objecten kan elkaar overlappen. Ze worden in een latere stap gescheiden.
      OPMERKING: De software (bijv. Cellprofiler) gebruikt pixels voor objectgroottes, en de pixels die hier worden gebruikt, zijn afgeleid van dia's die zijn gescand met 0,2510 μm/pixel (40x).
  6. Definieer en extraheer resultaten.
    1. Nadat objecten zijn geïdentificeerd, definieert en extraheert u de resultaten voor het aantal virionen, productieve geïnfecteerde cellen en kernen.
    2. Identificeer virionen door FastRedSmallPositives te maskeren met het IntenseFastRed-object dat is ingesteld om valse positieven (bijv. hemosiderine) te verwijderen.
    3. Identificeer vervolgens de positieve cellen en aggregeer de FR-positieve kleuring. Verwijder valse positieven en virionen uit FastRedLargePositives door deze te maskeren met IntenseFastRed en met de virion-objectset.
    4. Extraheer positieve cellen uit de verfijnde FastRedLargePositives door opnieuw te maskeren met Nuclei. Splits objecten die elkaar niet meer raken en filter de resultaten op objectgebied, waarbij kleine objecten worden verwijderd (≤6 px). Dit verwijdert de stippen die ontstaan door de overlapping van de kernen te maskeren. Het resultaat zijn de positieve cellen.
    5. Definieer ten slotte geaggregeerde FR-positieven. In deze stap wordt gebruikgemaakt van IdentifyTertiaryObjects, waarmee objecten worden gezocht die zijn opgenomen in een groter bovenliggend object. In dit geval is de verfijnde FastRedLargePositives-objectset de bovenliggende en worden positieve cellen afgetrokken.
  7. Tel het aantal virionen en positieve cellen.
  8. Meet het geaggregeerde positieve gebied en converteer het van pixels naar mm2. Registreer optioneel het gebied dat wordt ingenomen door virionen en positieve cellen in mm2 als de analyse het gebruik van standaardcellen en viriongroottes vereist in plaats van directe tellingen.
  9. Leg de positieve objecten over de originele afbeelding en sla het resultaat op.
    OPMERKING: De ISH-gegevens worden gerapporteerd door het aantal virionen per 106 kernen (cellen) en het aantal productief geïnfecteerde vRNA+-cellen per 106 kernen (cellen) voor een beter begrip en om vergelijking met qPCR-gegevens te vergemakkelijken, maar resultaten kunnen ook worden gerapporteerd per weefselgebied in mm2.

Resultaten

In een vorig manuscript 2,6,7,8,9,10,11 meldden we dat de volgende generatie ISH-platforms die vRNA of vDNA detecteren, kunnen worden gecombineerd, met behulp van sense-sondes (vDNA) die gericht zijn op het 5' gag-pol-gedeelte van het SIV/HIV-genoom en antisense-sondes (vRNA) die gericht zijn op genen in de 3' helft van het genoom (vif, vpx, vpr, tat, env en nef) evenals het TAR-element in het 5'-genoom (Tabel 1). Deze benadering onderscheidt transcriptioneel actieve cellen (vRNA+, vDNA+) van transcriptioneel inactieve (vermeend latent) geïnfecteerde cellen of cellen die transcriptioneel incompetente provirussen (vRNA-, vDNA+) herbergen in hetzelfde weefselsectie2 (Figuur 1).

figure-results-1
Figuur 1: Detectie van viraal RNA en vDNA in hetzelfde weefselgedeelte. Combinatie van zowel RNA-hybridisatie (rood) als DNA-hybridisatie (bruin) assay in een acuut SIV-geïnfecteerde RM-lymfeklier die het vermogen aantoont om vRNA en vDNA in hetzelfde weefselgedeelte te detecteren en een krachtige benadering biedt om transcriptioneel stille vDNA+ vRNA-cellen in situ te identificeren. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Deleage C. et al.2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Enkele Plex RNA/DNAscope-sondesets
NaamACD-catalogus #Aantal ZZBeschrijving
SIVmac239 (Anti-Zin)31281183Anti-sense sonde gericht binnen 1251-9420bp van D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env en nef)
SIVmac239 (Zin)31407183Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 1251-9420bp van D01065.1 (gag, pol, vif, vpx, vpr, tat, env en nef)
V-HIV1-Clade A (Anti-Sense)41610180Anti-sense sonde gericht binnen 879-7629bp van HIV-1 Clade A Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env en nef)
V-HIV1-Clade A (Zin)42634180Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 879-7629bp van HIV-1 Clade A Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env en nef)
V-HIV1-Clade B (Anti-Sense)41611178Anti-sense sonde gericht binnen 854-8291bp van AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env en nef)
V-HIV1-Clade B (Zin)42553178Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 854-8291bp van AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env en nef)
V-HIV1-Clade D (Anti-Sense)41612176Anti-sense sonde gericht binnen 894-7697bp van HIV-1 Clade D Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
V-HIV1-clade D (Sense)42635176Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 894-7697bp van HIV-1 Clade D Consensus (gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef)
Multi-Plex RNA/DNAscope-sondesets
NaamACD-catalogus #Aantal ZZBeschrijving
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1EUR-Lex - 416141-C1 - NL40Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 1251-4093bp van D01065.1 (gag en pol)
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 (Anti-zin)EUR-Lex - 416131-C2 - NL47Anti-sense sonde gericht binnen 5381-10257bp van D01065.1 (vif, vpx, vpr, tat, env, nef en het TAR-element)
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1EUR-Lex - 444051-C1 - NL40Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 854-3940bp van AF324493.2, HIV-1 Clade B NL4-3 (gag en pol)
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-zin)EUR-Lex - 444061-C2 - NL40Anti-sense sonde gericht binnen 5042-9673bp van AF324493.2,, HIV-1 Clade B NL4-3 (vif, vpr, tat, env, nef en het TAR-element)
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1EUR-Lex - 444021-C1 - NL48Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 888-5032bp van HIV-1 Clade C-consensussequentie (gag en pol)
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-zin)EUR-Lex - 444041-C2 - NL49Anti-sense sonde gericht binnen 5078-9698bp van HIV-1 Clade C consensussequentie (vif, vpr, tat, env, nef en het TAR-element)
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1EUR-Lex - 444011-C1 - NL55Sense-sonde gericht op omgekeerde streng binnen 890-4812bp van AF259954.1, HIV-1 Clade AE (gag en pol)
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 (Anti-zin)444031-C257Anti-sense sonde gericht binnen 5052-9694bp van AF259954.1, HIV-1 Clade AE (vif, vpr, tat, env, nef en het TAR-element)

Tabel 1: Lijst van sondes om vRNA en vDNA van HIV-1 en SIV te targeten.

Discussie

In situ hybridisatie is een nauwgezette test die nauwkeurigheid en basiskennis van nucleïnezuurchemie, celbiologie en histologie vereist om elke kritieke stap te kunnen aanpassen om een doelwit te lokaliseren in een goed geconserveerde omgeving. In deze discussie willen we de kritieke stappen belichten waarbij probleemoplossing cruciaal is om nauwkeurige en interpreteerbare resultaten te verkrijgen.

De fixatie en verwerking van de weefsels zijn van cruciaal belang en moeten van tevoren worden aangepakt om ervoor te zorgen dat de test de beste resultaten kan opleveren. Neutraal gebufferd PFA (4% vers bereid) fixatief is optimaal voor de duplex-test. De test kan echter ook worden uitgevoerd op ingevroren weefsels (OCT) met de juiste fixatiecondities na cryosectie.

Voorbehandeling van de weefselcoupes is een cruciale stap. Er zijn twee voorbehandelingsstappen in deze test: de eerste is een door warmte geïnduceerde epitoopextractie (HIER). Deze stap is belangrijk voor het omkeren van de dwarsverbanden van de methyleenbrug en het herstel van eiwitstructuren, wat nodig is in gefixeerde weefsels. De efficiëntie van deze behandeling is afhankelijk van de tijd, temperatuur, type ophaalbuffer en pH. De tweede voorbehandeling is een protease-geïnduceerde epitoopextractie (PIER). Deze stap splitst peptiden, waardoor het antigeen of nucleotiden blootliggen, en maakt gebruik van enzymen zoals proteïnase K, trypsine en pepsine. Dit is een uiterst gevoelige stap die mogelijk zowel de weefselmorfologie als het doelwit van interesse kan beschadigen. De concentratie van het enzym, evenals de tijd en temperatuur van incubatie zijn van cruciaal belang in dit proces. Oververtering leidt tot een slechte afbakening van kernen en moeilijkheden bij kwantificeringsstappen. Het is van cruciaal belang om een evenwicht te vinden tussen optimale toegang tot het RNA/DNA-doelwit en voorbehandelingsomstandigheden die het weefsel of het doelwit van belang niet beschadigen. Elk weefseltype heeft een ander gevoeligheidsniveau voor elk van deze voorbehandelingen en elke parameter (enzymconcentratie, tijd, temperatuur) moet empirisch worden getest.

De strengheid van de wasbuffer is gebaseerd op drie belangrijke parameters: temperatuur, concentratie van zouten en wasmiddel en tijd. De wasbuffer is een zoute natriumcitraatbuffer (SSC) en de zoutconcentratie in de buffer regelt de strengheid tijdens de wasstappen. In hun protocol adviseert ACD om de wasbuffer te gebruiken bij een eindconcentratie van 0,1x SSC, 0,03% lithiumdodecylsulfaat. Terwijl we werkten aan DNAscope- en multiplex-optimalisatie, stelden we vast dat het gebruik van de wash-buffer met een eindconcentratie van 0,05x SSC ons betere resultaten gaf om het DNA-signaal te visualiseren en aanzienlijk hielp bij het verminderen van niet-specifieke off-target hybridisatie als gevolg van de nachtelijke incubatie van de sense-sonde.

De keuze van de detectiebenadering, chromogeen (rood of bruin) versus fluorescentie, moet worden doordacht op basis van weefseltype en doel voordat met de test wordt begonnen. De rood chromogene benadering geeft een mooi contrast, omdat rood van nature niet in weefsels voorkomt. Bruin chromogeen geeft vergelijkbare resultaten als rood chromogeen. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat sommige bloedafbraakproducten die in het weefsel aanwezig zijn, een vergelijkbare kleur hebben en dat tatoeage-inkt tijdens het kwantificeren moeilijk te scheiden is van het bruine signaal. Een fluorescentiedetectiebenadering zal een duidelijk onderscheid maken tussen verschillende cellulaire markers en de multiplexing zal een perfecte test bieden om de cellen die vRNA en/of vDNA herbergen te fenotyperen.

Er zijn meerdere controles nodig om de specificiteit van de sondes en de kwaliteit van de test te waarborgen. Elke nieuw ontworpen sonde moet worden getest op bekende positieve en negatieve controleweefsels of celpellets. We genereren vaak plasmiden die onze gerichte sequentie bevatten en voeren transfectie uit in cellijnen om positieve controles te genereren. Voor elke run voegen we een bekend negatief weefsel (HIV of SIV-negatief) toe, een controle zonder sonde die alleen het sondeverdunningsmiddel bevat, en een met RNase behandelde controle om de kwaliteit en specificiteit van de test te garanderen.

De kwantificering is een uiterst belangrijke stap en moet worden uitgevoerd met behulp van de juiste tools en algoritme op basis van de gestelde vraag. In dit manuscript presenteerden we een beeldanalysesoftware (bijv. Cellprofiler), die we kozen na evaluatie van meerdere opties. We schatten dat deze software de beste software was voor onze behoeften, maar er zijn tal van softwareprogramma's voor beeldanalyse die kunnen worden gebruikt.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project is volledig gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contractnr. HHSN261200800001E en door de Oregon National Primate Research Center NIH grant award P51OD011092 (J.D.E). De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch impliceert de vermelding van handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid. De duplex is ontwikkeld met behulp van Advanced Cell Diagnostics.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACD HybEZII Hybridization system (110V) with ACD EZ-Batch Slides systemACD321710Hybridisatieoven
CAT HematoxylinBiocare medicalCATHE-GALkleuring
Clear-MountELECTRON MICROSCOPY SCIENCES17985-15montagereagens voor rode chromogeen
Immpact DAB Peroxidase KitVectorSK-4105Wordt gebruikt om HRP - DAB (bruin) te onthullen ter vervanging van de DAB die in het ACD-kit zit
lithium carbonaatFisher chemicalL119-500blauwmakende oplossing
paraformaldehydeELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15714-Svoor weefselfixatie (4%)
PBSlife technology14190-136
Permount MontagemediumThermoFisher ScientificSP15-100montagereagens voor bruin chromogeen
Prolong GoldThermoFisher ScientificP36930montagereagens voor fluorescentie
ribonucleases AThermoFisher Scientific12091039voor RNAse-behandeling in DNAscope-protocol
ribonucleases T1RocheR1003voor RNAse-behandeling in DNAscope-protocol
RNAscope 2.5, 2-plex detectiereagensACD322430Detectie van bruine en rode kit-chromogen
RNAscope Target Retrieval ReagentsACD322000buffer voor herstel
SuperFrost Plus Glass SlidesThermoFisher Scientific12-550-17
TBSBOSTON BIOPRODUCTSBM-301-4Lvoor wasbeurten
TSA Plus Fluorescence palette kit (Cy3, Cy5, TMR, Fluorescein)Perkin elmerNEL760001KTHRP Fluorescerende detectie
Tween 20SIGMAP1379-1Lvoor wasbeurten
XYLENE 20LTThermoFisher ScientificAC422680200

Referenties

  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnosis. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Deleage, C., et al. Defining HIV and SIV Reservoirs in Lymphoid Tissues. Pathogens and Immunity. 1 (1), 68-106 (2016).
  3. Sengupta, S., Siliciano, R. F. Targeting the Latent Reservoir for HIV-1. Immunity. 48 (5), 872-895 (2018).
  4. Churchill, M. J., Deeks, S. G., Margolis, D. M., Siliciano, R. F., Swanstrom, R. HIV reservoirs: what, where and how to target them. Nature Reviews Microbiology. 14 (1), 55-60 (2016).
  5. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), e2005970(2018).
  6. Deleage, C., Chan, C. N., Busman-Sahay, K., Estes, J. D. Next-generation in situ hybridization approaches to define and quantify HIV and SIV reservoirs in tissue microenvironments. Retrovirology. 15 (1), 4(2018).
  7. Deleage, C., Turkbey, B., Estes, J. D. Imaging lymphoid tissues in nonhuman primates to understand SIV pathogenesis and persistence. Current Opinion in Virology. 19, 77-84 (2016).
  8. Estes, J. D., et al. Defining total-body AIDS-virus burden with implications for curative strategies. Nature Medicine. 23 (11), 1271-1276 (2017).
  9. Mavigner, M., et al. Simian Immunodeficiency Virus Persistence in Cellular and Anatomic Reservoirs in Antiretroviral Therapy-Suppressed Infant Rhesus Macaques. Journal of Virology. 92 (18), (2018).
  10. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogen. 14 (4), e1006956(2018).
  11. Deleage, C., et al. Impact of early cART in the gut during acute HIV infection. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (10), e87065(2016).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Detectie van viraal RNAdetectie van viraal DNAHIV onderzoekSIV onderzoekFFPE weefselsnext generation ISHprobe ontwerpsstrategiesignaalversterkingonderdrukking van achtergrondsignaal
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.