Methodenartikel

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

DOI:

10.3791/60334

⸱

28 september 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke embryonale stamcellen tonen een uniek vermogen om in vitro op morfogenen te reageren door zelforganiserende patronen van de specificatie van het lot van cellen die corresponderen met primaire kiem laagvorming tijdens de embryogenese. Dus, deze cellen vertegenwoordigen een krachtig instrument om te onderzoeken van de mechanismen die vroege menselijke ontwikkeling stimuleren. We hebben een methode ontwikkeld om menselijke embryonale stamcellen te kweken in kleine kolonies op conforme ondergronden die de controle over zowel de geometrie van de kolonies als hun mechanische omgeving bieden om de fysische parameters te recapituleren die ten grondslag embryogenese. Het belangrijkste kenmerk van deze methode is de mogelijkheid om polyacrylamidehydrogels te genereren met gedefinieerde patronen van extracellulaire matrix ligand aan de oppervlakte om celhechting te bevorderen. Dit wordt bereikt door het vervaardigen van stencils met de gewenste geometrische patronen, met behulp van deze stencils te maken patronen van extracellulaire matrix ligand op glas dekstroken, en overbrengen van deze patronen naar Polyacrylamide hydrogels tijdens polymerisatie. Deze methode is ook compatibel met de tractiekracht microscopie, waardoor de gebruiker de verdeling van de door cellen gegenereerde krachten binnen de besloten kolonies kan meten en toewijzen. In combinatie met standaard biochemische testen, kunnen deze metingen worden gebruikt om de rol van mechanische cues spelen in Fate specificatie en morfogenese tijdens de vroege menselijke ontwikkeling te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) houden grote belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde en weefsel engineering toepassingen. De pluripotente aard van deze cellen geeft hen de mogelijkheid om onderscheid te maken in een volwassen celtype. Hoewel er grote vooruitgang is geboekt bij het sturen van het lot van hESCs naar bepaalde celtypen, is het erg moeilijk gebleven om hele weefsels of organen de Novo1,2,3,4te genereren, 5. Dit is grotendeels te wijten aan een beperkt begrip van de mechanismen die de vorming van deze weefsels tijdens de menselijke ontwikkeling stimuleren. Om deze kloof in kennis te dichten, zijn er de afgelopen jaren een aantal methoden ontstaan om het vroege embryo en de daaropvolgende ontwikkelingsstadia te modelleren met embryonale stamcellen6,7,8,9 ,10,11,12,13.

Kort na de afleiding van de eerste hESC-lijnen14werd aangetoond dat embryoïde lichamen gevormd uit hescs in staat waren om spontaan cellen te produceren van de drie primaire kiem lagen6. Door het inherente gebrek aan controle over de grootte en morfologie van embryoïde lichamen varieerde de organisatie van kiem lagen echter aanzienlijk en slaagde er niet in om de organisatie van het vroege embryo te matchen. Meer recentelijk heeft Warmflash et al. een methode ontwikkeld om kolonies van hESCs op glas substraten te beperken via micropatterning, wat controle en consistentie biedt over de grootte en geometrie van de kolonies8. In aanwezigheid van BMP4, een belangrijke morfogen in de vroege ontwikkeling, waren deze besloten kolonies in staat om zelforganiserende reproduceerbare patronen van specificatie te geven aan lot die de primaire kiem lagen representeren. Hoewel dit een nuttig model voor het bestuderen van de mechanismen waarmee primaire kiem lagen zijn vastgesteld, de patronen van het lot specificatie niet precies overeenkomen met de organisatie en morfogenese waargenomen tijdens embryogenese15. Een meer getrouwe recapitulatie van de vroege embryonale ontwikkeling werd bereikt door het insluiten van hESCs in een driedimensionale extracellulaire matrix (ECM) van matrigel11, die tot op heden het sterkste bewijs levert voor het vermogen van hescs om zichzelf te organiseren en model de vroege stadia van embryogenese ex vivo. Deze methode levert echter inconsistente resultaten op en is dus onverenigbaar met een aantal assays die kunnen worden gebruikt om de onderliggende mechanismen van zelforganisatie en Fate specificatie te onthullen.

Gezien deze bestaande methodes en hun respectieve beperkingen, probeerden we een methode te ontwikkelen voor het reproduceren van hESC-kolonies met gedefinieerde geometrieën onder omstandigheden die de extracellulaire omgeving van het vroege embryo modelleren. Om dit te bereiken gebruikten we Polyacrylamide hydrogels van instelbare elasticiteit om de mechanische eigenschappen van het substraat te beheersen. Met behulp van atoom kracht microscopie op gastrulatie-stage kippen embryo's, vonden we dat de elasticiteit van de epiblast varieerde van honderden pascal's tot een paar kilopascals. Zo richtten we ons op het opwekken van polyacrylamide hydrogels met elasticiteit in dit bereik om te dienen als substraat voor hESC-kolonies. We hebben onze eerdere methoden voor het kweken van hescs op Polyacrylamide hydrogels7,9 aangepast om een robuuste controle te bieden over de geometrie van de kolonies. Dit hebben we bereikt door eerste patronen ECM ligands, namelijk matrigel, op glazen dekstroken via micro fabricaat stencils, zoals eerder gerapporteerd16. Vervolgens ontwierpen we een nieuwe techniek om het patroon ligand over te brengen naar het oppervlak van polyacrylamidehydrogels tijdens polymerisatie. De methode die we hier beschrijven, is het gebruik van foto lithografie om een silicium wafer te fabriceren met de gewenste geometrische patronen, het maken van postzegels van deze geometrische kenmerken met Polydimethylsiloxaan (PDM'S), en het gebruik van deze stempels om de stencils te genereren die uiteindelijk toestaan van het patroon van ligand op het oppervlak van glas dekstroken en overbrengen naar Polyacrylamide.

Naast het samenstellen van de mechanische omgeving van het vroege embryo, maakt het beperken van hESC-kolonies op Polyacrylamide het mogelijk om door cellen gegenereerde krachten te meten met tractiekracht microscopie (TFM), zoals gerapporteerd in onze vorige methode9. In het kort, fluorescerende kralen kunnen worden ingebed in de Polyacrylamide en gebruikt als fiducial markers. Door de cel gegenereerde krachten worden berekend door de verplaatsing van deze kralen te vervormen na het zaaien van hESCs op het patroon substraat. Bovendien kunnen de resulterende tractiekracht kaarten worden gecombineerd met traditionele assays, zoals immunokleuring, om te onderzoeken hoe de verdeling van door cellen gegenereerde krachten in kleine hESC kolonies de downstream signalering kan reguleren of moduleren. We verwachten dat deze methoden zullen onthullen dat mechanische krachten een cruciale rol spelen in het patroon van de specificatie van het lot van cellen tijdens de vroege embryonale ontwikkeling die momenteel over het hoofd wordt gezien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden met betrekking tot het gebruik van hESCs zijn goedgekeurd door de Human gamete, embryo and stamcel Research (GESCR) Committee aan de University of California San Francisco.

1. bereiding van silicium wafer met geometrische kenmerken

  1. Maak een photomask met de gewenste geometrische kenmerken. Gebruik computer-aided redactie software om de functies te ontwerpen. Voor gebruik met negatieve fotororsist, maken functies dekkend en de rest van het masker transparant.
    Opmerking: voor patronen op 18 mm diameter afdek stroken, groepskenmerken voor elke experimentele conditie in 10 x 10 mm gebieden om ervoor te zorgen dat de stencils gegenereerd in stap 3 passen op de dekstroken.
  2. Spin Coat Negative fotoresist op een 100 mm silicium wafer. Gebruik het fotoresist-gegevensblad om de snelheid en de lengte van de spin te bepalen om een filmdikte van 100-250 μm te genereren.
    Let op: de dikte van de folie moet zodanig worden aangepast dat de hoogte-breedte verhouding van de patronen tot aan het stencil zo dicht mogelijk bij 1:1 ligt. We raden echter een minimale dikte van 100 μm aan, omdat alles minder delicate stencils produceert die gemakkelijk scheuren.
  3. Verwerk de fotoresist volgens het productgegevensblad. Dit betekent meestal een zachte bak, UV-belichting met photomask in een masker aligner, post exposure Bake, ontwikkeling, en harde bakken. In tabel 1wordt bijvoorbeeld de procedure beschreven die gebruikt wordt om de in dit Protocol gebruikte wafers te verwerken.
    Opmerking: Wees voorzichtig bij het hanteren van silicium wafers omdat ze kwetsbaar zijn. Eenmaal gegenereerd, kunnen wafers herhaaldelijk worden gebruikt, zolang ze niet beschadigd zijn.

2. voorbereiding van de dekstroken

  1. Bereiding van zuurgewassen "Top" dekstroken
    1. Plaats 18 mm diameter #1 dikte afdek stroken in een glazen Petri schaaltje. Het juiste aantal afdek stroken is afhankelijk van de grootte van het schaaltje. Voor een 100 mm schotel, bereid 50-100 covers Lips tegelijk. Volume bedragen die door de rest van deze sectie worden gegeven, komen overeen met een schaal van 100 mm.
    2. Voeg 20 mL 1 M HCl toe aan de Petri schaal en schud het gerecht zachtjes om de dekstroken te dispergeren. Zorg ervoor dat alle afdek stroken worden ondergedompeld en luchtbellen uit tussen de dekstroken. Incuberen 's nachts bij kamertemperatuur met zacht schudden.
      Let op: HCl is zuur en corrosief. Wees voorzichtig en draag de juiste PBM terwijl u met HCl werkt.
    3. Decant HCl uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    4. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, Voeg 20 mL 100% ethanol toe aan de schaal. Gebruik de Tang, verwijder de dekstroken afzonderlijk en leg tussen twee stukjes filtreerpapier om te drogen.
    5. Bewaar de gedroogde dekstroken in een verzegelde verpakking. Zuurgewassen dekstroken kunnen van tevoren worden bereid en gedurende een maand of langer worden opgeslagen in stofvrije omstandigheden.
  2. Bereiding van glutaraldehyde-geactiveerde "bottom" dekstroken
    Opmerking: Raadpleeg de vorige methoden voor aanvullende informatie7,9.
    1. Plaats 18 mm diameter #1 dikte afdek stroken in een Petri schaaltje.
    2. Voeg 20 mL 0,2 M HCl toe aan de petrischaal en schud het gerecht zachtjes om de dekstroken te dispergeren. Zorg ervoor dat alle afdek stroken worden ondergedompeld en luchtbellen uit tussen de dekstroken. Incuberen 's nachts bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    3. Decant HCl uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    4. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, Voeg 20 mL 0,1 M NaOH toe en schud zachtjes om de dekstroken te dispergeren en te onderdompelen. Incuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 1 uur.
    5. Decant NaOH uit het gerecht. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    6. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, Voeg 20 mL van een 1:200 verdunning van 3-aminopropyltrimethoxysilaan in ultrapuur water en schud zachtjes om de dekstroken te dispergeren en te onderdompelen. Inincuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 1 uur of 's nachts.
      Let op: 3-aminopropyltrimethoxysilaan is ontvlambaar en kan huidirritatie veroorzaken. Behandel met zorg, draag de juiste PBM en gooi afval weg volgens de lokale verwijderings voorschriften.
    7. Decanen de verdunde 3-aminopropyltrimethoxysilaanoplossing uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. gooi water weg en herhaal dit voor een totaal van ten minste vijf wasgewassen. Het is van cruciaal belang om alle 3-aminopropyltrimethoxysilaan te verwijderen voordat u doorgaat.
    8. Na het verwijderen van de laatste spoeling, Voeg 20 mL van een 1:140 verdunning van 70% Glutaaraldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en schud zachtjes om te dispergeren en onderdompelen dekzeilen. Inincuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 1 uur of 's nachts.
      Let op: 70% Glutaaraldehyde is giftig en kan huidirritatie veroorzaken. Behandel met zorg, draag de juiste PBM en gooi afval weg volgens de lokale verwijderings voorschriften.
    9. Decanteer de verdunde Glutaaraldehyde oplossing uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    10. Voeg 20 mL 100% ethanol toe na het verwijderen van de laatste wasbeurt. Gebruik de Tang, verwijder de dekstroken afzonderlijk en leg tussen twee stukjes filtreerpapier om te drogen.
    11. Bewaar de gedroogde dekstroken in een verzegelde verpakking. Glutaraldehyde-geactiveerde dekstroken kunnen vooraf worden bereid en maximaal zes maanden worden bewaard.

3. generatie stencils voor patronen ECM ligand

  1. Polydimethylsiloxaan (PDM'S) tussenliggende stempels genereren
    1. Meng PDMS Base met PDMS Uithardings middel bij een verhouding van 10:1, in gewicht. Meng.
      Opmerking: voor de eerste toepassing van PDM'S bereidt u ongeveer 100 g PDM'S voor om een schaal van 100 mm te vullen. Voor volgende toepassingen verwijdert u PDM'S uit het midden van de schaal waar de silicium wafer-functies zich bevinden en bereidt u 20-30 g nieuwe PDM'S voor.
    2. Degas het PDMS mengsel in een exsiccator gedurende 30-60 min of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
    3. Plaats de gemodificeerde silicium wafer van stap 1 in een plastic 100 mm schaaltje. Giet het mengsel van PDM'S langzaam en gelijkmatig over het oppervlak van de wafer. Tik op het schaaltje op het werkoppervlak om eventuele luchtbelletjes van het oppervlak van de wafer vrij te geven.
    4. Degas het PDMS-mengsel wordt gedurende 10 minuten over de wafer gegoten of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd of naar het oppervlak van de PDM'S zijn gekomen.
    5. Bak de PDM'S op 70 °C gedurende 2 uur. laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    6. Knip met een scalpel of Box Cutter het gedeelte van PDMS uit het midden van het gerecht dat de geometrische kenmerken bevat.
    7. Snijd de PDM'S in ongeveer 10 x 10 mm vierkantjes, elk met de functies voor een enkele experimentele conditie. Deze worden in de volgende stappen van het Protocol ' stempels ' genoemd.
  2. Vlakke platen van PDM'S genereren
    1. Meng PDMS Base met PDMS Uithardings middel bij een verhouding van 8:1, in gewicht. Bereid ongeveer 20 g voor elke schaal van 100 mm die moet worden gebruikt. Meng.
    2. Degas het PDMS mengsel in een exsiccator gedurende 30-60 min of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
    3. Giet de PDM'S langzaam en gelijkmatig in een schone 100 mm schaal. Tik op het schaaltje op het werkoppervlak om eventuele luchtbelletjes vrij te geven.
    4. Bak de PDM'S op 70 °C gedurende 2 uur. laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    5. Verwijder de PDM'S uit de schaal. Zo omkeren dat het oppervlak van de PDM'S die in aanraking was met de bodem van het gerecht naar boven gericht is.
    6. Knip voor elke in stap 3,1 gegenereerde stempel een vierkant van 15 x 15 mm van PDM'S. Deze worden in de daaropvolgende stappen van het protocol "platte platen" genoemd.
  3. Stencils genereren
    1. Regel platte platen van PDM'S op het deksel van een schotel van 150 mm of een ander vlak oppervlak voor eenvoudiger gebruik. Zorg voor voldoende ruimte tussen platen (bijv. voor een 150 mm schaal, regel negen vlakke platen met gelijkmatige afstand).
    2. Keer elke in stap 3,1 gegenereerde stempel op een vlakke plaat van PDM'S, zodat de functies op de stempel in contact komen met de platte plaat van PDM'S. Druk voorzichtig op de bovenkant van de stempel met een tang om een gelijkmatige contact te garanderen.
    3. Schroef de deksel van de PDMS stempel/slab op de basis van het schaaltje, zodat het deksel onder een hoek ligt. Dit helpt de wicking van het UV-uier bare polymeer in de volgende stap.
    4. Plaats een kleine druppel UV-uikbaar polymeer in de bovenste interface van elk stempel/slab paar. Het polymeer zal goddeloos zijn tussen de twee door oppervlaktespanning, bijgestaan door de zwaartekracht.
      Opmerking: veel verschillende UV-uier bare polymeren kunnen in dit protocol werken. We selecteerden Norland Optical Adhesive 74 voor de volgende eigenschappen: i) snelle uitharding bij blootstelling aan UV-licht, II) eenvoudig verwijderen van PDMS-stempels bij uitharding, III) robuuste hechting op glas dekstroken met handmatige druk.
    5. Zodra het polymeer volledig goddeloos is geweest, plaatst u het deksel met stempel/slab paren plat op het werkoppervlak. Plaats een kleine druppel UV-uikbaar polymeer aan elk van de overige drie zijden van elke stempel/slab-interface.
    6. Verbind met een pipetpunt van 200 μL de druppels polymeer rond de randen van de stempel/plaat-interface. Hiermee maakt u een rand die ligand-oplossing in stap 4 houdt.
      Opmerking: Wees voorzichtig wanneer u het polymeer rond de randen van de stempel werkt. Als de stempel/slab-interface wordt verstoord, zal het polymeer onder de functies staan en zal het stencil niet goed worden vormgegeven.
    7. Plaats de stempel/plaat paren voorzichtig in een UV-sterilisatie doos. Gebruik de steriele "str" vermogensinstelling en bloot gedurende 10 min.
    8. Verwijder de stempel/plaat paren uit de UV-sterilisatie doos. Gebruik twee paar tang, verwijder voorzichtig de PDMS stempel terwijl u de platte plaat en stencil die gevormd uit het UV-uier bare polymeer.
    9. Gebruik de Tang, verwijder voorzichtig het stencil en inverteer het zodanig dat het oppervlak dat in aanraking was met de vlakke plaat van PDMS naar boven is gericht.
      Opmerking: de stencils zijn delicaat. Wees voorzichtig terwijl u ze overhandigt, vooral terwijl u ze in eerste instantie uit de PDM'S verwijdert, zodat ze niet scheuren.
    10. Plaats de omgekeerde stencils terug in een UV-sterilisatie doos. Gebruik de steriele "str" vermogensinstelling en bloot gedurende 3 min.

4. patterning ECM ligand op dekstroken

  1. Drukken op stencils op zuurgewassen dekstroken
    1. Plaats een met zuur gewassen dekslip voor elk stencil op een schoon stukje laboratorium film.
    2. Met behulp van een tang, zorgvuldig plaats elk stencil, platte-side-Down, op een zuur-gewassen coverslip. Plaats zodanig dat de functies gecentreerd zijn op de dekslip.
    3. Plaats een klein stukje laboratorium folie bovenop elk stencil. Druk stevig en gelijkmatig op het stencil om een sterk contact tussen het stencil en de coverslip te creëren.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap! Druk stevig en over het gehele oppervlak van het stencil. Als er geen voldoende contact is gemaakt, lekt de ligand-oplossing tussen het stencil en de dekstroken en het patroon zal mislukken. Optioneel: om voldoende contact tussen het stencil en de Afdeklijst te bevestigen, Pipetteer 100 μL ultrapuur steriel water op het oppervlak van elk stencil en incuberen bij kamertemperatuur. Controleer na 1 uur of er lekkage is. Aspirate water uit met succes gebonden stencils en doorgaan.
  2. Plasma reiniging van het oppervlak van de stenciled dekstroken om de hydrofiliciteit te verhogen
    1. Plaats de dekstroken met stencils in een plasma reiniger. Breng hoog vermogen plasma aan voor 30 sec.
  3. Bereiding van de ligand oplossing van ECM
    Opmerking: alle volgende stappen moeten, indien mogelijk, in steriele omstandigheden worden voltooid.
    1. Plaats steriel 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 oplossing op ijs. Eenmaal ijskoud, voeg matrigel en collageen toe om concentraties van respectievelijk 225 μg/mL en 25 μg/mL te bereiken. Optioneel: voor het oplossen van problemen of voor ligand visualisatie, omvatten een fluorescently gelabeld ligand in de ligand oplossing.
      1. Opmerking: bij deze methode kunnen verschillende ECM-liganden worden gebruikt. Voor verschillende liganden kan extra optimalisatie nodig zijn om de ideale concentratie, incubatietijd en incubatietemperatuur te bepalen. Zie discussie sectie voor meer informatie.
    2. Pipetteer de ligand-oplossing op het oppervlak van elk stencil. Voor stencils gemaakt van 10 x 10 mm vierkante stempels, apply 100 μL per stencil.
    3. Controleer op luchtbellen in stencil functies. Gebruik indien nodig een fijngedraaide Tang of een pipetpunt van 2 μL om luchtbellen uit functies te verwijderen.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap! Als er luchtbellen aan het oppervlak van de dekslip blijven zitten, zal de ligand niet aan het oppervlak adsorberen en zal het resulterende patroon onvolledig zijn.
    4. Leg de stenciled dekstroken met ligand in een schaaltje, wikkel met een laboratorium folie en inincuberen bij 4 °C 's nachts.

5. overdracht van ligand naar polyacrylamidegel

  1. Het verwijderen van ligand-oplossing en stencil van elke afdek
    1. Aspirate de ligand-oplossing van het oppervlak van een stencil. Ligand-oplossing kan worden verzameld en opgeslagen bij 4 °C en gedurende maximaal een maand worden hergebruikt.
    2. Met behulp van een tang, dompel de dekslip kort samen met een stencil in een schotel met steriele PBS om te wassen.
    3. Dompel de dekslip kort met een stencil in een tweede gerecht van steriel PBS om te wassen.
    4. Verwijder het stencil uit het oppervlak van de coverslip. Wees voorzichtig om de dekslip niet te breken.
    5. Dompel de afdek schaal kort in een schaaltje dat ultra steriel water bevat om zouten uit de PBS-wassings te verwijderen. Tik op de rand van de Afdeklijst om een delicate taak te verwijderen om overtollig water weg te geven.
    6. Droog de dekslip onder een inert gas, zoals stikstof. Markeer de onderzijde van de dekslip om vanaf dit punt de oriëntatie te volgen. Zorg ervoor dat de patroon zijde naar boven is gericht.
    7. Herhaal stap 5.1.1 tot en met 5.1.6 voor elke dekslip van de stenciled.
  2. Polyacrylamidehydrogels maken met patroon dekstroken
    Opmerking: Raadpleeg de vorige methoden voor aanvullende informatie7,9 steriliseren alle Cap-houders, buizen, en spacers gebruikt voor het maken van polyacrylamide gels door wassen met 10% bleekmiddel 's nachts, spoelen met water ten minste vijf keer om bleken te verwijderen, en wassen kort in 70% ethanol. Plaats alle stukken op delicate taak doekjes in een steriele bioveiligheids kast om te drogen voor gebruik.
    1. Bereid polyacrylamideoplossing voor om de gewenste hydrogel elasticiteit te verkrijgen (tabel 2). Meng alle componenten met uitzondering van de fluorescerende microsferen en het Kaliumpersulfaat (PPS).
      Let op: bereid 1% kalium persulfate oplossing elke keer vers.
    2. Degas de polyacrylamideoplossing, microsferen en PPS in afzonderlijke buisjes onder vacuüm gedurende 30 minuten.
    3. Voor elk patroon dekslip, bereid een glutaraldehyde-geactiveerde "bottom" dekmantel met een spacer (18 mm buitendiameter, 14 mm binnendiameter) bovenop geplaatst.
    4. Na ontgassing kort soniceren microsferen en voeg het juiste volume aan Polyacrylamide oplossing. Meng door Pipetteer op en neer, wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Kort soniceren.
    5. Voeg het juiste volume PPS toe aan de Polyacrylamide-oplossing. Pipetteer op en neer om de oplossing te mengen en zorg ervoor dat u geen luchtbellen introduceert.
      Opmerking: na het toevoegen van PPS, werk snel om stappen 5.2.6 door 5.2.11 te voltooien voordat Polyacrylamide polymerizes.
    6. Pipetteer 75-150 μL (afhankelijk van de dikte van de Spacer) tot het midden van elke glutaraldehyde-geactiveerde dekslip.
    7. Met behulp van een tang, plaatst u een dekslip met patroon op elke glutaraldehyde-geactiveerde dekslip met Polyacrylamide en spacer, zodat het patroon ligand tegenover de Polyacrylamide oplossing staat. Als voldoende polyacrylamideoplossing werd toegevoegd, zal de oppervlaktespanning de Polyacrylamide tussen de twee dekstroken en er zullen geen luchtbellen aanwezig zijn.
    8. Pak elke Polyacrylamide "sandwich" en raak voorzichtig de zijkant aan een delicate taak veeg om overtollige Polyacrylamide oplossing weg te geven.
    9. Plaats elke Polyacrylamide "sandwich" zorgvuldig in een dop met draden die compatibel zijn met 15 mL conische bodem buizen. De oriëntatie moet zodanig zijn dat de bodem van de Glutaaraldehyde-dekslip in contact is met de onderkant van de dop, en de dekslip met dessin is bovenop.
    10. Schroef een conische onderste buis van 15 mL in elke dop om de "sandwiches" van polyacrylamide op zijn plaats te houden. De buizen moeten strak om te voorkomen dat lekken, maar wees voorzichtig om niet te spannen en kraken van de dekstroken.
    11. Centrifugeer de Polyacrylamide "sandwiches" in de buisjes in zwenk emmers bij 200 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder de buizen van de centrifuge en plaats in buis rekken om de oriëntatie te behouden voor een extra 50 min om volledige polymerisatie te garanderen. Blijf bedekt met folie om bleken van fluorescerende microsferen te voorkomen.
      Opmerking: centrifugeren is van cruciaal belang bij het gebruik van deze methode om TFM uit te voeren. De centrifugale kracht beweegt alle microsferen naar een enkel vlak, dat uiteindelijk net onder het oppervlak van de hydrogel zal liggen. Dit is ideaal voor Imaging sfeer verplaatsingen die worden gebruikt om door cellen gegenereerde tractie spanningen te berekenen. Als u geen TFM uitvoert, kunnen microsferen buiten de Polyacrylamide oplossing worden gelaten en kan polymerisatie worden uitgevoerd op het tafelblad zonder centrifugeren.
    12. Verwijder gepolymeriseerde Polyacrylamide "sandwiches" uit de buisjes en dompel in PBS in een 100 mm schaal. Wikkel in laboratorium folie en incuberen gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
  3. Bereiding van gedessineerde gels voor zaaien van cellen
    1. Gebruik een scalpel en een tang om de dekslip met patroon en de afstandhouder van de Polyacrylamide "sandwich" voorzichtig te verwijderen terwijl deze in PBS wordt ondergedompeld. Het gedessineerde ligand zal tijdens polymerisatie overgebracht worden naar de Polyacrylamide en zal blijven na het verwijderen van de dekslip. De polyacrylamidegel blijft bevestigd aan de glutaraldehyde-geactiveerde dekslip.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap! De Polyacrylamide moet worden ondergedompeld in PBS tijdens het verwijderen van de dekslip of de ligand patronen zullen worden vernietigd.
    2. Plaats elke dekslip met een patroon van polyacrylamide in een cap-houder. Plaats een pakking (een buitendiameter van 18 mm, een binnendiameter van 14 mm) bovenop de Afdeklijst en rond de Polyacrylamide, waar de afstandhouder zich bevindt. Schroef een afgezaaide 15 mm conische onderbuis in de dop en vorm een put met het patroon poly acrylamide onderaan. Deze assemblages passen in de putjes van een standaard 12-Wells plaat voor eenvoudige bediening.
    3. Was elke gel door 500 μL PBS toe te voegen aan de put. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden. Verwijder PBS en herhaal tweemaal voor een totaal van drie wast.
    4. Voeg na de laatste PBS-wassing 500 μL afdekmedium toe aan gels en incuberen bij 37 °C 's nachts. Gels kunnen tot 5 dagen vóór het zaaien van cellen worden bewaard bij 37 °C met media.
    5. De dag voor het zaaien van cellen, vervang Knockout-DMEM voor volledige KSR media en incuberen bij 37 °C 's nachts.

6. culturing hESCs op patroon gels

Opmerking: als u van plan bent om monsters voor immunokleuring na tfm op te lossen, neem dan beelden van onbeklemtoonde sfeer posities voordat u cellen zaaien. In dit geval moet fluorescently gelabeld ligand worden gebruikt in stap 4.3.1 zodat de uiteindelijke locaties van cellen bekend zullen zijn voordat zaaien en microsferen in die gebieden kunnen worden afgebeeld.

  1. Onderhouden van voorraad hesc culturen en secundaire feeder-vrije culturen bereid op matrigel gecoate platen in geconditioneerde KSR media voordat zaaien op patroon Polyacrylamide gels zoals eerder beschreven9.
    Opmerking: Genereer geconditioneerde KSR media door het kweken van bestraalde muizen embryonale fibroblasten in KSR media aangevuld met 4 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF). Verzamel en vervang media elke 24 h.
  2. Aspireren de media van hESCs. Was kort met afdekmedium. Voeg 0,05% trypsine-EDTA toe, aangevuld met 10 μM Y27632 (Rho kinase remmer) en inincuberen bij 37 °C gedurende 5-10 min.
  3. Voeg media toe met serum om trypsine te remmen. Zuig de media voorzichtig aan en Pipetteer over de schaal om cellen te verwijderen. Blijf zachtjes pipetteren om alle cellen te verwijderen en celclusters te ontkoppelen van afzonderlijke cellen.
  4. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten.
  5. Zuig de supernatant op en relaat de pellet in een equivalent volume KSR media om te wassen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 min.
  6. Aspireren de supernatant en respenderen de pellet in geconditioneerde KSR media aangevuld met 10 ng/mL bFGF en 10 μM Y27632.
  7. Tel de cellen met een hemocytometer en stel de celsuspensie in op een concentratie van 300.000 cellen per mL. Pipetteer 500 μL van de celsuspensie op elke gel met patroon (150.000 cellen per gel).
  8. 3 h na het zaaien, gebruik een pipet om de media voorzichtig te aspireren van elke gel en vervangen door vers geconditioneerde KSR media aangevuld met 10 ng/mL bFGF en 10 μM Y27632. Hierdoor worden overtollige cellen verwijderd die zich niet hechten aan gedessineerde gebieden van de Polyacrylamide.
    Opmerking: Dit is een kritieke stap! In dit stadium zullen cellen losjes worden gehecht aan de gedessineerde ligand. Wees heel voorzichtig bij het verwisselen van media om de cellen niet los te maken. In de daaropvolgende stappen moet met elk van de media swaps evenveel aandacht worden besteed.
  9. 24 uur na het zaaien, gebruik een pipet om de media zorgvuldig te aspireren en te ruilen voor geconditioneerde KSR-media aangevuld met 10 ng/mL bFGF en 5 μM Y27632.
  10. 48 h na het zaaien, gebruik een pipet om de media zorgvuldig te aspireren en te ruilen voor geconditioneerde KSR-media aangevuld met 10 ng/mL bFGF. Dit verwijdert de Rho kinase remmer uit de media en experimenten kunnen de volgende dag beginnen, 72 h na zaaien.

7. het uitvoeren van TFM

  1. Voer indien gewenst TFM uit zoals eerder beschreven9 onder de gewenste proefomstandigheden.
  2. Als onbeklemtoonde sfeer posities werden afgebeeld vóór het zaaien van cellen, repareer de cellen na het innemen van beklemtoonde sfeer posities en voer immunokleuring uit om de lokalisatie van eiwitten van belang te bepalen ten opzichte van regio's met hoge en lage tractie krachten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkste uitdaging om te overwinnen in het proberen om hESCs te cultuur in kolonies van gecontroleerde geometrie op conforme ondergronden is het genereren van een homogeen patroon van ECM-ligand op het oppervlak van het substraat. De strategie die in deze methode wordt voorgesteld, moet eerst het gewenste patroon op het oppervlak van een glazen dekglaasje genereren en vervolgens dat patroon overbrengen naar het oppervlak van een polyacrylamidehydrogel tijdens polymerisatie van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een lang en gedetailleerd protocol te vereenvoudigen, bestaat deze methode uit drie kritieke stadia: 1) het genereren van patronen van ECM ligand op glazen Dekbladen, 2) het overbrengen van de patronen naar polyacrylamidehydrogels tijdens polymerisatie van de gel, en 3) het zaaien van hESCs op de gedessineerde hydrogel. Er zijn kritieke stappen die in elk van deze drie fasen moeten worden overwogen. Om high-fidelity patronen op de glazen dekstroken te genereren, moet het stencil stevig op de afdekplaat worden gedrukt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen graag de financiering van CIRM Grant RB5-07409 erkennen. J.M.M. wil FuiBoon Kai, Dhruv Thakar en Roger Oria bedanken voor verschillende discussies die de generatie en het oplossen van deze methode begeleidde. J.M.M. dankt ook de UCSF Discovery Fellowship voor de voortdurende ondersteuning van zijn werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,05% TrypsineGibco25300054
100 mm glazen petrischaalFisher Scientific08-747B
100 mm kunststof petrischaalFisher ScientificFB0875712
15 mL conische buisjes met platte bodemCorning352095
150 mm kunststof petrischaalFisher ScientificFB0875714
18 mm diameter #1 dekglasjesThermo Scientific18CIR-1
2% bisacrylamideBio-Rad161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilaanACROS Organics313251000
40% acrylamideBio-Rad161-0140
AluminiumfolieFisher Scientific01-213-100
Basische fibroblasten groeifactorSigma-AldrichF0291
BleekmiddelCloroxN/A
Centrifuge met draaibare mandenEppendorf22623508Model: 5804 R
CollageenCorning354236
ExsiccatorFisher Scientific08-642-7
EthanolFisher ScientificAC615095000
Fetaal bovien serumGibco16000044
Fluorescente microsferenThermo ScientificF8821
Pincet (voor dekglasjes)Fisher Scientific16-100-122
Pincet (voor wafers)Fisher Scientific17-467-328
Gel-houdersN/AN/AGel-houders zijn op maat gemaakte 3D-geprinte, CAD-tekening op aanvraag beschikbaar
GlutaraldehydeFisher Scientific50-261-94
HEPESThermo ScientificJ16926A1
HeteluchtplaatFisher ScientificHP88854100
ZoutzuurFisher ScientificA144S-500
Isopropyl alcoholFisher ScientificA416-500
Kimwipes (delicate task wipes)Kimberly-Clark Professional34120
Knockout serum vervangerGibco10828028
Knockout-DMEMGibco10829018
Mask aligner (voor fotolitografie)Karl Suss America, Inc.Karl Suss MJB3 Mask Aligner
MatrigelCorning354277
Microscoop voor tractiekrachtNikonN/AModel: Eclipse TE200 U
Gemotoriseerde positioneringsschijfPrior ScientificN/AModel: HLD117
StikstofgasAirgasNI 250
Norland optische lijm 74 (UV-hardende polymeer)Norland ProductsNOA 74
OvenThermo ScientificPR305225G
Parafilm (laboratoriumfolie)Fisher Scientific13-374-12
PDMS (Sylgard 184)Fisher ScientificNC9285739
FotomaskerCAD/Art Services, Inc.N/AFotomaskers worden op maat gemaakt. CAD-tekening voor onze ontwerpen beschikbaar op aanvraag
Plasma cleanerFisher ScientificNC9332171
Kunststof voor pakkingMarian ChicagoHT6135
Kunststof voor spacerTAP PlasticsN/APolycarbonaat plaat, .01 inch dik
Kaliumchloride (voor het maken van PBS)Fisher ScientificP217-500
Kaliumfosfaat monobasisch (voor het maken van PBS)Fisher ScientificP285-500
KaliumpersulfaatACROS Organics424185000
ScalpelFisher Scientific14-840-00
Silicion waferElectron Microscopy Sciences71893-06Type P, 3 inch, silicium wafers
Natriumchloride (voor het maken van PBS)Fisher ScientificS271-1
NatriumhydroxideFisher ScientificS318-100
Natriumfosfaat dibasisch dihydraat (voor het maken van PBS)Fisher ScientificS472-500
SU8-3050 fotoresistMicroChemSU8-3000
SU8-ontwikkelaarMicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
UV-sterilisatie boxBio-RadN/ABio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (Rho kinase inhibitor)StemCell Technologies72304
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001(2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Human Embryonic Stem CellsPolyacrylamide HydrogelsTraction Force MicroscopyColony Geometry ControlCompliant SubstratesExtracellular Matrix PatterningPDMS Stencil FabricationFluorescent Ligand TransferCell Fate SpecificationMechanical Cues Analysis

Gerelateerde artikelen