Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden

Summary

We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.

Abstract

Recente ontwikkelingen in virale vector-en nanomateriaal Wetenschappen hebben de weg geopend voor nieuwe geavanceerde benaderingen om het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken of te manipuleren. Verdere optimalisatie van deze technologieën zou echter baat hebben bij methoden die een snelle en gestroomlijnde bepaling van de omvang van CNS en Cell-specifieke targeting bij toediening van virale vectoren of nanodeeltjes in het lichaam mogelijk maken. Hier presenteren we een protocol dat profiteert van de hoge doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie om een eenvoudige kwantificering van verschillende celsubtypen geïsoleerd van muis hersenen of ruggenmerg, namelijk Microglia/macrofagen, lymfocyten, astrocyten, oligodendrocyten, neuronen en endotheliale cellen toe te staan. We passen deze aanpak toe om kritische verschillen tussen twee weefselhomogenisatie methoden in termen van celopbrengst, levensvatbaarheid en samenstelling te benadrukken. Dit kan de gebruiker instrueren om de beste methode te kiezen, afhankelijk van het celtype (s) van de interesse en de specifieke toepassing. Deze methode is niet geschikt voor de analyse van anatomische verdeling, omdat het weefsel wordt gehomogeniseerd om een eencellige suspensie te genereren. Echter, het maakt het mogelijk om te werken met levensvatbare cellen en het kan worden gecombineerd met celsortering, het openen van de weg voor verschillende toepassingen die het repertoire van gereedschappen in handen van de neurowetenschapper kunnen uitbreiden, variërend van de oprichting van primaire culturen afgeleid van zuivere celpopulaties, tot genexpressie analyses en biochemische of functionele assays op goed gedefinieerde celsubtypen in de context van neurodegeneratieve ziekten, bij farmacologische behandeling of gentherapie.

Introduction

Technologieën voor het leveren van genen en medicijnen (zoals virale vectoren en nanodeeltjes) zijn een krachtig hulpmiddel geworden dat kan worden toegepast om beter inzicht te krijgen in specifieke moleculaire trajecten die zijn veranderd in neurodegeneratieve ziekten en voor de ontwikkeling van innovatieve therapeutische benaderingen^1,2,3. Optimalisatie van deze instrumenten is afhankelijk van de kwantificering van: (1) de mate van penetratie in het CZS op verschillende toedieningswegen en (2) targeting van specifieke celpopulaties. Histologische analyses worden meestal to....

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Dana Farber Cancer Institute (Protocolnummer 16-024).

1. voorbereiding van de oplossingen die nodig zijn voor het experiment

1. Bereid 1x Hank van gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) door het verdunen van 10x HBSS met steriel water. Pre-Chill de oplossing op ijs. Voor elk monster is ten minste 25 mL oplossing nodig.
2. Bereid isotone Percoll-oplossing (IPS) door het mengen van 10x steriele HBSS 1:10 met dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Percoll). Pre-chill op ijs.
   NB: IPS kan tot 30 dagen bewaard worden bij 4 ....

Results

We vergeleek twee verschillende homogenisatie methoden (DH versus PD) toegepast op muis hersenen en ruggenmerg, om de efficiëntie te testen bij het ophalen van verschillende levensvatbare celtypen die geschikt zijn voor downstreamtoepassingen. Om dit te doen, we uitgebuit een 9-Color flow cytometrie panel ontworpen om te karakteriseren, in hetzelfde monster, verschillende CNS celtypen, waaronder Microglia, lymfocyten, neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en endotheel.

Hersenen en ruggenmerg .......

Discussion

Hierin beschrijven we een protocol voor de co-zuivering en gelijktijdige Flow cytometrische analyse van enkele van de meest relevante CNS-cellen van muis hersenen en ruggenmerg. Traditioneel zijn histologische analyses toegepast om de verdeling van nanodeeltjes of de transductie-efficiëntie van virale vectoren in het CZS^5,13te beschrijven of om inzichten te verschaffen over morfologische en moleculaire veranderingen die zich voordoen in specifieke celtypen tijden.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated