We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Recente ontwikkelingen in virale vector-en nanomateriaal Wetenschappen hebben de weg geopend voor nieuwe geavanceerde benaderingen om het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken of te manipuleren. Verdere optimalisatie van deze technologieën zou echter baat hebben bij methoden die een snelle en gestroomlijnde bepaling van de omvang van CNS en Cell-specifieke targeting bij toediening van virale vectoren of nanodeeltjes in het lichaam mogelijk maken. Hier presenteren we een protocol dat profiteert van de hoge doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie om een eenvoudige kwantificering van verschillende celsubtypen geïsoleerd van muis hersenen of ruggenmerg, namelijk Microglia/macrofagen, lymfocyten, astrocyten, oligodendrocyten, neuronen en endotheliale cellen toe te staan. We passen deze aanpak toe om kritische verschillen tussen twee weefselhomogenisatie methoden in termen van celopbrengst, levensvatbaarheid en samenstelling te benadrukken. Dit kan de gebruiker instrueren om de beste methode te kiezen, afhankelijk van het celtype (s) van de interesse en de specifieke toepassing. Deze methode is niet geschikt voor de analyse van anatomische verdeling, omdat het weefsel wordt gehomogeniseerd om een eencellige suspensie te genereren. Echter, het maakt het mogelijk om te werken met levensvatbare cellen en het kan worden gecombineerd met celsortering, het openen van de weg voor verschillende toepassingen die het repertoire van gereedschappen in handen van de neurowetenschapper kunnen uitbreiden, variërend van de oprichting van primaire culturen afgeleid van zuivere celpopulaties, tot genexpressie analyses en biochemische of functionele assays op goed gedefinieerde celsubtypen in de context van neurodegeneratieve ziekten, bij farmacologische behandeling of gentherapie.
Inleiding
Technologieën voor het leveren van genen en medicijnen (zoals virale vectoren en nanodeeltjes) zijn een krachtig hulpmiddel geworden dat kan worden toegepast om beter inzicht te krijgen in specifieke moleculaire trajecten die zijn veranderd in neurodegeneratieve ziekten en voor de ontwikkeling van innovatieve therapeutische benaderingen1,2,3. Optimalisatie van deze instrumenten is afhankelijk van de kwantificering van: (1) de mate van penetratie in het CZS op verschillende toedieningswegen en (2) targeting van specifieke celpopulaties. Histologische analyses worden meestal toegepast om fluorescerende reporter-genen of fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes in verschillende CZS-gebieden en over verschillende celtypen te visualiseren, geïdentificeerd door immunokleuring voor specifieke celmarkeringen4,5. Hoewel deze aanpak waardevolle informatie verschaft over de biodistributie van het toegediende gen of medicamenteuze gereedschappen, kan de techniek tijdrovend en arbeidsintensief zijn, omdat dit vereist is: (1) weefsel fixatie, cryopreservatie of paraffine-inbedding en slicing; (2) kleuring voor specifieke cellulaire markers die soms antigeen-opvraging vereisen; (3) overname door fluorescentiemicroscopie, die gewoonlijk de analyse van een beperkt aantal verschillende markers binnen hetzelfde experiment mogelijk maakt; (4) beeldverwerking om een juiste kwantificering van het signaal van belang toe te staan.
Flow cytometrie is uitgegroeid tot een veelgebruikte techniek die gebruik maakt van zeer specifieke fluorescerende markers om niet alleen een snelle kwantitatieve evaluatie van verschillende celfenotypes in celsuspensies mogelijk te maken, op basis van de expressie van oppervlakte-of intracellulaire antigenen, maar ook functionele metingen (bijv. snelheid van apoptosis, proliferatie, celcyclus analyse, enz.). Fysiek isoleren van cellen door middel van fluorescerende geactiveerde celsortering is ook mogelijk, waardoor verdere downstreamtoepassingen (bijv. celkweek, RNAseq, biochemische analyses, enz.) 6,7,8.
Weefselhomogenisatie is een kritieke stap die noodzakelijk is om een enkelvoudige celsuspensie te verkrijgen om betrouwbare en reproduceerbaar stroomcytometrische evaluaties te kunnen ondergaan. Er zijn verschillende methoden beschreven voor de homogenisatie van volwassen hersenweefsel, voornamelijk met als doel Microglia-cellen9,10,11te isoleren; ze kunnen in het algemeen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën: (1) mechanische dissociatie, die slijp-of Afschuifkracht gebruikt door middel van een Dounce homogenisator (DH) om cellen uit hun nissen te rippen en een relatief gehomogeniseerde eencelsuspensie te vormen, en (2) enzymatische spijsvertering, die berust op incubatie van gehakt weefsel brokken bij 37 ° c in aanwezigheid van Proteolytische enzymen, zoals trypsine of papaïne, waarbij de afbraak van de extracellulaire matrix wordt begunstiging om een vrij gehomogeniseerde celsuspensie te creëren12.
Ongeacht welke methode wordt gebruikt, wordt een zuiveringsstap aanbevolen na weefselhomogenisatie om myeline te verwijderen door centrifugeren op een dichtheidsgradiënt of door magnetische selectie9,12, alvorens naar de downstreamtoepassingen te gaan.
Hier beschrijven we een weefsel verwerkingsmethode op basis van papaïne-spijsvertering (PD) gevolgd door zuivering op een dichtheidsgradiënt, geoptimaliseerd om levensvatbare heterogene celsuspensies te verkrijgen van muis hersenen of ruggenmerg in een tijdgevoelige manier en geschikt voor Flowcytometrie. Bovendien beschrijven we een 9-kleuren Flowcytometrie-paneel en de gating-strategie die we in het laboratorium hebben aangenomen om de gelijktijdige discriminatie van verschillende CNS-populaties, levende/dode cellen of positiviteit voor fluorescerende verslaggevers zoals groen fluorescerende eiwitten of Rhodamine-kleurstof mogelijk te maken. Door het toepassen van deze Flow cytometrische analyse, we kunnen vergelijken verschillende methoden van weefsel verwerking, dat wil zeggen, PD versus DH, in termen van behoud van cellulaire levensvatbaarheid en rendementen van verschillende celtypen.
De details die we hier verstrekken, kunnen een beslissing geven over het homogenisatie-protocol en de antilichaam combinatie die moet worden gebruikt in het Flowcytometrie paneel, op basis van het specifieke celtype (s) van belang en de stroomafwaartse analyses (bijv. temperatuurgevoelige toepassingen, tracering van specifieke fluorescentie markers, in vitro cultuur, functionele analyses).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Dana Farber Cancer Institute (Protocolnummer 16-024).
1. voorbereiding van de oplossingen die nodig zijn voor het experiment
- Bereid 1x Hank van gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) door het verdunen van 10x HBSS met steriel water. Pre-Chill de oplossing op ijs. Voor elk monster is ten minste 25 mL oplossing nodig.
- Bereid isotone Percoll-oplossing (IPS) door het mengen van 10x steriele HBSS 1:10 met dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Percoll). Pre-chill op ijs.
NB: IPS kan tot 30 dagen bewaard worden bij 4 °C. - Bereid stroom cytometrie (FACS) blokkering (BL) oplossing (1% boviene serumalbumine [BSA], 5% foetaal runderserum [FBS] in fosfaatgebufferde fysiologische Saline [PBS]). Pre-chill op ijs.
2. euthanasie van dieren door intracardiale perfusie en weefsel dissectie
Opmerking: acht weken oude C57BL/6J muizen, beide seks, werden gebruikt in de experimenten. Perfusie met PBS-oplossing wordt uitgevoerd om bloed verontreiniging door organen te elimineren, voordat u doorgaat met de vertering van het weefsel.
- Anesthetiseer de muis met behulp van een mengsel van ketamine/xylazine (90 − 200 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine). Plaats de muis op de achterkant en plak elke ledemaat op de steun. Controleer adequate anesthesie diepte door het controleren van de terugtrekking reflex.
- Maak een incisie van de middenlijn huid op het niveau van de thoracische inlaat om het borstbeen bloot te leggen. Gebruik de tang om de punt van het borstbeen te vatten en maak vervolgens een incisie van 1 cm aan elke kant van de ribbenkast. Snijd tenslotte door het diafragma en open het borstbeen breed genoeg om het hart te visualiseren.
- Gebruik de tang om het hart voorzichtig te vatten door de rechter ventrikel en til het naar de middenlijn en iets uit de borst.
- Plaats een vlindernaald van 23 G in de punt van de linker ventrikel, richting de aorta en houd stevig vast.
- Start de perfusie met 1x PBS. Doorboren de rechter oorschelp met behulp van een schaar zodat de perfusaat om de circulatie te verlaten. Stel de stroomsnelheid van PBS in op 3 mL/min. Parfuaps met ten minste 15 mL 1x PBS om ervoor te zorgen dat de weefsels helder zijn.
Opmerking: Blanching van de lever en mesenterische bloedvaten zijn tekenen van goede perfusie. Indien nodig kan het volume van de prefusie worden verhoogd totdat de vloeistof die het hart verlaat helder is van bloed, op welk punt de spoel lijn kan worden gestopt. - Na perfusie, verbreken van de hersenen van het ruggenmerg en verwijder de hersenen uit de schedel met schaar en Tang. Verwijder de vacht om de zichtbaarheid en controle tijdens het dissectie te vergroten en om te voorkomen dat haar verontreinigingen worden overgedragen. Spoel het ruggenmerg uit de kolom met behulp van een 3 mL spuit gevuld met PBS.
- Breng elk weefsel in een put van een 6-well multi-well plaat vooraf gevuld met 2 mL ijskoude 1x HBSS en blijf op ijs tot de spijsvertering.
- Verdeel de hersenen en het ruggenmerg in twee helften, langs de longitudinale lijn.
Opmerking: de ene helft van elk weefsel wordt gehomogeniseerd (zie onderstaande secties) om stromings cytometrische analyses toe te staan; de andere helft kan worden toegewezen aan verschillende verwerkingen voor alternatieve analyses (bijvoorbeeld gedompeld in Paraformaldehyde fixatieve oplossing voor histologie).
3. enzymatische vertering van de hersenen en het ruggenmerg
Opmerking: volumes die in deze sectie worden beschreven, zijn voldoende voor de vertering van een half brein of ruggenmerg.
- Gebruik een schaar om de weefsels in 1 − 2 mm dikke stukjes te gehakt.
- Snijd de punt van een 1000 μL pipet met een schaar om het voldoende groot te maken voor het verzamelen van de weefsel stukken. Spoel de pipetpunt vooraf af met 1x HBSS. Gebruik vervolgens de pipet om de 2 mL HBSS-oplossing met het gehakt weefsel over te brengen naar een conische buis van 15 mL.
Opmerking: voorspoelen van de pipetpunt is belangrijk om kleverigheid van de weefsel stukjes in de tip te voorkomen. - Was de put met extra 2 mL ijskoude 1x HBSS en breng de oplossing over naar de corresponderende conische buis van 15 mL met de weefsel stukjes.
- Centrifugeer elk monster 5 min bij 250 x g bij 4 °c.
- Bereid enzym mengsel 1 van de neurale weefsel dissociatie Kit (NTDK; Tabel met materialen) door menging van 50 μL enzym P met 1900 μL buffer X per monster. Warm enzym mengsel 1 bij 37 °C in een waterbad. Incubate enzym mengsel 1 bij 37 °C gedurende ten minste 10 minuten vóór gebruik om de volledige activering van het enzym mogelijk te maken.
- Zuig de supernatant uit de conische buis van 15 mL en voeg aan elk monster 1,95 mL enzym mengsel 1 toe. Voorzichtig Vortex om ervoor te zorgen dat de pellet opnieuw wordt opgehangen.
- Inincuberen de monsters op een wiel of Shaker gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Bereid ondertussen enzym mengsel 2 van de NTDK in door 10 μL enzym A te mengen met 20 μL buffer Y per monster; Verwarm de oplossing voor op 37 °C in een waterbad.
- Voeg aan het einde van de incubatie met enzym mengsel 1 30 μL enzym mengsel 2 toe aan elk monster.
- Meng de monsters voorzichtig door op en neer te pipetteren met een pipetpunt van 1000 μL voorgespoeld met 1x HBSS.
- Inincuberen het monster op een wiel of Shaker gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Voeg na incubatie 10 mL ijskoude 1x HBSS toe aan elke buis om enzym mengsel 1 en enzym mengsel 2 te deactiveren.
- Centrifugeer elk monster 10 min bij 320 x g bij 4 °c.
- Gooi het supernatant weg; Voeg ijskoud 1x HBSS toe aan elke buis tot een eindvolume van 7 mL en breng de pellet voorzichtig door vortexing.
- Ga verder naar sectie 5 voor het verwijderen van puin.
4. mechanische homogenisatie van de hersenen en het ruggenmerg
Opmerking: volumes die in deze sectie worden beschreven, zijn voldoende voor homogenisatie van de helft van de hersenen of het ruggenmerg. Het protocol dat in deze sectie wordt beschreven, kan worden gebruikt als alternatief voor de methode die wordt beschreven in sectie 3, afhankelijk van de behoefte van de gebruiker, zoals hieronder wordt besproken.
- Pre-Chill de glas mortel van de Dounce weefsel Grinder (tafel van de materialen) ingesteld op ijs.
- Voeg 3 mL voorgekoelde 1x HBSS toe aan de mortel.
- Breng het weefsel (de hersenen of het ruggenmerg) van de put van de 6-put plaat in de glas mortel, zodat het wordt gedoopt in 1x HBSS en zit aan de onderkant van de mortel.
- Smash het weefsel zachtjes met 10 slagen stamper A gevolgd door 10 slagen van een stamper B. Breng de gehomogeniseerde mix over in een nieuwe conische buis van 15 mL.
- Vul de buis tot een eindvolume van 10 mL met voorgekoelde 1x HBSS en centrifugeer 10 min bij 320 x g bij 4 °c.
- Zuig de supernatant op en voeg ijskoud 1x HBSS toe aan elke buis tot een eindvolume van 7 mL en breng de pellet voorzichtig door met vortexing.
- Ga verder naar sectie 5 voor het verwijderen van puin.
5. verwijderen van vuil
Opmerking: verwijdering van puin, voornamelijk samengesteld uit onverteerd weefsel en myeline omhulsels, is een kritieke stap om efficiënte kleuring van het weefsel homogenaat voor volgende Flow cytometrische analyses mogelijk te maken.
- Filtreer elk monster door een celzeef van 70 μm om alle niet-verteerde weefsel Brok te verwijderen. Deze stap is vooral belangrijk vooral bij het werken met ruggenmerg weefsels, omdat deze monsters hebben meer kans om te bevatten onverteerde zenuw fragmenten of hersenvliezen die de volgende stappen kunnen beïnvloeden.
- Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume 7 mL is in elke monsterbuis. Zo niet, vul dan met ijskoud 1x HBSS tot 7 mL.
- Voeg 3 mL voorgekoelde IPS aan elk monster toe om een eindvolume van 10 mL van een oplossing met dichtheidsgradiënt medium bij 30% eindconcentratie te maken. Draai de monsters zachtjes om ervoor te zorgen dat ze homogeen gemengd zijn.
- Centrifugeer monsters gedurende 15 minuten bij 700 x g bij 18 °c en zorg ervoor dat de versnelling van de centrifuge op 7 en de rem op 0 wordt gezet.
Opmerking: centrifugeren moet ongeveer 30 minuten duren. - Haal de monsters voorzichtig uit de centrifuge.
Opmerking: een witachtige schijf die bestaat uit puin en myeline moet zichtbaar zweven op het oppervlak van de oplossing. Een pellet (met de cellen van belang) moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis. - Zuig voorzichtig alle witachtige schijf van puin en vervolgens de rest van de supernatant ervoor te zorgen dat niet te verdrijven de pellet. Laat ongeveer 100 μL oplossing bovenop de celpellet om te voorkomen dat het risico van onbedoeld loskomen.
- Voeg 1 mL FACS BL toe, hervat de pellet door pipetteren op en neer met een 1000 μL pipetpunt en breng samples over naar 1,5 mL tubes.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij kamertemperatuur (RT).
- Zuig het supernatant zachtjes aan en breng de pellet in passende buffer die compatibel is met downstreamanalyses (zie rubriek 6 voor het protocol dat wordt gebruikt voor de flowcytometrische evaluatie van meerdere celtypen).
6. kleuring voor flowcytometrische evaluatie van meerdere celtypen
- Respendeer de pellet verkregen in stap 5,9 met 350 μL FACS BL. Voeg FC-block toe aan elk monster in een uiteindelijke concentratie van 5 μg/mL.
Opmerking: voor één kleuring moet ten minste 100 μL van het monster worden gebruikt, om ervoor te zorgen dat voldoende cellen worden verwerkt om betrouwbare analyses mogelijk te maken. - Inbroed het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C voordat u doorgaat met de kleuring.
- Bereid een antilichaam mengsel volgens tabel 1.
- Voeg een antilichaammix toe aan elke buis, Vortex voor 5 sec. en inbroed de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 1 mL PBS toe aan elke buis, Vortex en centrifuge gedurende 5 min bij 450 x g bij RT.
- Ondertussen bereiden streptavidine mix volgens tabel 1.
- Gooi de supernatant weg en regeer de pellet in de streptavidine mix bereid in stap 6,6. Gebruik voor elk monster hetzelfde volume als dat voor de kleuring is gebruikt in stap 6,4.
- Vortex voor 5 sec. en inbroed de monsters gedurende 10 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 1 mL PBS toe aan elke buis, Vortex en centrifuge gedurende 5 min bij 450 x g bij RT.
- Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in FACS BL. gebruik 300 μL FACS BL voor elke 100 μL monster gekleurd.
- Voeg 7-amino-actinomycine D (7-AAD) oplossing voor elk voorbeeld. Gebruik 5 μL 7-AAD voor elke 300 μL monster bereid in stap 6,10.
- Bewaar monsters bij 4 °C in het donker tot cytofluorimetrische analyse. Voer de analyse uit binnen 16 uur vanaf de monstervoorbereiding, om > 60% cellevens vatbaarheid te garanderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We vergeleek twee verschillende homogenisatie methoden (DH versus PD) toegepast op muis hersenen en ruggenmerg, om de efficiëntie te testen bij het ophalen van verschillende levensvatbare celtypen die geschikt zijn voor downstreamtoepassingen. Om dit te doen, we uitgebuit een 9-Color flow cytometrie panel ontworpen om te karakteriseren, in hetzelfde monster, verschillende CNS celtypen, waaronder Microglia, lymfocyten, neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en endotheel.
Hersenen en ruggenmerg ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin beschrijven we een protocol voor de co-zuivering en gelijktijdige Flow cytometrische analyse van enkele van de meest relevante CNS-cellen van muis hersenen en ruggenmerg. Traditioneel zijn histologische analyses toegepast om de verdeling van nanodeeltjes of de transductie-efficiëntie van virale vectoren in het CZS5,13te beschrijven of om inzichten te verschaffen over morfologische en moleculaire veranderingen die zich voordoen in specifieke celtypen tijden...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door de start-up fondsen van het Boston Children's Hospital voor A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 tot M.P., en het kantoor van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het Amyotrofische laterale sclerose onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-17-1-0036 tot M.P. We erkennen DFCI flow Cytometrie core voor technische ondersteuning.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC geconjugeerd |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 geconjugeerd |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 geconjugeerd |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 geconjugeerd |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 geconjugeerd |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 geconjugeerd |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Inclusief mortel en stampers A en B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotine geconjugeerd |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | verkocht als niet steriele reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | steriele reagent (te gebruiken voor toepassingen die steriliteit vereisen) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent met zeer lage sporen endotoxine |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 geconjugeerd |
Referenties
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
