Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl

Samenvatting

Dit manuscript presenteert protocollen voor het chirurgisch toebrengen van gecontroleerde bot en scherpe ruggenmergletsels aan een regeneratieve Axolotl (Ambystoma mexicanum).

Samenvatting

Het doel van deze studie is het vaststellen van een gestandaardiseerd en reproduceerbaar regeneratief botte ruggenmergletsel model in de axolotl (Ambystoma mexicanum). De meeste klinische ruggenmergletsels optreden als hoge energie botte trauma's, inducerende contusie verwondingen. Echter, de meeste studies in het ruggenmerg van Axolotl zijn uitgevoerd met scherpe trauma's. Vandaar dat deze studie bedoeld is om een meer klinisch relevant regeneratief model te produceren. Vanwege hun indrukwekkende vermogen om bijna elk weefsel te regenereren, worden Axolotls veel gebruikt als modellen in regeneratieve studies en zijn ze intensief gebruikt in ruggenmergletsel (SCI) studies. In dit protocol wordt de Axolotls verdoiliseerd door onderdompeling in een benzocaïne oplossing. Onder de Microscoop wordt een hoekige incisie bilateraal gemaakt op een niveau dat net caudal is voor de achterpoten. Vanuit deze incisie is het mogelijk om de spineuze processen te ontleden en bloot te leggen. Met behulp van een tang en een schaar wordt een laminectomie op twee niveaus uitgevoerd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld. Een aangepaste trauma-apparaat bestaande uit een vallende staaf in een cilinder is geconstrueerd, en dit apparaat wordt gebruikt voor het induceren van een contusie letsel aan het ruggenmerg. De incisies worden vervolgens gehecht, en het dier herstelt van anesthesie. De chirurgische aanpak is succesvol in het blootstellen van het ruggenmerg. Het trauma mechanisme kan contusie verwondingen veroorzaken aan het ruggenmerg, zoals bevestigd door histologie, MRI en neurologisch onderzoek. Ten slotte regenereert het ruggenmerg van het letsel. De kritieke stap van het protocol is het verwijderen van de stekelige processen zonder schade aan het ruggenmerg. Deze stap vereist opleiding om een veilige procedure te waarborgen. Bovendien is wondsluiting sterk afhankelijk van het niet toebrengen van onnodige schade aan de huid tijdens incisie. Het protocol werd uitgevoerd in een gerandomiseerde studie van 12 dieren.

Inleiding

Het algemene doel van deze studie was het vaststellen van een gecontroleerde en reproduceerbare microchirurgische methode voor het toebrengen van bot en scherp SCI aan de axolotl (Ambystoma mexicanum), het produceren van een regeneratief ruggenmergletsel model.

SCI is een ernstige aandoening die, afhankelijk van het niveau en de omvang, neurologische handicaps aan de extremiteiten veroorzaakt, samen met een verminderde blaas-en darm controle^1,2,3. De meeste Sci zijn het resultaat van High Energy Blunt trauma zoals verkeersongevallen en vallen^4,5. Scherpe verwondingen zijn zeer zeldzaam. Daarom is het meest voorkomende macroscopische letsel type contusies.

Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CNS) is een niet-regeneratief weefsel, vandaar dat er geen herstel van neurologische weefsels na Sci wordt gezien^6,7,8. Aan de andere kant, sommige dieren hebben een intrigerende vermogen om te regenereren weefsels, met inbegrip van CNS weefsel. Een van deze dieren is de axolotl. Het wordt veel gebruikt in studies van regeneratieve biologie en is van belang in het ruggenmerg regeneratie, omdat het een gewervelde^9,10,11,12.

De meeste Sci-onderzoeken in de axolotl worden uitgevoerd als amputatie van de gehele staart of ablatie van een groter deel van het ruggenmerg^9,10,11,12. Onlangs werd een nieuwe studie gepubliceerd over Blunt blessures¹³ die klinische situaties beter nabootst. Terwijl complete amputatie van het aanhangsel in de axolotl resulteert in volledige regeneratie, zijn sommige niet-amputatie-gebaseerde regeneratieve verschijnselen afhankelijk van het kritische grootte defect (CSD)^14,15. Dit betekent dat verwondingen die een kritische drempel overschrijden niet worden geregenereerd. Om een regeneratief model met een hogere klinische translationele waarde te ontwikkelen, onderzocht deze studie of een botte trauma van 2 mm de CSD-limiet zou overschrijden.

Deze methode is relevant voor onderzoekers die werken aan ruggenmerg regeneratie in kleine diermodellen, vooral in de axolotl. Bovendien kan het van meer algemeen belang zijn, omdat het een manier vertoont om standaard laboratoriumapparatuur te gebruiken om een stompe trauma mechanisme te ontwikkelen dat geschikt is voor gebruik bij kleine dieren in het algemeen.

Protocol

Alle toepasselijke institutionele en overheidsverordeningen betreffende het ethisch gebruik van dieren werden tijdens deze studie gevolgd. De studie werd uitgevoerd onder de goedkeurings-id: 2015-15-0201-0061 door de Deense Animal experiment inspectie. Dieren waren Mexicaanse Axolotls (Ambystoma mexicanum, gemiddelde lichaamsmassa ± STD: 12,12 g ± 1,25 g).

1. voorbereiding

1. Bereid Axolotl voor anesthesie.
   1. Gebruik hoogkwalitatief niet-chemisch behandeld kraanwater. Gebruik, indien niet beschikbaar, de oplossing van 40% Holtfreter.
   2. Los 200 mg ethyl 4-aminobenzoaat (benzocaïne) op in 3 mL aceton. Los deze oplossing op in 1 liter kraanwater of 40% Holtfreter's oplossing.
2. Gebruik een standaard Petri schaaltje (100 mm in diameter) geplaatst onder een stereomicroscoop als een chirurgische tafel. Plaats een chirurgische textiel doek op de Petri schaal.
   Opmerking: Het gebruik van een Petri schaal als chirurgisch gebied maakt het mogelijk om het dier te bewegen en te roteren zonder het aan te raken, zodat de ruggengraat stabiel is tijdens de operatie.
3. Bereid alle steriele microchirurgische instrumenten (d.w.z. een schaar en een anatomisch Tang).

2. anesthesie

1. Plaats de axolotl in een container met benzocaïne oplossing voor ongeveer 45 min om een diepe en stabiele anesthesie te garanderen.
   Opmerking: De gegeven concentratie van benzocaïne zal anesthesie veroorzaken in alle maten van Axolotls.
2. Controleer op tekenen van narcose binnen 30-45 min. Deze omvatten een volledig gebrek aan Kieuw bewegingen, rechtse reflex of reactie op tactiele of pijnlijke stimuli (zachte knijpen van Teen web).
3. Om anesthesie te handhaven, wikkel de dieren in papieren handdoeken bevoafd in de verdovings oplossing. Bevochtig deze regelmatig met deze oplossing tijdens de chirurgische ingreep om ervoor te zorgen dat de huid en de kieuwen vochtig worden gehouden.
4. Herstel het dier na de ingreep door het in een bakje met vers kraanwater te plaatsen. Observeer de tekenen van herstel, zoals Gill Movement en herwonnen rechts reflex, binnen 1 h¹⁶.

3. microchirurgische laminectomie

Opmerking: De laminectomie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop.

1. Plaats het dier in de liggende positie op de Petri schaal. Wikkel het in papieren handdoeken zodat de staart wordt blootgesteld.
   Opmerking: De papieren handdoeken zijn uitstekend geschikt voor het garanderen van stabiliteit gedurende de hele procedure.
2. Identificeer de achterpoten. Maak de eerste incisie gewoon caudal voor hen.
   1. Met een paar micro schaar, voer een verticale incisie van de kiel totdat de benige prominentie van de stekelige processen worden gevoeld.
      Opmerking: Wees heel voorzichtig bij het grijpen van de kiel en de huid met een tang, omdat deze gemakkelijk schade toebrengen aan de delicate huid.
   2. Strek de snede lateraal, zodat de incisie doorloopt de gehele breedte van de staart.
   3. Pak het stekelige proces met de tang om de juiste diepte te garanderen.
   4. Strek de verticale incisies 1 mm onder het stekelige proces aan beide zijden uit.
3. Plaats het dier aan de ene kant om ventrale en horizontale incisies uit te voeren zoals hieronder vermeld.
   1. Met een paar micro schaar, beginnend vanaf het ventrale punt van de verticale incisie, maak een horizontale incisie van ongeveer 15 mm voor dieren 10-20 g in gewicht. Maak de incisie langer voor grotere dieren, en korter voor kleinere dieren.
   2. Met behulp van de schaar, ontleden mediaal door de horizontale incisie totdat de wervelkolom wordt gevoeld in de middenlijn.
   3. Herhaal de stappen 3,3, 3.3.1 en 3.3.2 aan de andere zijde van het dier.
4. Na ontleed in het diepe mediale vlak van beide zijden, ontleden door de middellijn, waardoor de twee horizontale incisies verbinden.
   1. Verplaats het vrije stuk van de staart en de Kiel naar één kant, waardoor de stekelige processen worden blootgesteld (Figuur 1).
   2. Fixeren het staartstuk met natte papieren handdoeken.
5. Plaats het dier opnieuw in de liggende positie met het hoofd naar de niet-dominante kant van de chirurg.
   1. Met een paar tang, pak de stekelige processen net caudal aan de achterpoten. Breng een zachte lift aan, zowel omhoog als naar het hoofd van het dier.
   2. Plaats de messen van een paar microscissors horizontaal rond het proces en knip het voorzichtig af. De lift op het proces zorgt ervoor dat het nu wordt verwijderd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld.
   3. Pak het stekelige proces net caudal aan degene die net is verwijderd en herhaal stap 3.5.1 en 3.5.2.
      Opmerking: Dit moet een blootgestelde ruggenmerg die overeenkomt met twee wervel niveaus achterlaten. Bij het uitvoeren van de laminectomie verschijnt er vaak een witte schuimige afscheiding. Het ruggenmerg wordt gemakkelijk geïdentificeerd door zijn kenmerkende glans, samen met een schip dat langs de middenlijn loopt.
   4. Afhankelijk van de grootte van het dier, kan het blootgestelde gebied niet breed genoeg zijn. Gebruik twee paar tang, pak de laminaten aan beide zijden van het ruggenmerg en draai deze lateraal met een zachte beweging.

4. het introduceren van een contusie type letsel (Figuur 2)

1. Houd het dier in de liggende positie.
2. Gebruik de Petri schaal om het dier over te brengen naar de trauma-eenheid.
3. Laat een assistent een zaklamp schijnen op het ruggenmerg.
4. Plaats de contusie trauma unit cilinder boven het blootgestelde ruggenmerg met behulp van de micro-adjusters op het apparaat. Richt door de cilinder.
5. Verlaag de cilinder tot het niveau met de laminae.
6. Bevestig de vallende staaf aan de elektromagneet. Plaats de gewenste dalende hoogteverstelling cilinder op de trauma unit.
7. Plaats de vallende staaf in de cilinder.
   Opmerking: Voor een geblindeerde studie moet de chirurg nu de kamer verlaten zonder te weten of het dier zal worden toegewezen aan een blessure of een schijn operatie groep.
8. Schakel de elektromagneet uit. De staaf valt aan het blootgestelde ruggenmerg.
9. Gebruik de hoogteverstelling schroef om de stang van het ruggenmerg te tillen.
10. Bevestig het letsel door te kijken naar het ruggenmerg door de Microscoop. De geblesseerde plaats zal donkerder lijken, en bloeden uit het middenlijnvat zal duidelijk zijn.

5. Maak kennis met een scherp letsel

Opmerking: Voer deze stappen uit na 3.5.4.

1. Met een paar micro schaar snijd het ruggenmerg in een perfecte verticale snede.
2. Herhaal de snede 2 mm naar de caudale kant van het lichaam.
   Opmerking: De lengte van het verwijderde stukje ruggenmerg kan worden aangepast volgens de vereiste van de studie. Echter, een 2 mm snede zal worden regenereerbaar¹⁰.
3. Zorg ervoor dat de sneden compleet zijn. Na voltooiing, voel de messen van de schaar schrapen langs het ventrale deel van het wervelkanaal.
4. Til het 2 mm-stukje ruggenmerg van het wervelkanaal.

6. sluiten van de chirurgische wond

1. Keer het dier terug naar de chirurgische tafel. In een geblindeerde studie, herpositioneer de kiel zodat het ruggenmerg niet zichtbaar is voor de chirurg.
2. Houd het dier in de liggende positie.
   1. Begin met het plaatsen van 10,0 nylon hechtingen van het meest caudale deel van de horizontale incisie. Sluit de wonden in één laag.
      Opmerking: De huid niet te strak te vatten, want het zal het toebrengen van necrose.
   2. Werken naar het verticale deel van de incisie.
   3. Bij het bereiken van de hoek, draai de Petri schaal en hechting van de andere horizontale incisie.
   4. Stel hechtingen op de verticale incisies.
   5. Plaats geen hechtingen in het bovenste deel van de Kiel, omdat de huid hier niet in staat zal zijn om vast te houden.

7. retourneren van het dier naar de Verdovings vrije oplossing

1. Til de Petri schaal met het dier en Dompel beide zeer zachtjes in zoet water slechts 5 cm diep en laat het dier eraf glijden.
   Opmerking: De ondiepe waterdiepte zorgt ervoor dat het dier niet zal proberen te zwemmen naar het oppervlak om te ademen.
2. Verander het water tijdens de eerste week niet.
3. Zorg er bij het voederen van de dieren voor dat het voedsel in de buurt van het hoofd van het dier wordt geplaatst.
   Opmerking: Het doel van deze maatregelen is om zoveel mogelijk beweging te vermijden tijdens de eerste week.

8. postoperatieve echografie

1. Voorafgaand aan de beëindiging van de anesthesie, gebruik maken van een hoge frequentie echografie systeem om beelden van de verwonding die kan worden gebruikt voor de bouw van driedimensionale beelden van de SCI-site te verwerven.
2. Bevestig de transducer aan een micro manipulator die bij voorkeur bestuurd wordt door een externe joystick.
3. Dompel de verdoving dier in de liggende positie in een kleine container gevuld met anesthetische oplossing.
   Opmerking: Bevestig het dier met miniatuur zandzakken of andere apparatuur om beweging te voorkomen tijdens de scan volgorde.
4. Lijn de punt van de transducer uit met de lengte-as van het dier en dompel het in de benzocaïne oplossing totdat het slechts een paar millimeter boven de kiel achter de achterpoten van het dier ligt.
5. Identificeer de SCI-site.
   Opmerking: De wond site is gemakkelijk herkenbaar als gevolg van de ontbrekende stekelige processen direct boven het Sci.
6. Optimaliseer de afbeelding door de echografie-instellingen aan te passen. Zorg ervoor dat de SCI-site zich in het midden van de afbeelding bevindt. Pas het gezichtsveld aan (d.w.z. de beeld diepte, de diepte verschuiving en de breedte van de afbeelding) om de SCI-site en het aangrenzende gezonde weefsel te bedekken. Pas de tweedimensionale versterking aan om het beeldcontrast te optimaliseren.
7. Door de ultrasone transducer over de SCI-site te vegen met een elektronisch bediende micro manipulator, verkrijgt u B-modus beelden die de SCI-site bedekken op meerdere cross-sectionele segment locaties van het sagittale, met opeenvolgende segmenten met een interslice-interval van 50 μm. Verkrijg Cine-images met 500 frames met een framesnelheid van ~ 50 frames/s en een transducer frequentie van 40 MHz.
   Opmerking: Deze instelling vereist een elektronische micromanipulator bestuurd door een externe joystick (stap 8,2).
8. Na het afronden van de scan sequentie keert u terug naar stap 7.

Resultaten

Het doel van het protocol is om een SCI te produceren dat de motorische en sensorische functies van de verwonding zal verlamen. Omdat de axolotl regeneratie-competent is, herstelt de functie binnen enkele weken, waardoor onderzoekers CNS regeneratie kunnen bestuderen tijdens een korte tijdspanne.

Anesthesie werd verstrekt voor 45 min aan alle dieren, en geen afleveringen van premature herstel werden ervaren. Alle dieren hersteld binnen een uur en toonde geen tekenen van schade door anesthesie ...

Discussie

Omdat het risico op letsel aan het ruggenmerg significant is, verwijderen de kritische stappen van het protocol de spineuze processen en verbreding van de benige toegang tot het Ruggenmergkanaal indien nodig. Zoals vermeld in het Protocol, het verwijderen van de meest craniale proces eerst wordt sterk aanbevolen. Dit zal betekenen dat de meer caudale processen het ruggenmerg beschermen tegen het raken van de schaar. Het wordt aanbevolen om te zorgen voor voldoende chirurgische toegang, wat betekent dat niet te klein een ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
25 g custom falling rod	custom home made
30 mm PVC pipe	custom home made
Aceton	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanon
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	12-22 cm en 10 g - 80 g, Alle stammen (wildtype, melanoïd, wit, albino, transgeen wit met GFP)
Benzocaïne	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoaat
Elektromagneet	custom home made
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 of nieuwer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e of nieuwer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microchirurgische instrumenten	N/A	N/A	Pincet en schaar
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz centrumfrequentie, transducer
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz centrumfrequentie, transducer
Petrischaal	elke fabrikant
Zachte doek	N/A	N/A	Elk stuk zachte doek van ongeveer 70 x 55 cm2, bijv. een theedoek
Stereomicroscoop
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	Ultrasoon systeem met hoge frequentie