Method Article

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

DOI:

10.3791/60339

⸱

December 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dartmouth College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO is een steiger eiwit dat een essentiële rol speelt in het NF-κB-traject door het IKK-complex samen te stellen met de kinases IKKα en IKKβ. Na activering fosforyleert het IKK-complex de IκB-moleculen die leiden tot de nucleaire translocatie van NF-κB en de activering van doel genen. Remming van de NEMO/IKK-interactie is een aantrekkelijk therapeutisch paradigma voor de modulatie van de NF-κB-pathway activiteit, waardoor NEMO een doelwit is voorontwerp en ontdekking van remmers. Om het proces van ontdekking en optimalisatie van NEMO-remmers te faciliteren, hebben we een verbeterde constructie van het IKK-bindende domein van NEMO ontworpen dat de structuurbepaling van het eiwit in de APO-vorm mogelijk maakt en terwijl het gebonden is aan kleine moleculair gewichts remmers. Hier presenteren we de strategie die wordt gebruikt voor het ontwerp, de expressie en de structurele karakterisering van het IKK-bindende domein van NEMO. Het eiwit wordt uitgedrukt in E. coli cellen, ontbindend onder denatureringcondities en gezuiverd door middel van drie chromatografische stappen. We bespreken de protocollen voor het verkrijgen van kristallen voor de bepaling van de structuur en beschrijven gegevens acquisitie en analyse strategieën. De protocollen zullen brede toepasbaarheid vinden voor de structuurbepaling van complexen van NEMO en kleine molecuul remmers.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het NF-κB-traject wordt geactiveerd als reactie op een verscheidenheid aan stimuli, waaronder cytokines, microbiële producten en stress, om de expressie van doel genen te reguleren die verantwoordelijk zijn voor inflammatoire en immuunrespons, celdood of overleving en proliferatie1. Pathologieën zoals inflammatoire en auto-immuunziekten en kanker2,3,4,5 zijn gecorreleerd aan hyperactivatie van het traject, die modulatie van NF-κb-activiteit heeft gemaakt tot een primair doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën6,7.

Met name het canonieke NF-κB-traject onderscheidt zich van het niet-canonieke traject, verantwoordelijk voor lymvengenese en B-cel activatie, door de afhankelijkheid van de voormalige steiger proteïne NEMO (NF-κB Essential modulator8) voor de assemblage van het IKK-complex met de kinases IKKα en IKKβ. Het IKK-complex is verantwoordelijk voor de fosforylering van iκbα (remmer van κb) die het voor afbraak richt, waardoor de NF-κb-Dimeren worden vrijgemaakt om te translokaliseren naar de Nucleus voor gentranscriptie1 en daarom een aantrekkelijk doelwit is voor de ontwikkeling van remmers om NF-κb-activiteit te moduleren.

Ons onderzoek richt zich op de karakterisering van de eiwit-eiwit interactie tussen NEMO en IKKβ, gericht op NEMO voor de ontwikkeling van kleine moleculen remmers van IKK complexe formatie. Het minimale bindende domein van NEMO, dat nodig is om IKKβ te binden, omvat residuen 44-111 en de structuur ervan is bepaald in complex met een peptide overeenkomend met IKKβ-sequentie 701-7459. NEMO en IKKβ vormen een vierhelix bundel waarbij de NEMO dimeer de twee helices van IKKβ (701-745) in een langwerpige open groef met een uitgebreide interactie-interface herbergt. IKKβ (734-742), ook bekend als het NEMO-bindende domein (NBD), definieert de belangrijkste hotspot voor binding, waarbij de twee essentiële tryptophans (739.741) diep begraven in de NEMO Pocket. De details van de complexe structuur kunnen helpen bij het ontwerp op basis van structuur en optimalisatie van kleine molecuul remmers gericht op NEMO. Tegelijkertijd is het moeilijk dat de binding van een kleine molecule of peptide in NEMO de volledige conformationele verandering zou herscheppen (d.w.z. uitgebreide opening van de NEMO spiraalvormige Coil dimer) veroorzaakt door binding van de lange IKKβ (701-745), zoals waargenomen in het kristal, en de structuur van ongebonden NEMO of NEMO gebonden aan een kleine molecuul remmer kan een beter doelwit voor structuur gebaseerde drug design en remmer optimalisatie vertegenwoordigen.

Volledige lengte Nemo en kleinere afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten, hebben bewezen hardnekkige structuurbepaling in de ongebonden vorm via Röntgen kristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) methoden10, die ons ertoe aangezet om een verbeterde versie van het IKK-bindende domein van Nemo te ontwerpen. Inderdaad, NEMO (44-111) in de ongebonden vorm is slechts gedeeltelijk gevouwen en ondergaat conformationale uitwisseling en daarom zetten we ons in om zijn dimere structuur, spiraalvormige spiraal en stabiliteit te stabiliseren, terwijl de binding affiniteit voor IKKβ behouden blijft. Door het toevoegen van drie heptads van ideale dimeer spiraalvormige-Coil sequenties11 op de N-en C-Termini van het eiwit, en een reeks van vier puntmutaties, we genereerden Nemo-eeaa, een construct volledig dimeer en gevouwen in een spiraalvormige spoel, die IKK-bindende affiniteit voor de nanomolair bereik gered zoals waargenomen voor de volledige lengte Nemo12. Als bijkomend voordeel hoopten we dat de spiraalvormige spoel adapters (gebaseerd op de GCN4 sequentie) kristallisatie zouden vergemakkelijken en uiteindelijk hulp zouden kunnen verlenen bij de bepaling van de X-Ray structuur via moleculaire vervanging. Spiraalvormige spoel adapters zijn op dezelfde manier gebruikt om zowel de stabiliteit te verhogen, het gedrag van de oplossing te verbeteren en kristallisatie te vergemakkelijken voor trimere spiraalvormige spoelen en antilichaam fragmenten13,14. Nemo-eeaa wordt gemakkelijk uitgedrukt en gezuiverd uit Escherichia. coli cellen met een splijtbaar histidine tag, is oplosbaar, gevouwen in een stabiele dimeer spiraalvormige spoel en is gemakkelijk gekristalliseerd, met diffractie tot 1,9 Å. De aanwezigheid van de bestelde spiraalvormige spoel gebieden van GCN4 kan bovendien helpen bij het faseren van de gegevens van kristallen van NEMO-EEAA door moleculaire vervanging met behulp van de bekende structuur van GCN415.

Gezien de resultaten die zijn verkregen met APO-NEMO-EEAA, zijn wij van mening dat de hier beschreven protocollen ook kunnen worden toegepast op de kristallisatie van NEMO-EEAA in de aanwezigheid van kleine peptiden (zoals het NBD-peptide) of kleine molecuul remmers, met als doel de vereisten voor NEMO-remming en op structuur gebaseerde optimalisatie van initiële lood remmers te begrijpen. Gezien de plasticiteit en dynamische aard van veel spiraalvormige spoel domeinen16, het gebruik van de spiraalvormige-Coil adapters kan vinden meer algemene toepasselijkheid in medeplichtigheid van structurele bepaling.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ontwerp van de constructie voor kristallografie

  1. Kloon de sequentie van NEMO-EEAA zoals in vorige publicatie12 in een vector voor expressie in E. coli met behulp van de T7 Promoter, inclusief een N-terminale Hexa-histidine tag en een protease decolleté site.
    Opmerking: in dit protocol gebruikten we een vector die is aangepast om een N-terminale Hexa-histidine-tag en een tabak etch-virus (TEV) decolleté op de site10op te nemen. Deze vector vergemakkelijkt het splijting van de zijn tag voor eiwit kristallisatie en laat alleen de korte verlenging van GSW residuen voor het begin van de gewenste eiwitsequentie. De vector waaruit dit is afgeleid, en alternatieve vectoren worden weergegeven in de tabel met materialen. In dit protocol werden latere wijzigingen van de oorspronkelijke NEMO (44-111)-sequentie stapsgewijs geïntroduceerd, zoals eerder beschreven10, met behulp van kant gerichte mutagenese. We probeerden in eerste instantie te stabiliseren de NEMO spiraalvormige-Coil dimeer toevoegen van de ideale spiraalvormige-Coil adapters (in een lengte van ten minste drie heptads) aan de N-terminal of C-Terminal einde of beide. De dubbele spiraalvormige spoel was de meest veelbelovende van eerdere kristallisatie proeven en het werd vervolgens gewijzigd met het introduceren van mutaties om kristallisatie te verbeteren, zoals eerder beschreven12.

2. grote schaal uitdrukking van zijn6 Tagged Nemo-eeaa

  1. Transformeer de constructie in BL21 (DE3) competente cellen. Bewaren bij-80 °C als een celglycerol kolf.
  2. Dag 1 – bereid een cel starter cultuur. Voeg in een erlenmeyer kolf van 125 mL 20 mL geweldige Bouillon oplossing en 20 μL van een 100 mg/mL voorraad Ampicillaire toe. Voeg een paar micro liters celglycerol kolf toe (van-80 °C opslag van BL21 (DE3) bevoegde cellen getransformeerd met vector).
  3. Schud de 10 mL starter cultuur 's nachts bij 37 °C, 220 rpm (ongeveer 15 uur).
  4. Dag 2 – vanaf de starter, Verdun tot een OD600 = 0,1 in 250 ml van geweldige Bouillon. Voeg ampicileen toe tot een eindconcentratie van 100 μg/mL. Groeien tot een OD600 = 0,8-1,0.
    1. Voeg Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan 500 μM en groei gedurende 4 uur bij 37 °C.
    2. Meet OD600 van de geïnduceerde cultuur na 4 h. cultuur moet een od600 = 6-10 bereiken.

3. zuivering van zijn6 Tagged Nemo-eeaa

  1. Spin celkweek tot 3.800 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
  2. Sla de celpellet op en gooi het medium weg.
    Opmerking: de celpellet kan op dit punt worden opgeslagen en opgeslagen bij-20 °C, voor zuivering op een later tijdstip.
  3. Respendeer de cellen in 40 mL lysisbuffer met 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM MgCl2, 0,5 mm fenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mm Dithiothreitol (DTT) en 3 ΜL Benzonase Nuclease.
    Opmerking: de door nikkel geïmmobiliseerde metalen Ion affinity chromatografie (IMAC) kolom gebruikt is compatibel met 2 mM DTT. Als alternatief kan 0,2 mM tris (2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) worden gebruikt.
  4. Splits de resuspendeerde cellen in twee 20-25 mL aliquots.
  5. Lyse de cellen met behulp van Franse pers (geschatte druk 25.000 psi), herhalen 2-3 keer voor elke aliquot (in de koude ruimte).
    Opmerking: als alternatief kunnen cellen worden gelyseerd door sonicatie (niet getest in dit Protocol).
  6. Voeg ureum toe aan de cel lysaat tot een uiteindelijke concentratie van 8 M, laat inbrokkelen op een schommel platform voor een minimum van 2 uur of tot 's nachts. Deze en alle volgende zuiveringsstappen, met uitzondering van de dialyse, kunnen bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.
  7. Dag 3 – Breng het lysaat over naar ultracentrifuge tubes en weeg gewicht, zodat lysaat de buizen tot ten minste 3/4 vol vult. Draai het lysaat op 125.000 x g voor 45 min bij 25 °c. Decanterende het supernatant in een bekerglas van 100 mL voor het laden op de kolom.
    Opmerking: centrifugeren bij 4 °C zal leiden tot een crash van ureum.
  8. Verwijder op een snel vloeistofchromatografie systeem ethanol uit de iMac 5 ml kolom met 25 ml ultrapuur H2O bij 5 ml/min, gevolgd door 25 ml elutie buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, vervolgens 25 ml bindings buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazol, 2 mm DTT, 8 M ureum, pH 8,0.
  9. Laad ureum met supernatant bij 3 mL/min op de IMAC-kolom, waarbij de doorstroming wordt verzameld. Was de kolom voor 10 kolom volumes met bindende buffer bij 3 mL/min.
  10. Refold NEMO-EEAA construct op kolom door het wassen van kolom met refolding buffer voor 20 kolom volumes bij 3 mL/min, met 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8,0.
  11. Voer gradiënt elutie van NEMO-EEAA uit, van 10 tot 500 mM imidazol over een volume gradiënt van 12 kolommen, waarbij alle eluaat in breuk plaat wordt verzameld (fracties van 1 mL).
  12. Doorgaan met elutie op 500 mm imidazol voor twee kolom volumes, blijven verzamelen.
  13. Voer natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamidegel elektroforese (pagina) van fracties uit om de aanwezigheid van NEMO-EEAA in elutie fracties te bepalen.
    Opmerking: we gebruikten 10% acrylamide, MES buffer.
  14. Pool fracties met zuiver doel proteïne.
  15. Meet de eiwitconcentratie door Bradford assay17.
    Opmerking: dit is nodig om de hoeveelheid protease voor tag decolleté te schatten.

4. zijn6 tag splijting en zuivering

  1. Voeg TeV toe in een 1:10 gewichtsverhouding van TeV: Nemo-eeaa proteïne om de zijn6 -tag te klieven. De TEV protease werd gezuiverd in huis.
    Opmerking: Optimaliseer de hoeveelheid TEV, tijd en temperatuur die nodig is voor een volledige decolleté afzonderlijk.
    1. Express TeV protease, S219V Mutant18 in BL21 (DE3)-RIL Cells en zuiveren zoals eerder beschreven19. Laat de cellen kort groeien zoals beschreven in stap 2, lyse door de Franse pers en zuiveren met behulp van een iMac-kolom. Bewaar het uiteindelijke eiwit in 25 mM natriumfosfaat buffer, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glycerol.
  2. Dialyseer het monster 's nachts (ongeveer 15 uur) in 4 L van 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, om splijting mogelijk te maken en om overtollig imidazol uit het monster te verwijderen voor de daaropvolgende zuivering.
  3. Dag 4 – Verwijder het monster van dialyse. Voer een SDS-PAGE gel van het monster uit van TEV decolleté om ervoor te zorgen dat het splijting is voltooid.
  4. Op een snel vloeistofchromatografie systeem verwijdert u ethanol uit een iMac 5 ml kolom met 25 ml ultrapuur H2O bij 5 ml/min, gevolgd door 25 ml elutie buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, dan bindende buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0.
  5. Laad de kolom bij 1 mL/min met TEV-cleaved NEMO-EEAA. Cleaved NEMO-EEAA zal in de doorstroom elzen: verzamelen in een 96 well fractie Verzamel plaat (1 mL fracties). Was de kolom voor vijf kolom volumes van 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol bij 1 mL/min, en Verzamel ze in de verzamel plaat voor breuken.
  6. Elute TEV en uncleaved zijn6-Nemo-eeaa met drie kolom volumes van 20 mm Tris, 150 mm nacl, 500 mm imidazole, 2 mm DTT, pH 8,0, opvang van elutie in een kolf van 50 ml.
  7. Voer SDS-PAGE gel van doorstroom fracties uit om de aanwezigheid van gespleten NEMO-EEAA te bepalen.
  8. Pool doorstroom fracties met gesplitst Nemo-eeaa construct, en concentreer u met behulp van een stirred-Cell concentrator tot 5 ml. Cut-off membraan molecuulgewicht (MWCO) = 3 kDa.
  9. Met behulp van een 3 kDa MWCO membraan, dialyze geconcentreerd monster in 2 L van 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 voor 2 h. Verander de dialyse buffer in 2 L verse dialyse buffer voor nachtelijke dialyse (ongeveer 15 uur), bij 4 °C.
  10. Dag 5 – laden 5 mL van het dialyzed monster op een grootte uitsluitings chromatografie (SEC) 16 mm x 60 cm kolom (34 μm gemiddelde deeltjesgrootte) bij 1 mL/min in 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Herhaal dit met extra kolommen, afhankelijk van het sample volume.
  11. Pool de fracties die overeenstemmen met dimeer Nemo-eeaa.
    Opmerking: Nemo-eeaa kolom tussen 60-65 ml, overeenkomend met een groter molecuulgewicht eiwit, vanwege de langwerpige aard van de dimeer spiraal spiraal.
  12. Concentraat met behulp van een stirred-Cell-concentrator en een MWCO = 3 kDa-membraan tot een eindconcentratie van 113 μM (1,65 mg/mL).
  13. Aliquot het eiwit en bewaren bij 4 °C (stabiel gedurende 1 maand).

5. Sparse matrix screening

Opmerking: het protocol voert kristallisatie proeven uit met behulp van commercieel beschikbare schermen en het instellen van Sit drop experimenten met behulp van een kristallisatie robot. Crystal-afbeeldingen worden automatisch verzameld door een Imager.

  1. Gebruik in de handel verkrijgbare Sparse matrix schermen (Zie tabel met materialen), pipetteer 60 μL Sparse matrix oplossing in elk van de 96 putjes van een 2 druppel kamer kristallisatie plaat voor zittende druppel damp diffusie (reservoir oplossing).
  2. Met behulp van een robot-druppel setter, doseren 100 nL eiwit oplossing bij 1,65 mg/mL in een 1:1 verhouding met reservoir oplossing in druppel 1 voor een eindvolume van 200 nL; dan 66 nL eiwit oplossing met 134 nL reservoir oplossing voor een eindvolume van 200 nL in drop 2 (1:2 ratio).
  3. Sluit de plaat direct na het doseren aan met een 3-inch afdichtingsband.
    Opmerking: druppels zullen uitdrogen als ze langer dan 2-3 min aan de atmosfeer worden blootgesteld.
  4. Bewaar de trays in de kristallisatie Imager-opslag bij 20 °C en controleer de beelden die automatisch worden verzameld voor Crystal Presence, beginnend na twee dagen.
    Opmerking: de kristallisatie screening verliep parallel met de construct optimalisatie. Initiële kristallen gevormd in de volgende omstandigheden (commerciële schermen vermeld in de tabel van de materialen): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30% v/v POLYETHYLEENGLYCOL (PEG) Mme 550, 5% poly-γ-glutaminezuur, 200-400 kDa laag moleculair gewicht polymeer (PGA-LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Sparse matrix scherm kristallen zal hebben slechte rooster uniformiteit; Daarom zullen ze er slecht uitzien met behulp van cross-gepolariseerde beeldvorming. Gebruik UV-beeldvorming om ervoor te zorgen dat de kristallen eiwitten bevatten. De volgende stap voor het genereren van zaad voorraden is noodzakelijk voor het verkrijgen van de uiteindelijke diffractie kwaliteits kristallen.

6. zaad voorraad opwekking

NB: wij verkrijgen in 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20k reproduceerbare kristallen voor zaad opwekking. Kristallen zullen echter een hoge mosaiciteit vertonen en zijn in dit stadium ongeschikt voor het verzamelen van gegevens.

  1. Gebruik een Kit voor zaad opwekking, bereid de zaad voorraad voor door de gehele druppel met kristal aanwezig te pipetteren en plaats in 50 μL kristallisatie voorwaarde oplossing in de meegeleverde injectieflacon.
  2. Vortex de zaden voorraad 3 min, pulserend 20 s aan en 10 s uit.
  3. Zaad voorraad wordt in 1:10 verhoogd tot 1:10000. Bewaar alle verdunningen bij 4 °C, voor verder gebruik.

7. fijne schermen

  1. Ontwerp fijne schermen, variërend van de voorwaarden voor Tris, PGA-LM en PEG. De lengte van de PEG varieert voor afzonderlijke trays.
    Opmerking: het fijne scherm dat het kristal heeft geproduceerd dat voor de structuurbepaling van NEMO-EEAA wordt gebruikt, heeft de volgende voorwaarden gehanteerd: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM varieerde van 8 tot 0% in kolommen 1-12. Rijen A-H screenen verschillende pinnen, met concentraties variërend in kolommen 1-12 als volgt. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Het kristal verscheen in goed H4 (5,45% w/v PEG 20k, 5,8% w/v PGA-LM). In dit protocol werd een proteïne kristallography screen Builder Liquid handler gebruikt om de schermen te bouwen.
  2. Zaai een proteïne aandeel in een 1:25 volume ratio van 1:1000 zaad verdunning.
    Opmerking: de concentratie van NEMO-EEAA zal iets dalen, maar er zullen nog steeds kristallen vormen.
  3. Herhaal stap 2 met 1:10000 zaad verdunning, zelfde 1:25 volume ratio.
  4. Met behulp van de druppel setter, doseren 100 nL eiwit oplossing bij 1,65 mg/mL, met 1:1000 verdunning van de zaad voorraad in een 1:1 verhouding met reservoir oplossing in druppel 1 voor een eindvolume van 200 nL. Herhaal dit voor drop 2, maar met 1:10000 verdunning van zaad voorraad aanwezig.
  5. Sluit de plaat direct na het doseren aan met een 3-inch afdichtingsband.
    Opmerking: druppels zullen uitdrogen als ze langer dan 2-3 min aan de atmosfeer worden blootgesteld.
  6. Bewaar de trays in de imager-opslag bij 20 °C en controleer de beelden die na twee dagen zijn verzameld voor de aanwezigheid van kristallen.
  7. Controleer de kristallen met de cross-polarizer Imager voor de gelijkmatigheid van de rooster, om te selecteren voor enkele voorwaarden voor het instellen van de volgende trays.

8. generatie van kristallen voor het verzamelen van gegevens

  1. Ontwerp enkele conditie schermen rond Tris, PGA-LM en PEG condition, die uniforme kristallen produceerde zoals geanalyseerd doorkruis gepolariseerde beelden, en de grootste kristallen mogelijk.
    Opmerking: kristallen uit deze voorwaarden zijn onregelmatig van vorm, meestal rechthoekige dunne vellen. Het is de sleutel om een voorwaarde te selecteren waarbij de randen van het kristal goed gedefinieerd zijn en de grootst mogelijke dikte hebben.
  2. Maak 20 mL kristallisatie conditie met de hand.
  3. Gebruik een multi-channel pipettor, Doseer 60 μL per put in een 2 druppel kamer, 96 goed kristallisatie plaat voor zittende druppel damp diffusie.
  4. Bereid de zaad voorraad voor zoals beschreven in stap 6,2.
  5. Verdeel het eiwit zoals beschreven in stap 6,3.
  6. Sluit de plaat direct na het doseren aan met een 3-inch afdichtingsband.
    Opmerking: druppels zullen uitdrogen als ze langer dan 2-3 min aan de atmosfeer worden blootgesteld.
  7. Bewaar de trays in de imager bij 20 °C en controleer elke dag de beelden op de aanwezigheid van kristallen.
  8. Controleer kruislings gepolariseerde beelden van de kristallen voor de uniformiteit van het rooster, om kristallen te selecteren voor het verzamelen van gegevens.

9. bepaling van Cryo-Protectant

  1. Voor het testen van de Cryo-protectants, het creëren van stamoplossingen die overeenkomen met de kristallisatie omstandigheden, maar met 30%, 20%, 10%, en 5% hogere concentratie van elk onderdeel. De toevoeging van het Cryo-Protectant volume zal resulteren in een uiteindelijke concentratie van componenten die hetzelfde is als de kristallisatie omstandigheden.
    Opmerking: voor het testen van een Cryo-Protectant bij een 30%-concentratie op volume voor een kristallisatie voorwaarde van 0,1 M Tris, begint u met een stamoplossing van 0,143 M Tris, voordat u de Cryo-Protectant toevoegt.
  2. Maak van een Cryo-reagentia Kit 10 μL monster voor Cryo-Protectant test door het mengen van 30% volume Cryo conditie in 70% van de kristallisatie conditie stockoplossing, voor een uiteindelijke concentratie van 30% Cryo-Protectant in oorspronkelijke kristallisatie omstandigheden. Meng.
    1. Neem met een pipet van 10 μL 5 μL test-Cryo-beschermde oplossing en dompel de pipetpunt in vloeibare stikstof. Als ijs wordt waargenomen, gooi het dan weg.
    2. Test alle Cryo-protectants op 30%. Voor de succesvolle oplossingen, herhaal het proces op 20%, dan 10% en 5% van Cryo-Protectant.
    3. Gebruikmakend van de succesvolle Cryo-Protectant oplossing met het kleinste percentage Cryo-Protectant, Voeg 0,5 μL oplossing toe aan een test druppel met aanwezige kristallen. Observeren onder Microscoop, timing hoe lang kristal duurt in de voorwaarde, indien niet onbepaalde tijd.
      Opmerking: deze kristallen zijn alleen voor test en zullen worden weggegooid. Voor NEMO-EEAA is 12% 1,2-propanediol de optimale Cryo-Protectant oplossing. 12% rekeningen voor de verdunning de Cryo-Protectant oplossing zal ervaren wanneer toegevoegd aan de kristallen druppel van ongeveer 100 nL, voor een geschatte eindconcentratie van 1,2-propanediol van 10%.

10. kristallen looping

  1. Lus kristallen 1-2 dagen voor verzending naar Synchrotron.
    Opmerking: kristallen zullen ongeveer 60-100 μm in diameter zijn: 0,05-0,10 mm lussen zijn ideaal voor looping.
  2. Knip de tape van de bovenkant van de put.
  3. Voeg 0,5 μL kristallisatie oplossing met 12% 1,2-propanediol Cryo-Protectant rechtstreeks toe aan de put.
    NB: de uiteindelijke concentratie van 1,2-propanediol is nu ongeveer 10%, als gevolg van verdunning met 100 nL druppel oplossing (bij benadering daling Volume reductie vanaf de eerste 200 nL, als gevolg van damp diffusie).
  4. Loop het kristal van de put.
    Let op: kristallen groeien vaak op de bodem van de put, maar zullen vergaan met een zachte duwtje van de lus. Eenmaal ontbonden, lus.
  5. Bewaar het kristal met Cryo-loops in pucks ondergedompeld in vloeistof N2.
  6. Bewaar deze pucks in vloeistof N2 in de Dewar kolf totdat ze klaar zijn voor verzending voor röntgendiffractie bij de Synchrotron.

11. verzamelen van gegevens

  1. Verzamel X-Ray diffractie-gegevens. Gebruik in dit protocol AMX beamline (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
    Opmerking: gegevens zijn verzameld op de site, maar kunnen op afstand worden verzameld. Verzamel gegevens in de regio van het kristal die de uniformiteit van de rooster in cross-gepolariseerde beelden toonde. Plaats de kristallen in de lus zodat de gegevensverzameling geen "arme" gebieden van het kristal omvat terwijl het kristal in de goniometer draait. Gegevens die de beste resolutie hadden, kwamen van verzameling op de rand van een uitbreiding van een kristal ongeveer 5 x 5 μm groot. Gebruik een rastering om de beste gebieden op het kristal te identificeren om20te verzamelen.

12. X-Ray gegevensverwerking

  1. Verwerk gegevensset naar de hoogste resolutie die is verzameld (1,8 Å) met XDS IDXREF-programma om de ruimtegroep, eenheidcel en oplosmiddel inhoud te bepalen.
  2. Integreer data met behulp van XDS Integreer programma.
  3. Proces geschaalde intensiteiten van XDS XSCALE programma met behulp van STARANISO-server, met behulp van I/σI cutoff gemiddelde van 1,2 voor diffractie-limiet oppervlak voor de gegevens.
    Opmerking: gegevens worden niet in True ellipsoid gesneden. Bewaar alle gegevens boven de I/σI van 1,2 cutoff. De statistieken over de gegevens die worden berekend voor sferische volledigheid zullen slecht zijn, vanwege de niet-sferische truncation. De elliptische volledigheid was 88% met de hoogste resoluties van respectievelijk: 1,88 Å, 2,10 Å en 2,55 Å langs de a *, b * en c-as.

13. structuur oplossing

  1. Gebruik de Röntgen structuur van GCN4 (PDB: 4DMD)15 als Zoek model voor moleculaire vervanging met behulp van mrage21 in Phenix22. De 4dmd-structuur werd gedefinieerd in mrage als een "Ensemble", en de mrage-oplossing bouwde met succes het structuur gedeelte dat overeenkomt met de N-terminale spiraalvormige spoel adapter van Nemo-eeaa, homologe aan het zoek model, voor beide kettingen in de Dimer.
    Opmerking: anisotropie-correctie in PHASER uitschakelen of gegevens worden verder geschaald.
  2. Gebruik opeenvolgende rondes van autobuild23 in Phenix en Manual Building (met behulp van 2Fo-fc en fo-fc Maps, in Coot24) om de rest van de structuur te bouwen.
  3. Bouw handmatig de resten die nog ontbreken in het model op basis van 2Fo-fc en fo-fc kaarten, met behulp van Coot24.
    NB: de laatste fase betrof de bouw van de 4 N-terminale residuen en 4 C-terminale residuen voor elk monomeer. De plaatsing van de sidechain werd indien nodig ook handmatig aangepast.
  4. Bereken een samengestelde weglaten kaart met behulp van PHENIX en een 10% omissie van de structuur.

14. structuur verfijning

  1. Verfijn de structuren met PHENIX verfijnen. Voer de initiële verfijningen tegen bulk-oplosmiddel en stereochemie gewichten, ontspannende RMSbond en RMSangle beperkingen 0,01 en 1,0, respectievelijk. Ga verder met verfijning op individuele B-factoren, TLS-parameters en bewerkers.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonen, expressie en zuivering van het IKK-bindende domein van NEMO.
Het protocol gevolgd in deze studie om de definitieve sequentie van NEMO-EEAA (Figuur 1A), die produceerde diffractie kwaliteit kristallen, betrokken de uitdrukking en de karakterisering van alle tussenliggende constructies, met inbegrip van de toevoeging van de spiraalvormige Coil adapters op N-en of C-Terminus, de mutaties C76A, C95S en de mutaties E56A, E57A. Figu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kristallisatie pogingen van Nemo in de ongebonden vorm waren mislukt, inclusief pogingen met behulp van het volledige eiwit en verschillende afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten. Onze biofysische karakterisering van het IKK-bindende domein van Nemo (residuen 44-111) door Circulair dichroisme, NMR-spectroscopie en fluorescentie anisotropie gaf aan dat de constructie, zij het in staat om ikkβ te binden, bestond in een toestand van conformationele Exchange, niet geschikt voor kristallisatie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Prof. D. Madden voor veel nuttige discussies tijdens dit project. We danken Prof. D. Bolon voor de gave van het plasmide met de geoptimaliseerde GCN4 spiraalvormige spoel. We danken Dr. B. Guo voor NEMO plasmids. We danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili en Amy E. Kennedy voor het aantonen van de procedure. We danken de kern faciliteit voor BioMT kristallografie en de afdelingen chemie en Biochemie & celbiologie bij Dartmouth voor het gebruik van de kristallografie apparatuur en het BioMT-personeel voor hun ondersteuning. Dit onderzoek gebruikte de AMX beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse afdeling van energie (DOE) Office of Science User Facility voor het DOE Office of Science door Brookhaven National Laboratory onder contract nr. DE-SC0012704. We danken het personeel van NSLS II voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door NIH grants R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 en P20GM113132, en een Munck-Pfefferkorn roman en interactieve subsidie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM)MolecuuldimensiesMD2-100-150Voor fijne schermkristallisatie van NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO dialysemembraanSpectra/Por132724Voor dialyse-verwijdering van imidazool
Amicon geroerde celMillipore SigmaUFSC 05001Voor eiwitconcentratie
AmmoniumchlorideMillipore SigmaG8270Voor minimale medialabeling
Benzonase-nucleaseMillipore Sigma9025-65-4Voor vertering van nucleïnezuur
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competente cellenAgilent TechnologiesModel: 230245TEV-expressie
CryoProHampton ResearchHR2-073Cryo-beschermingskit
D-Glucose (Dextrose)Millipore SigmaA9434Voor minimale medialabeling
Difco Terrific BrothThermoFisherDF043817Voor kweekgroei
Dithiothreitol > 99%GoldbioDTT25Voor reductie van disulfiden
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Expressie van niet-gelabelde NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixVloeistofhandler/ schermbouwer
HCl – 1,0 M-oplossingHampton ResearchHR2-581Voor fijne schermkristallisatie van NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333Voor zuiveringszuivering
HisTrap HP 5 mL-kolomGE Healthcare17524802Voor zuivering van His-getagd NEMO-EEAA
HT 96 MIDASMolecular DimensionsMD1-59Voor dunne matrixscreening van NEMO-EEAA
HT 96 MorpheousMolecular DimensionsMD1-46Voor dunne matrixscreening van NEMO-EEAA
ImidazoolThermoFisher288-32-4Voor elutie uit His-trap kolom
Isopropyl-bèta-D-thiogalactosideGoldbioI2481C5Voor inductie van culturen
MRC2-kristallisatieplaatHampton ResearchHR3-083Kristallisatieplaat
NT8 - Drop SetterFormulatrixKristallisatie
pET-16bMillipore Sigma69662Voor klonering van NEMO-EEAA
pET-45bMillipore Sigma71327Voor klonering van NEMO-EEAA
FenylmethysulfonylfluorideThermoFisher36978Voor remming van proteasen
Polycarbonaatfles voor gebruik in Ultracentrifuge Rotor Type 45 TiBeckmann Coulter339160Ultracentrifugefles
Polyethyleenglycol 20.000Hampton ResearchHR2-609Voor fijne schermkristallisatie van NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827Voor TEV-productie
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522Geplaatste richtingsmutagenese
Vereiste dopsamenstelling:Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge flesdop
ROCK IMAGERFormulatrixKristallisatie Imager
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320Seedgeneratie
Natriumchloride ≥ 99%Millipore SigmaS9888Voor buffering van zuiveringsoplossingen
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl)fosfinehydrochloride)GoldbioTCEP1Reductiemiddel
The Berkeley ScreenRigakuMD15-BerekelyVoor dunne matrixscreening van NEMO-EEAA
The PGA ScreenMolecular DimensionsMD1-50Voor fijne schermkristallisatie van NEMO-EEAA
Tris – 1,0 M-oplossingHampton ResearchHR2-589Voor fijne schermkristallisatie van NEMO-EEAA
Ultrapure Tris-buffer (poederformaat)Thermofisher15504020Voor buffering van zuiveringsoplossingen
UreaThermoFisher29700Voor denaturatie van NEMO-EEAA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663(2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950(2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

IKK binding DomainNEMO ProteinProtein ExpressionChromatographic PurificationSize ExclusionCrystallization ScreeningX ray DiffractionMolecular ReplacementCoiled coil AdapterTEV Protease

Related Articles