Het detrusor vrije blaas model maakt directe toegang tot het suburothelium mogelijk om lokale mechanismen te bestuderen voor regulatie van biologisch actieve mediator beschikbaarheid in suburothelium/lamina propria tijdens opslag en het vernietigen van urine. Het preparaat lijkt sterk op het vullen van een intacte blaas en maakt het mogelijk om druk volume studies te verrichten zonder systemische invloeden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een gedecentraliseerd (ex vivo) Murine blaas model met de detrusor spier verwijderd voor directe toegang tot het Suburothelium tijdens blaas vulling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eerdere studies hebben het vrijkomen van chemische stoffen uit platte blaas slijmvlies bladen vastgesteld in Ussing kamers en blootgesteld aan veranderingen in hydrostatische druk of mechanisch stretch en uit gekweekte oerotheliale cellen bij hydrostatische drukveranderingen, Stretch, celzwelling, of sleep krachten, en in blaas lumen aan het einde van het vullen. Dergelijke bevindingen leidden tot de veronderstelling dat deze bemiddel kers ook vrijkomen in suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) tijdens blaas vulling, waar ze de cellen diep in de blaaswand beïnvloeden om uiteindelijk de prikkelbaarheid van de blaas te reguleren. Er zijn ten minste twee duidelijke beperkingen in dergelijke studies: 1) geen van deze benaderingen bieden directe informatie over de aanwezigheid van mediatoren in SubU/LP, en 2) de gebruikte stimuli zijn niet fysiologisch en niet recapituleren authentieke vulling van de blaas. Hier bespreken we een procedure die directe toegang tot het suburotheliale oppervlak van het blaas slijmvlies in het verloop van de blaas vulling mogelijk maakt. De Murine detrusor-vrije bereiding die we hebben gemaakt, lijkt sterk op het vullen van de intacte blaas en maakt het mogelijk om druk volume studies op de blaas uit te voeren bij afwezigheid van verstorende signalering uit spinale reflexen en detrusor gladde spieren. Met behulp van het Roman detrusor-Free blaas model hebben we onlangs aangetoond dat intravesicale metingen van mediatoren niet kunnen worden gebruikt als een proxy voor wat is vrijgegeven of aanwezig in de SubU/LP tijdens blaas vulling. Het model maakt onderzoek mogelijk van urothelium-afgeleide signaal moleculen die vrijkomen, gegenereerd door metabolisme en/of getransporteerd naar de SubU/LP tijdens de blaas vulling om informatie naar neuronen en gladde spieren van de blaas te zenden en de prikkelbaarheid te reguleren tijdens continentie en mictie.
Inleiding
Het doel van dit model is om directe toegang tot de submucosale kant van de blaas mucosa tijdens verschillende fasen van de blaas vulling mogelijk te maken.
De blaas moet afzien van voortijdige contractie tijdens het vullen en leeg zijn wanneer kritische volume en druk worden bereikt. Abnormale continentie of het vernietigen van urine worden vaak geassocieerd met abnormale prikkelbaarheid van de detrusor gladde spieren (DSM) in de loop van de blaas vulling. De prikkelbaarheid van DSM wordt bepaald door factoren die inherent zijn aan de gladde spiercellen en door invloeden die worden gegenereerd door verschillende celtypen binnen de blaaswand. De wand van de urineblaas bestaat uit urothelium (slijmvlies), suburothelium (SubU)/lamina propria (LP), detrusor gladde spieren (DSM) en serosa (Figuur 1a). Het urothelium bestaat uit paraplu cellen (d.w.z. de buitenste laag van het urothelium), intermediaire cellen en basale cellen (d.w.z. de binnenste laag van het urothelium). Verschillende soorten cellen, waaronder interstitiële cellen, fibroblasten, afferente zenuw terminals, kleine bloedvaten en immuuncellen bevinden zich in de SubU/LP. Er wordt algemeen verondersteld dat het blaas-urothelium een sensorisch orgaan is dat reflex mictie en continentie initieert door middel van mediatoren in de de die cellen in de subu/LP en de DSM1,2,3beïnvloeden. Voor het grootste deel zijn dergelijke veronderstellingen gebaseerd op studies die hebben aangetoond dat mediatoren vrijkomen: van stukjes slijmvlies blootgesteld aan veranderingen in hydrostatische druk4,5; van gekweekte oerotheliale cellen blootgesteld aan stretch6,7, hypotoniteit-geïnduceerde cel zwelling7 of sleep krachten8; van geïsoleerde blaaswand stroken op receptor of zenuw activatie9,10,11,12,13,14; en in blaas lumen aan het einde van de blaas vulling15,16,17,18,19. Hoewel dergelijke studies instrumentaal waren om het vrijkomen van bemiddel kers bij mechanische stimulatie van blaaswand segmenten of gekweekte oerotheliale cellen aan te tonen, moeten ze worden ondersteund door direct bewijs voor het vrijkomen van mediatoren in de de die wordt opgewekt door fysiologische stimuli die blaas vulling reproduceren. Dit is een uitdagende taak gezien het feit dat de SubU/LP zich diep in de blaaswand bevindt die de eenvoudige toegang tot de nabijheid van SubU/LP belemmert tijdens het vullen van de blaas.
Hier illustreren we een gedecentraliseerd (ex vivo) Murine blaas model met de detrusor spier verwijderd13 die werd ontwikkeld om studies te faciliteren over lokale mechanismen van mechanotransductie die deelnemen aan de signalering tussen de blaas-urothelium, DSM en andere celtypen in de blaaswand. Deze aanpak is superieur aan het gebruik van platte blaaswand vellen, blaaswand stroken of gekweekte urotheliale cellen, omdat het directe metingen toelaat in de nabijheid van SubU/LP van urothelium-afgeleide bemiddel kers die vrijkomen of gevormd worden als reactie op fysiologische druk en volumes in de blaas en voorkomt mogelijke fenotypische veranderingen in de celcultuur. Het kan worden gebruikt voor het meten van beschikbaarheid, vrijkomen, metabolisme en transurotheliaal transport van mediatoren in SubU/LP in verschillende stadia van blaas vulling (Figuur 1b). De bereiding kan ook worden gebruikt om de urotheliale signalering en mechanotransductie in modellen van overactieve en onderactieve blaas syndromen te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieren die in dit manuscript worden beschreven, zijn uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en het institutionele dierengebruiks-en zorg Comité van de Universiteit van Nevada.
Opmerking: het hier gepresenteerde model bestaat uit het verwijderen van de detrusor spier terwijl het urothelium en subu/LP intact blijven (Figuur 1B) om onderzoekers in staat te stellen direct toegang te krijgen tot subu/LP in het verloop van de blaas vulling.
1. dissectie van de detrusor-vrije blaas voorbereiding
- Plaats de geïsoleerde blaas in een afsnij schaal gevuld met koud (10 °C) en met zuurstoftoevoer met 5% CO2/95% O2 Krebs BICARBONAAT oplossing (KBS) met de volgende samenstelling (mm): 118,5 NaCl, 4,2 KCl, 1,2 mgcl2, 23,8 NaHCO3, 1,2 KH2po4, 11,0 dextrose, 1,8 CACL2 (pH 7,4)13.
- Speld een klein deel van de koepel van de geïsoleerde blaas aan een door Sylgard bedekte dissectie schotel gevuld met KBS. Zorg ervoor dat de PIN gaat door een stuk van de serosa of de buitenste rand van de detrusor spier ver van de binnenste rand van de spier die wordt geconfronteerd met de SubU/LP.
- Identificeer met behulp van een microscoop de urethra en urineleiders en speld elk van hen aan de onderkant van de dissectie schotel.
- Verwijder het overtollige vetweefsel en bindweefsel zodat het hele hoofd lichaam van de blaas, de urethra en beide urineleiders worden weergegeven.
- Bind de urineleiders met 6-0 nylon hechtingen. Speld vervolgens de open uiteinden van urineleiders naar de onderkant van de ontsnij bare schaal om de bereiding te beveiligen.
- Met behulp van fijn-Tip Tang, Trek voorzichtig een stukje van de serosa op de hoek tussen de urineleider en de blaas lichaam.
- Pas het licht van de Microscoop aan om de transparantie te vergroten en de marge van de de onder de detrusor spier te onderscheiden.
- Begin met snijden (niet peeling!) de blaaswand met fijn punt schaar langs het binnenoppervlak van de detrusor spierlaag terwijl het snij segment voorzichtig uit de buurt van het preparaat wordt getrokken. Te allen tijde, ervoor te zorgen dat de laterale rand van slijmvlies kan worden gezien en Vermijd aanraken.
- Verwijder de detrusor spier volledig door de ontsnij schaal te draaien zodat de positie van het preparaat comfortabel is om door te gaan met het ontleden van de ontspanende spier.
- Laat een klein stukje detrusor spier op de bovenkant van de blaas koepel om de mogelijkheid te garanderen om de voorbereiding te immobiliseren tijdens de resterende stappen van het protocol.
- Maak een dubbele lus van 6-0 nylon draad, plaats deze rond de hals van de blaas voorbereiding en laat de lus los.
- Voeg een tweede dubbele lus van 6-0 zijden draad, plaats het rond de hals van de blaas voorbereiding, en laat de lus verliezen. Het hebben van twee hechtingen voorkomt lekken rond de hechtingen.
- Snijd ongeveer 2 cm van 20 PE tubing (katheter), opflakkering van de tip door langzaam bewegen de punt dicht bij een vlam.
- Vul de katheter met warme (37 °C) zuurstof KBS.
- Plaats de katheter in de opening van de blaas urethra en duw voorzichtig de katheter totdat de katheter Tip ongeveer het midden van de blaas bereikt.
- Bind de hechtdraad rond de katheter en het omringende weefsel van de blaashals.
- Vul de blaas langzaam met ongeveer 50-100 μL warme (37 °C) zuurstof KBS, til deze kort op (< 10 s) boven het oppervlak van KBS en bewaak de lekkages bij de hechtingen en de blaas organen.
- Als er geen lekkage wordt waargenomen, is het preparaat klaar voor het experiment. Als er een lek rond de hechtdraad wordt waargenomen, verwijdert u de hechting en vervangt u deze. Als een lek uit een gat in de blaas lichaam wordt opgemerkt, gooi het preparaat weg.
2. vulling van de Gedenudeerde blaas voorbereiding
- Parfumeren KBS (37 ° c) in een 3 ml kamer van een water (37 °c) mantel orgel schotel met een sylgard bodem.
- Pas de zuurstof-en zuigleidingen aan.
- Plaats de gedenuded blaas preparaat in de kamer.
- Bevestig de katheter aan de zijkant van de kamer zodat het preparaat niet boven het oppervlak van de perfusie oplossing zweeft.
- Verbind de blaaskatheter met een langere PE20 slang (infuuslijn) die is aangesloten op de drie richtings kraantje met dezelfde maat fitting.
- Zorg ervoor dat de lijnen tussen de infusiepomp, de druk transducer en de blaas open zijn.
- Vul de infusie spuit met verse, warme (37 °C) en zuurstof zuur KBS.
- Stel de pomp parameters in: type/volume spuit (d.w.z. 1 mL), werking (d.w.z. Inzekering), debiet (d.w.z. constant) en debiet (d.w.z. 15 μL/min).
- Druk op de Start knop op de pomp van de spuit om de blaas te vullen.
- Monitor vulvolume en intravesicale druk tijdens het vullen van de blaas.
3. detectie van mediatoren in het SubU/LP-aspect van de voorbereiding van de Gedenudeerde blaas
- Verzamel aliquots van de badoplossing in ijskoude micro centrifugebuizen of hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) wisselplaten.
- Voorbereiden en verwerken van de monsters volgens de juiste detectie toepassing. In het geval van het opsporen van de beschikbaarheid van de purine, de monsters verwerken met HPLC met fluorescentiedetectie13,18.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De wand van Murine detrusor-vrije blaas voorbereiding is intact en bevat alle lagen behalve de DSM en serosa. Proof-of-principe studies toonden aan dat de DSM-vrije blaaswand urothelium en SubU/LP bevat terwijl de Tunica Muscularis en de serosa afwezig zijn (Figuur 2)13.
Het vullen van de detrusor-vrije blaas benadert de normale blaas vulling. Fi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De blaas heeft twee functies: opslag en het vernietigen van urine. De normale werking van deze functies vereist een goede mechanische detectie van het intraluminale volume en de druk en de transductie van signalen via cellen in de blaaswand om de prikkelbaarheid van de detrusor te reguleren. Het blaas slijmvlies (urothelium) wordt verondersteld om de blaas prikkelbaarheid te reguleren door het vrijgeven van een verscheidenheid van signalering moleculen in de subu/LP die invloed hebben op talrijke celtypen in de blaaswand...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Onderdelen van dit werk werden eerder gepubliceerd in het Journal of Fysiologie (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). Toestemming is verleend door Wiley en Sons, Inc. voor het gebruik van materialen uit deze publicatie. De auteurs hebben geen financiële of andere conflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door het National Institute of diabetes en spijsverterings-en nierziekten Grant DK41315.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | Bron flexibel |
| Dextrose | Fisher | D16 | Bron flexibel |
| Dissectiepennen | Fine Science Tools | 26002-20 | Bron flexibel |
| Infuuspomp | Kent Scientific | GenieTouch | Bron flexibel |
| KCl | Fisher | P217 | Bron flexibel |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Bron flexibel |
| Lichtbron | SCHOTT ACEI | Bron flexibel | |
| Microscoop | Olympus SZX7 | Flexibel om elke microscoop te gebruiken | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Bron flexibel |
| NaCl | Fisher | S671 | Bron flexibel |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Bron flexibel |
| Naalden 25G | Becton Dickinson | 305122 | Bron flexibel |
| Organenbad | Op maat gemaakt | Flexibele bron; We maakten het van Radnoti dissectieschaal | |
| PE-20 slang | Intramedic | 427405 | Bron flexibel |
| Druktransducer | AD instrument | Bron flexibel | |
| S&T Pincetten | Fine Science Tools | 00632-11 | Bron flexibel |
| Software druk-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Sutuur Nylon, 6-0 | AD chirurgisch | S-N618R13 | Bron flexibel |
| Sutuur Zijde, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Bron flexibel |
| Spuiten 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Bron flexibel |
| Vannas-veerschaar | Fine Science Tools | 15000-08 | Bron flexibel |
| Watercirculator | Baxter | K-MOD 100 | Bron flexibel |
Referenties
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
