Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60347

⸱

3 december 2019

 , 
1Department of Neurobiology, Stanford University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Samenvatting

Als Resident macrofagen in het centrale zenuwstelsel, Microglia actief controle van de ontwikkeling van de hersenen en homeostase, en hun disfuncties kunnen menselijke ziekten stimuleren. Er zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt om de moleculaire handtekeningen van homeostatische Microglia en veranderingen van hun genexpressie te onthullen in reactie op milieu stimuli. Met de opkomst en rijping van eencellige genomische methodologieën wordt steeds meer erkend dat heterogene Microglia de verschillende rollen kan onderdoen die ze spelen in verschillende ontwikkelings-en pathologische omstandigheden. Verdere dissectie van dergelijke heterogeniteit kan worden bereikt door efficiënte isolatie van Microglia uit een bepaald gebied van belang, gevolgd door een gevoelige profilering van individuele cellen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de snelle isolatie van Microglia uit verschillende hersengebieden in een enkele volwassen muis hersen hemisfeer. We laten ook zien hoe je deze gesorteerde Microglia gebruikt voor op platen gebaseerde Deep single-cell RNA-sequencing. We bespreken het aanpassingsvermogen van deze methode voor andere scenario's en bieden richtlijnen voor het verbeteren van het systeem voor grootschalige studies.

Inleiding

Microglia, dat 5% − 10% van alle neurale cellen vertegenwoordigt, zijn ingezeten macrofagen verspreid over het centrale zenuwstelsel (CNS)1. Beschermd achter de bloed-hersen barrière, typische Microglia in een gezonde volwassen hersenen bevatten vele fijne processen die snel uitbreiden en intrekken om te communiceren met neuronen en andere gliacellen in het parenchym. Microglia kan ook de amoeboïde morfologie aannemen die gepaard gaat met een verhoogde fagocytische functie tijdens specifieke ontwikkelingsstadia of bij immuunproblemen bij letsel en ziekte1,2,3,4. Recente spannende ontdekkingen hebben duidelijk aangetoond dat Microglia geenszins passieve omstanders zijn van hersenen-afgeleide of pathologische signalen, maar spelen cruciale rollen bij het beheersen van de hersenontwikkeling en homeostase, bijvoorbeeld door neuronale overleving te ondersteunen, onrijpe synapsen te snoeien, het bevorderen van oligodendrocyten Lineage cellen differentiatie evenals angiogenese1. Naarmate er meer functies van Microglia worden opgehelderd, wordt de opwinding verder gevoed door onderzoek naar menselijke genetica, waaruit bleek dat veel neurodegeneratieve ziektebestrijdings genen, zoals TREM2, overwegend of uitsluitend worden uitgedrukt door Microglia5,6,7. Gezien hun betekenis in de ontwikkeling en de plausibele rol van de ziekte, is er recentelijk een enorme inspanning geleverd naar ons begrip van microglial genregulatie en-functie in de hoop nieuwe therapeutische doelstellingen voor neurodegeneratieve ziekten van1,8te vinden.

RNA-sequencing (RNA-SEQ) maakt onbevooroordeelde karakterisatie van celtypespecifieke genexpressie mogelijk, die op zijn beurt wetenschappers begeleidt om genfuncties in dichte cellulaire netwerken7te onderzoeken. RNA-SEQ was grotendeels gedaan op bulk monsters, wat leidde tot de ontdekking van een homeostatische microglial gen Signature die hen onderscheidt van andere neurale en immune cellen9. Echter, een dergelijke aanpak kan over het hoofd zien moleculaire en functionele verschillen tussen Microglia, vooral die transitief aanwezig zijn in ontwikkeling, of geassocieerd met veroudering en ziekte. Inderdaad, single-cell RNA-SEQ (scrna-SEQ) biedt de gevoeligheid en resolutie die het veld hebben veranderd door het onthullen van eerder ondergewaardeerde heterogeniteit van Microglia in een verscheidenheid van contexten2,3,10. Bovendien, vanwege de aanwezigheid van andere soortgelijke immuuncellen op de CNS-circulatie-interface, biedt scRNA-SEQ informatie die het ontwerp van nieuwe instrumenten helpt om deze gerelateerde cellen te scheiden en functioneel te ontleden met weinig voorkennis2,11.

Een divers aanbod van scRNA-SEQ platformen zijn uitgevonden, elk geschikt voor bepaalde toepassingen12. In het algemeen zijn op droplet gebaseerde methoden, zoals 10x Genomics, hoger in doorvoer met (tientallen) duizenden cellen die in elke uitvoering worden gesequentieerd, en ze zijn minder selectief voor de invoer die gemengde celpopulaties kan bevatten die een brede categorisatie vereisen. Op plaat gebaseerde methoden bieden een hogere gevoeligheid en lees diepte13,14, meestal gericht op specifieke populaties van celsortering om subtiele verschillen of zeldzame transcripten te onthullen. Gezien het kleine percentage microglial cellen, met name die ontwikkelings-of ziektegebonden subpopulaties, is het vaak wenselijk om Microglia te isoleren van een specifieke regio van belang en diepe en volledige transcriptomische informatie te verkrijgen om hun heterogeniteit te begrijpen.

Hier geven we informatie over hoe Microglia te isoleren van verschillende muizen hersengebieden die worden ontleed van een enkele halve bol, die worden gebruikt voor eencellige (of bulk) RNA-SEQ na een semi-geautomatiseerde plaat-gebaseerde bibliotheek voorbereidingsprocedure. De andere halve bol kan vervolgens worden gebruikt voor histologische validatie. Gestroomlijnd vanaf een eerder gepubliceerde methode9, is dit isolatie protocol bedoeld om de opbrengst van kleine hoeveelheid start materialen te maximaliseren en ondertussen endogene microglial genexpressie profielen te onderhouden. We gebruiken fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om Microglia (of andere gerelateerde immuuncellen van belang) te verrijken in 96-well Plates en miniaturiseren de volumes van reagentia voor bibliotheek voorbereiding om de doorvoer te verhogen. We belichten dit gevoelige scRNA-SEQ-platform, hoewel andere op platen gebaseerde strategieën kunnen worden toegepast. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast om Microglia te isoleren van andere ontleed weefsels, zoals letsel of ziekte Foci, en de leeftijd van de muis kan variëren in bijna elke postnatale fase. Efficiënt isoleren van regionale Microglia voor onderzoeken met één cel transcriptomics zal een beter begrip van hun functies in gezondheid en ziekte vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot knaagdieren aan normen voldoende aan Stanford University richtlijnen, die voldoen aan nationale en staatswetten en beleid. Alle dier procedures zijn goedgekeurd door het administratief panel van Stanford University voor laboratoriumdieren verzorging.

Opmerking: Alle oplossingen en buffer composities zijn beschikbaar in de tabel van de materialen.

1. voorbereiding op de dag van de celisolatie

  1. Bereid de volgende reagentia en chill ze op ijs: medium A (50 mL), magnetisch-geactiveerde celsortering (MCS) buffer (30 mL), FACS buffer (25 mL), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) en RNase remmer (30 μL).
    Opmerking: De volumes die hier worden geleverd zijn voldoende om Microglia te isoleren van 4 hersengebieden (bijv. cortex, cerebellum, Hippocampus en striatum) van een hersen halfrond met één muis. Opschalen als er meer weefsels worden gebruikt.
  2. Plaats vier schone 2 mL Dounce homogeniseerders op ijs en voeg 2 mL medium A toe met 80 μL DNase (12.500 eenheden/mL) en 5 μL RNase-remmer in elke Dounce-homogenisator. Chill de zuigers in tubes van 15 mL.
  3. Label vier 6 cm Petri schaaltjes met hersengebieden voor weefsel inzameling en voeg 200 μL koelmedium A toe aan elk gerecht op ijs. Voeg ongeveer 5 mL medium A toe aan een 6 cm Petri schaaltje voor dissectie.
    Opmerking: Zorg er vóór gebruik voor dat alle reagentia steriel zijn en geschikt zijn voor RNA-toepassingen. Bank-en dissectie gereedschappen moeten schoon en besproeid zijn met RNase decontaminatieoplossing (tafel van materialen).

2. hersenregio dissectie

Opmerking: Deze stap moet ~ 30 minuten duren.

  1. Injecteer 400 − 500 μL ketamine/xylazine (24 mg/mL ketamine en 2,4 mg/mL xylazine) in het peritoneum van een juveniele tot volwassen podium muis (> 1 maand oud).
    Opmerking: Een mannelijke muis wordt hier gebruikt ter illustratie, maar beide geslachten zijn geschikt.
  2. Wacht 5 min en knijp een achterpoot om te zorgen voor een gebrek aan terugtrekking.
  3. Gebruik onmiddellijk een 26 G x 3/8 naald om transcardial perfusie uit te voeren met 20 − 30 mL ijskoude PBS totdat de buffer opraakt zonder zichtbaar bloed.
  4. Onthapitate de muis met een chirurgische schaar. Gebruik een kleine schaar om de huid open te snijden om de onder schedel bloot te leggen en snijd vervolgens door het sagittale hechtmiddel, lambdoidal hecht en coronale hecht. Gebruik de tang om beide zijden van het parietale bot en het interpariëtale bot te trekken zonder het weefsel te beschadigen en verplaats de hersenen voorzichtig in de dissectie Petri schaal met medium A.
  5. Gebruik een voorgekoeld blad om de hersenen door middel van de middenlijn in twee hemisferen te snijden.
    Opmerking: De vier hersengebieden die hier worden beschreven vanaf een enkele hemisfeer, leveren voldoende aantallen Microglia op voor eencellige of bulk-RNA-SEQ-toepassingen. De andere hemisfeer kan worden gebruikt voor Immunohistochemie of RNA in situ validatie.
  6. Scheid het cerebellum van de corticale LOB en de hersenstam met #55 Tang en breng het weefsel over in een collectie Petri schaaltje.
  7. Gebruik #55 tang om de hippocampus en het striatum uit de cortex zorgvuldig te ontleden en breng elk weefsel over in een collectie Petri schaaltje.

3. mechanische weefsel dissociatie

Opmerking: Houd cellen en reagentia de hele tijd koel, behalve tijdens kleurings stappen. Deze stap moet ~ 30 minuten duren.

  1. Hak elk hersenweefsel met een scheermesje in < 1 mm3 fijne stukjes.
  2. Gebruik 1 mL Pipet (met tips afgesneden) om weefsel stukken in de voorgekoelde Dounce homogeniseerders over te brengen, elk met 2 mL medium A met DNase en RNase remmer.
  3. Homogeniseer het weefsel door de zuiger langzaam in en uit de Dounce-homogenisator te draaien voor 6 − 10 volledige slagen, totdat er geen zichtbare brokjes aanwezig zijn.
    Opmerking: Douncing doodt neuronen en de meeste andere gliacellen, maar laat microglial cellen vrij intact. Zowel onvoldoende als over-douncing kan leiden tot lage opbrengst van cellen.
  4. Overdracht van gezien weefsels in 50 ml buizen door middel van 70 μm Strainers.
  5. Spoel elke Dounce homogenisator en zuiger met in totaal 6 mL koud medium A en filtreer de spoeloplossing door dezelfde zeef in de corresponderende buis.
  6. Breng de enkelvoudige cel suspensies (ongeveer 8 mL elk) over in 15 mL conische buizen en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c met rem = 5.

4. myeline verwijderen

Opmerking: Deze stap moet nemen ~ 60 min.

  1. Bereid 1 grote depletie kolom (LD) (voor cortex) en 3 kolommen met grote selectie (LS) (voor de andere 3 regio's) in een magnetisch scheidingsteken (tabel met materialen). Spoel elke kolom af met 3 mL MCS-buffer.
  2. Zodra centrifugeren is voltooid, Pipetteer en gooi het supernatant weg zonder de pellet te storen. Voor de weefsels van de cortex en cerebellum respendeert u cellen in 850 μL MCS-buffer met 1,8 μL RNase-remmer. Voor de weefsels van Hippocampus en striatum worden cellen in 400 μL MCS-buffer met 0,9 μL RNase-remmer hervat.
    Opmerking: De kolommen (LD vs. LS) en het volume dat wordt gebruikt voor resuspensie worden geoptimaliseerd op basis van de hoeveelheid myeline die aanwezig is in het weefsel. Als andere hersengebieden worden aangevallen, moeten deze voorwaarden mogelijk worden aangepast afhankelijk van de grootte van het weefsel en hoeveel myeline kan bestaan. De effectiviteit van het verwijderen van myeline kan worden geschat in stap 4,9.
  3. Voeg 100 μL myeline-verwijderings kralen toe, elk in cellen uit de cortex en de cerebellum en voeg 50 μL myeline-verwijderings kralen toe, elk in cellen van Hippocampus en striatum.
  4. Meng de cellen zachtjes met kralen en inincuberen de buisjes op ijs gedurende 10 minuten.
  5. Breng het volume van de buis met corticale cellen naar 2 mL met MCS-buffer en alle andere naar 1 mL (d.w.z., voeg 1 mL voor corticale cellen toe; 500 μL voor hippocampal-en striatale cellen; u hoeft geen buffer toe te voegen aan cerebellaire-cellen).
  6. Zodra de kolommen leeg zijn van de spoel buffer, plaatst u een buis van 15 mL onder elke kolom. Laad corticale cellen (2 mL) op de LD-kolom en alle andere (1 mL elk) op de LS-kolommen. Gebruik onmiddellijk 1 mL MCS-buffer om de originele buizen te wassen en de oplossing op de corresponderende kolommen te laden.
  7. Was de LD-kolom eenmaal met 1 mL MCS-buffer en was elke LS-kolom twee keer met 1 mL MCS-buffer per wasbeurt. Doorgaan met het verzamelen van de doorstroom oplossing tijdens het wassen.
  8. Filter cellen in ronde bodem FACS buizen door middel van 35 μm zeef doppen.
    Opmerking: Elke buis moet verzamelen ongeveer 4 mL eencellige suspensie van myeline.
  9. Neem eventueel 10 μL celsuspensie en meng deze met 10 μL 0,4% trypeen blauwe oplossing. Onderzoek de cellen onder een 10x heldere veld microscoop om de opbrengst, overlevingskans en het niveau van de resterende myeline te schatten.
    Opmerking: Een succesvolle voorbereiding moet meer dan 90% levende cellen genereren (ronde in vorm en exclusief de blauwe kleurstof) met weinig tot geen myeline puin.
  10. Pellet cellen in de FACS tubes bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c, met rem = 5. Giet langzaam supernatant uit en DEP de rand van de buis op tissuepapier. Respendeer cellen in elke buis met 300 μL FACS buffer.
    Opmerking: Als MCS sorting de voorkeur heeft, kunnen CD11b kralen worden gebruikt om Microglia en andere myeloïde cellen te selecteren na verwijdering van myeline. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor niet op plaat gebaseerde scRNA-SEQ en in bulk RNA-SEQ. Het voorbehoud van deze alternatieve benadering is dat CD11b kralen Microglia niet scheiden van andere gerelateerde immuuncellen die ook positief zijn voor dit antigeen.

5. kleuring voor het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen

Opmerking: Deze stap moet nemen ~ 40 min.

  1. Voeg 5 μL muis FC receptoren blok reagens (tabel van materialen) in elke buis. Inbroed voor 5 min op ijs.
  2. Voeg 1 μL CD45-PE-Cy7 en 1 μL CD11b-BV421 toe aan elke buis.
    Opmerking: Antilichamen met andere geconjugeerde fluoroforen mogen worden gebruikt. Antilichamen tegen TMEM119, een specifieke marker voor homeostatische Microglia9, kunnen ook worden opgenomen, maar het wordt aanbevolen om samen met CD45 en CD11b te worden gebruikt, omdat bepaalde Microglia-SUBPOPULATIES TMEM119 oppervlakte expressie kunnen verliezen.
  3. Inbroed de buisjes gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) op een shaker.
  4. Voeg 2 mL FACS buffer toe om te wassen.
  5. Pellet cellen bij 4 °C, 400 x g gedurende 5 min. Giet langzaam supernatant uit en DEP de rand van de buis op tissuepapier. Respendeer cellen in elke buis met 400 μL FACS buffer met 1 μL RNase remmer en 0,5 μL propidium jodide (PI, 1:1000 verdunning).

6. index FACS sorteren

Opmerking: Deze stap moet nemen ~ 1 h.

  1. Volgende standaard FACS-procedure, tekenen van poorten op basis van Scatter (met uitzondering van puin), enkelvoudige cellen, levende cellen (PI-negatief), Microglia en myeloïde cellen (CD45+, CD11b+).
    Opmerking: Typische microgliale cellen Express CD45 op lagere niveaus in vergelijking met andere aan de rand geassocieerde macrofagen, zoals perivasculaire en Meningeale macrofagen, en daarom gating op CD45 lage CD11b+ moet voldoende zijn als de focus van het onderzoek is genexpressie profielen in deze klassieke Microglia1,2. Bepaalde subgroepen van Microglia kunnen echter een hogere CD45-expressie hebben en dit geldt met name tijdens de ontwikkeling of in ziekte omstandigheden. Om een objectieve analyse van microgliale genexpressie te garanderen, kunnen CD45 hoge en CD45 lage immunophenotypes worden geregistreerd via index sorteerinstelling en beide populaties verzameld voor sequencing en downstream analyse. Daarnaast kan TMEM119 oppervlak expressie worden gebruikt om de homeostatische microglial populatie te targeten (zie stap 5,2) en geanalyseerd samen met CD45 niveaus en de sequentiëren resultaten.
  2. Sorteer enkelvoudige Microglia (met een nozzle van 100 μm) in 96-goed polymerase kettingreactie (PCR)-platen, die elk goed 4 μL lysisbuffer bevatten (Zie het gepubliceerde protocol14 voor meer informatie).
    Opmerking: Het externe RNA Control Consortium (ERCC) RNA Spike-in mix (tabel met materialen) kan worden toegevoegd bij 1:2.4 x 107 in de lysisbuffer voor kwaliteitscontrole en normalisatie doeleinden2.
  3. Draai de platen kort om en spin omlaag met behulp van een bank-top centrifuge.
  4. Vries de monsters onmiddellijk op droogijs. Bewaar de platen bij-80 °C tot de bibliotheek is voorbereid.
    Opmerking: Als alternatief kunnen meer cellen worden verzameld in 1,5 mL tubes met RNA extractiebuffer voor bulk RNA-SEQ. Volgens de ervaring van de auteurs zijn 3.000-cellen voldoende om bibliotheken van goede kwaliteit te genereren na het gepubliceerde protocol2,14.

7. voorbereiding van een bibliotheek met één cel RNA-sequencing

Opmerking: Hier wordt het gepubliceerde protocol14 gevolgd om scrna-SEQ-bibliotheken te genereren met behulp van liquid handling Robotics en enkele modificaties. In dit artikel wordt de procedure slechts kort beschreven en worden de verschillen gemarkeerd. Verwerken van 4 platen tegelijkertijd duurt ongeveer 2,5 dagen.

  1. Ontdooien platen op ijs en het uitvoeren van omgekeerde transcriptie met oligo-dT30VN primer (in de lysisbuffer) om cDNA met thermische fietsers te genereren (tabel 1): 42 °c 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C vasthouden. Dan versterken cDNA met een extra exonuclease digestie stap aan het begin (tabel 2) met behulp van de PCR Master Mix en in situ PCR (ispcr) primers (tabel van de materialen) en de volgende PCR-voorwaarde: 37 °c 30 min; 95 °C 3 min; 23 cycli van 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 min.
  2. Reinig cDNA met 18 μL magnetische kralen per put (0,7:1 ratio). Inbroed de plaat gedurende 5 minuten op een magnetische standaard en was tweemaal met vers gemaakte 80% ethanol, 80 μL per put elke keer. Na het drogen van de plaat voor 15-20 min, Elueer cDNA met 20 μL elutie buffer per put.
    Opmerking: Voor kwaliteitscontrole gebruikt u een fragment analysator (hoge gevoeligheid volgende-generatie sequencing [NGS] fragment analyse, 1 − 6000 BP) om de grootte verdelingen en de concentraties van cDNA te controleren, en alleen verdere proces monsters met een uitstrijkje tussen 500 − 5000 BP, en hoger dan 0,05 ng/μL.
  3. Om bibliotheken te genereren, meng u 0,4 μL van elk cDNA-monster met 1,2 μL Tn5-tagmentatie reagentia uit de bibliotheek voorbereidings Kit (tabel met materialen) in een 384-put met behulp van een nanoliter-Pipetteer machine, op 55 °c 10 min.
    Opmerking: Hier wordt 1/12,5 van het voorgestelde reactievolume (5 μL monster en 15 μL van tagmentatie reagentia) toegevoegd om de kosten te verlagen en ondertussen de doorvoer te verhogen. Een nanoliter Pipetteer machine (tabel met materialen) wordt gebruikt voor het overbrengen van reagentia (deze en volgende stappen) van en naar 384-well Plates.
  4. Voeg 0,4 μL neutralisatie buffer toe om de tagmentatie reactie bij RT gedurende 5 minuten te stoppen.
  5. Voeg 384 indexen (tabel met materialen, 0,4 μl voorwaarts en 0,4 μl achteruit), 1,2 μL PCR-mix toe aan monsters (elk 2 μL) en versterk de bibliotheken aan de hand van de volgende voorwaarde: 72 °c 3 min; 95 °C 30 s; 10 cycli van 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min.
  6. Zwembad alle afzonderlijke bibliotheken (Neem 1 μL elk) van dezelfde 384-goed plaat samen, en gebruik magnetische kralen (tabel van materialen, 0.7:1 ratio) om de uiteindelijke gepoolde bibliotheken te zuiveren.
  7. Gebruik een fluor meter (tabel met materialen) om de concentraties en een bioanalyzer (tabel met materialen) te meten om de grootte verdelingen van gepoolde bibliotheken vóór de sequencing te onderzoeken. Target de sequentiëren diepte bij 1.000.000 onbewerkte leesbewerkingen per cel.
  8. Volg standaard bioinformatica procedures om sequentiëren te filteren en te trimmen en uitlijning2uit te voeren. Gebruik de tabel Count en metagegevens als invoer voor clustering analyse met de Seurat pakket15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en sorteren van Microglia uit verschillende hersengebieden in één volwassen geperfectiongebruikt hersen halfrond, gevolgd door scRNA-SEQ. We gebruiken douncing om eencellige suspensie te creëren en ook als een eerste stap om Microglia te verrijken. Onvoldoende of over-douncing vermindert de opbrengst. Bovendien bevatten volwassen muis hersenen hoge niveaus van myeline, die ook de sorteerefficiëntie en-opbrengst kunnen verminderen als ze niet goed worden verwijderd. Da...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Microglia actief interactie met andere celtypen in het CZS, en ze zijn zeer gevoelig voor milieu stimuli. Om ontstekingsreacties en afwijkende veranderingen in hun genexpressie tijdens het isolatie proces te minimaliseren, is dit protocol gestroomlijnd vanuit een eerder gepubliceerde methode9, en het is nu geschikt om Microglia te isoleren van meerdere regio's van een enkele muis hersenhelft parallel. De weefsels en reagentia worden op koude temperatuur gehouden en experimenten worden tijdig uitge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno en Spyros Darmanis voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. We bedanken ook de gedeelde FACS-faciliteit van Stanford, met name Meredith Weglarz en Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart van Stanford protein en Nucleic Acid Facility (PAN) voor hun geweldige ondersteuning voor het filmen. Dit werk wordt gefinancierd door de JPB Foundation en Vincent J. Coates Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 M BetaineSigma-AldrichCat# B0300-5VL
10 mM dNTP mixThermo Fisher ScientificCat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificCat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt SolutionThermo Fisher ScientificCat# 14185-052
1 M HEPESThermo Fisher ScientificCat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master MixKapa BiosciencesCat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer CapCorningCat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6.000 bp)Advanced AnalyticalCat# DNF-474-1000
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichCat# A8806
DNase IWorthingtonCat# LS002007Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular GradePromegaCat# P1171
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher ScientificCat# 4456740
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificCat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)New England BioLabsCat# M0262S
Mouse Fc blockBD PharmingenCat# 553142
Myelin removal beadsMiltenyi BiotecCat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep KitIlluminaCat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)IlluminaCat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher ScientificCat# 70011044
PCRClean DX beadsAline BiosciencesCat# C-1003-50
Propidium IodideThermo Fisher ScientificCat# P3566Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay KitThermal Fisher ScientificCat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)BioLegendCat# 101236; RRID: AB_11203704Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)Thermo Fisher ScientificCat# 25-0451-82; RRID: AB_469625Staining: 1:300
Recombinant RNase InhibitorTakara BioCat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)ClontechCat# 639538Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotiden
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" is voor ribobases en "+" is voor een LNA base)		(Picelli et al., 2014)
Oplossingen
FACS bufferRecept: sterieel gefilterd 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS bufferRecept: sterieel gefilterd 0,5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium ARecept: 15 mM HEPES, 0,5% glucose in 1X HBSS zonder fenol rood
Platen
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen ScientificVWR89005-556
Hard-shell 96-well PCR platesBio-RadHSP9631
Anders
Dumont #55 forcepsFine Science Tools11295-51
Dounce homogenisator, 2 mlWheaton357422
Large depletion columnMiltenyi Biotec130-042-901
Large selection columnMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
RNAzapThermo Fisher ScientificAM9780
Strainer (70 μm)Falcon352350
Apparatuur
BD FACSAria IIBD Bioscienceshttp://www.bdbiosciences.com/
BioanalyzerAgilent2100
Fragment AnalyzerAgilent5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robotTTP Labtech

Referenties

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van microgliadissectie van hersengebiedensortering via flowcytometriekralen voor myelineremovatiebereiding van FACS-bufferCD45 CD11B-kleuringbeoordeling van celviabiliteitprotocol voor bibliotheekbereidingdeep sequencing-analyse
Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.