We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Als Resident macrofagen in het centrale zenuwstelsel, Microglia actief controle van de ontwikkeling van de hersenen en homeostase, en hun disfuncties kunnen menselijke ziekten stimuleren. Er zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt om de moleculaire handtekeningen van homeostatische Microglia en veranderingen van hun genexpressie te onthullen in reactie op milieu stimuli. Met de opkomst en rijping van eencellige genomische methodologieën wordt steeds meer erkend dat heterogene Microglia de verschillende rollen kan onderdoen die ze spelen in verschillende ontwikkelings-en pathologische omstandigheden. Verdere dissectie van dergelijke heterogeniteit kan worden bereikt door efficiënte isolatie van Microglia uit een bepaald gebied van belang, gevolgd door een gevoelige profilering van individuele cellen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de snelle isolatie van Microglia uit verschillende hersengebieden in een enkele volwassen muis hersen hemisfeer. We laten ook zien hoe je deze gesorteerde Microglia gebruikt voor op platen gebaseerde Deep single-cell RNA-sequencing. We bespreken het aanpassingsvermogen van deze methode voor andere scenario's en bieden richtlijnen voor het verbeteren van het systeem voor grootschalige studies.
Inleiding
Microglia, dat 5% − 10% van alle neurale cellen vertegenwoordigt, zijn ingezeten macrofagen verspreid over het centrale zenuwstelsel (CNS)1. Beschermd achter de bloed-hersen barrière, typische Microglia in een gezonde volwassen hersenen bevatten vele fijne processen die snel uitbreiden en intrekken om te communiceren met neuronen en andere gliacellen in het parenchym. Microglia kan ook de amoeboïde morfologie aannemen die gepaard gaat met een verhoogde fagocytische functie tijdens specifieke ontwikkelingsstadia of bij immuunproblemen bij letsel en ziekte1,2,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot knaagdieren aan normen voldoende aan Stanford University richtlijnen, die voldoen aan nationale en staatswetten en beleid. Alle dier procedures zijn goedgekeurd door het administratief panel van Stanford University voor laboratoriumdieren verzorging.
Opmerking: Alle oplossingen en buffer composities zijn beschikbaar in de tabel van de materialen.
1. voorbereiding op de dag van de celisolatie
- Bereid de volgende reagentia en chill ze op ijs: medium A (50 mL), magnetisch-geactiveerde celsortering (MCS) buffer (30 mL), FACS buffer (25 mL),....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en sorteren van Microglia uit verschillende hersengebieden in één volwassen geperfectiongebruikt hersen halfrond, gevolgd door scRNA-SEQ. We gebruiken douncing om eencellige suspensie te creëren en ook als een eerste stap om Microglia te verrijken. Onvoldoende of over-douncing vermindert de opbrengst. Bovendien bevatten volwassen muis hersenen hoge niveaus van myeline, die ook de sorteerefficiëntie en-opbrengst kunnen verminderen als ze niet goed worden verwijderd. Da.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Microglia actief interactie met andere celtypen in het CZS, en ze zijn zeer gevoelig voor milieu stimuli. Om ontstekingsreacties en afwijkende veranderingen in hun genexpressie tijdens het isolatie proces te minimaliseren, is dit protocol gestroomlijnd vanuit een eerder gepubliceerde methode9, en het is nu geschikt om Microglia te isoleren van meerdere regio's van een enkele muis hersenhelft parallel. De weefsels en reagentia worden op koude temperatuur gehouden en experimenten worden tijdig uitge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno en Spyros Darmanis voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. We bedanken ook de gedeelde FACS-faciliteit van Stanford, met name Meredith Weglarz en Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart van Stanford protein en Nucleic Acid Facility (PAN) voor hun geweldige ondersteuning voor het filmen. Dit werk wordt gefinancierd door de JPB Foundation en Vincent J. Coates Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6.000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyi Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotiden | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is voor ribobases en "+" is voor een LNA base) | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oplossingen | |||
| FACS buffer | Recept: sterieel gefilterd 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recept: sterieel gefilterd 0,5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recept: 15 mM HEPES, 0,5% glucose in 1X HBSS zonder fenol rood | ||
| Platen | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Anders | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenisator, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Apparatuur | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech |
Referenties
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Singl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
