Inducerende posttraumatische epilepsie in een muis model van repetitive diffuse traumatisch hersenletsel

Summary

Dit systematische protocol beschrijft een nieuw diermodel van posttraumatische epilepsie na repetitief licht traumatisch hersenletsel. Het eerste deel details stappen voor traumatisch hersenletsel inductie met behulp van een gewijzigd gewicht daling model. Het tweede deel geeft instructies over de chirurgische aanpak voor single- en multi-channel elektro-encefalografische data-acquisitiesystemen.

Abstract

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een belangrijke oorzaak van verworven epilepsie. TBI kan leiden tot een brandpunts- of diffuus hersenletsel. Focal eerletsel is een gevolg van directe mechanische krachten, soms penetreren door de schedel, het creëren van een directe laesie in het hersenweefsel. Deze zijn zichtbaar tijdens de beeldvorming van de hersenen als gebieden met kneuzing, snijwond en bloeding. Focale laesies veroorzaken neuronale dood en glialittekenvorming en zijn aanwezig in 20%−25% van alle mensen die een TBI oplopen. In de meeste Gevallen van TBI wordt letsel echter veroorzaakt door versnellingsvertragingskrachten en daaropvolgende weefselafhoorwerken, wat resulteert in niet-focale, diffuse schade. Een subpopulatie van TBI-patiënten blijft posttraumatische epilepsie (PTE) ontwikkelen na een latentieperiode van maanden of jaren. Momenteel is het onmogelijk om te voorspellen welke patiënten PTE zullen ontwikkelen, en aanvallen bij PTE-patiënten zijn een uitdaging om te controleren, wat verder onderzoek noodzakelijk maakt. Tot voor kort was het veld beperkt tot slechts twee dier/knaagdiermodellen met gevalideerde spontane posttraumatische aanvallen, beide met grote brandpuntslaesies met enorm weefselverlies in de cortex en soms subcorticale structuren. In tegenstelling tot deze benaderingen werd vastgesteld dat diffuse TBI-geïnduceerde met behulp van een gewijzigd gewichtsvalmodel voldoende is om de ontwikkeling van spontane krampachtige en niet-krampende aanvallen in gang te zetten, zelfs bij afwezigheid van brandpuntslaesies of weefselverlies. Vergelijkbaar met menselijke patiënten met verworven posttraumatische epilepsie, dit model presenteert met een latentie periode na letsel voor het begin van de aanval. In dit protocol zal de gemeenschap worden voorzien van een nieuw model van posttraumatische epilepsie, waarin wordt beschreven hoe diffuse niet-lesional TBI kan worden veroorzaakt, gevolgd door continue langdurige video-elektroencephalografische diermonitoring in de loop van enkele maanden. Dit protocol zal de behandeling van dieren, de gewichtsvalprocedure, de elektrodeplaatsing voor twee acquisitiesystemen en de frequente uitdagingen die tijdens elk van de stappen van chirurgie, postoperatieve monitoring en gegevensverwerving worden ondervonden, detailleren.

Introduction

Elk jaar treft TBI naar schatting 60 miljoen mensen wereldwijd. Getroffen personen lopen een hoger risico op het ontwikkelen van epilepsie, die zich jaren na het initiële letsel kan manifesteren. Hoewel ernstige Tbs'jes gepaard gaan met een hoger risico op epilepsie, verhoogt zelfs milde TBI de kans van een individu op het ontwikkelen van epilepsie^1,2,3,4. Alle TBI's kunnen worden geclassificeerd als focale, diffuse, of een combinatie van beide. Diffuus hersenletsel, aanwezig in veel, zo niet alle TBC's, is een gevolg van hersenweefsels van verschillende dichtheden scheren tegen elkaar als gevolg van versnelling-vertraging en rotatiekrachten. Diffuus letsel komt per definitie alleen in isolatie voor in mild/concussief niet-penetrerend hersenletsel, waarbij geen hersenletsels zichtbaar zijn op computertomografiescans⁵.

Er zijn momenteel twee kritieke problemen in de behandeling van patiënten die posttraumatische epilepsie (PTE) hebben of lopen. De eerste is dat zodra PTE zich heeft gemanifesteerd, aanvallen resistent zijn tegen beschikbare anti-epileptica (AED's)⁶. Ten tweede zijn AED's even ondoeltreffend in het voorkomen van epileptogenese, en er zijn geen effectieve alternatieve therapeutische benaderingen. Om dit tekort aan te pakken en betere therapeutische doelen en behandelingskandidaten te vinden, zal het nodig zijn om nieuwe cellulaire en moleculaire mechanismen aan de wortel van PTE⁶te verkennen.

Een van de prominente kenmerken van posttraumatische epilepsie is de latente periode tussen de eerste traumatische gebeurtenis en het begin van spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen. De gebeurtenissen die zich voordoen binnen dit tijdelijke venster zijn een natuurlijke focus voor onderzoekers, omdat dit tijdvenster de behandeling en preventie van PTE helemaal mogelijk zou kunnen maken. Diermodellen worden meestal gebruikt voor dit onderzoek omdat ze verschillende voordelen bieden, niet de minste daarvan is dat continue monitoring van menselijke patiënten zowel onpraktisch als kostbaar zou zijn over een dergelijke potentieel lange tijdspanne. Bovendien kunnen cellulaire en moleculaire mechanismen aan de wortel van epileptogenese alleen worden onderzocht in diermodellen.

Diermodellen met spontane posttraumatische aanvallen en epilepsie hebben de voorkeur boven modellen waarbij aanvallen na TBI worden geïnduceerd door minder fysiologisch relevante middelen, zoals door chemoconvulsants of elektrische stimulatie acuut, chronisch of door aanmaak. Spontane posttraumatische epileptische aanvalsmodellen testen hoe TBI het gezonde hersennetwerk wijzigt dat leidt tot epileptogenese. Studies met behulp van extra stimulatie na TBI beoordelen hoe blootstelling aan TBI de aanvalsdrempel vermindert en de gevoeligheid voor aanvallen beïnvloedt. De voordelen van diermodellen met chemische aanvallen of elektrische stimulatie zijn het testen van de specifieke mechanismen van refractoriness aan AED's en de werkzaamheid van bestaande en nieuwe AED's. De mate van relevantie en vertaling van deze gegevens naar de mens kan echter dubbelzinnig zijn⁷ als gevolg van het volgende: 1) inbeslagnemingsmechanismen kunnen verschillen van die welke alleen door TBI worden veroorzaakt; 2) niet al deze modellen leiden tot spontane aanvallen⁷; 3) laesies gecreëerd door het convulsieve middel zelf, met de canule die nodig is voor de levering ervan, of door het stimuleren van elektrode plaatsing in dieptestructuren (bijvoorbeeld de hippocampus of amygdala) kan al leiden tot verhoogde inbeslagneming gevoeligheid en zelfs hippocampal epileptiform veld potentials⁷. Bovendien produceren sommige convulsieve middelen (d.w.z. kaionzuur) directe hippocampallaesies en sclerose, wat niet typisch is na diffuse TBI.

Tot voor kort bestonden er slechts twee diermodellen van posttraumatische epilepsie: gecontroleerde corticale impact (CCI, focal) of vochtpercussieletsel (FPI, focal en diffuus)⁸. Beide modellen resulteren in grote brandpuntslaesies naast weefselverlies, bloeding en gliosis bij knaagdieren⁸. Deze modellen bootsen posttraumatische epilepsie na die door grote brandpuntslaesies wordt veroorzaakt. Een recente studie toonde aan dat herhaalde (3x) diffuus TBI voldoende is voor de ontwikkeling van spontane aanvallen en epilepsie bij muizen, zelfs bij afwezigheid van focale laesies⁹, het toevoegen van een derde knaagdier PTE-model met bevestigde spontane terugkerende aanvallen. Dit nieuwe model bootst cellulaire en moleculaire veranderingen veroorzaakt door diffuse TBI na, beter vertegenwoordigen van de menselijke bevolking met milde, gelijktijdige TBI's. In dit model, de latente periode van drie weken of meer voor het begin van de aanval en de opkomst van de late, spontane, terugkerende aanvallen maakt het mogelijk om het onderzoeken van de onderliggende oorzaken van posttraumatische epileptogenese, het testen van de werkzaamheid van preventieve benaderingen en nieuwe therapeutische kandidaten na de aanval begin, en heeft potentieel voor de ontwikkeling van biomarkers van post-traumatische epileptogenese, omdat ongeveer de helft van de dieren ontwikkelen posttraumatische epilepsie.

De keuze van het diermodel voor de studie van posttraumatische epilepsie hangt af van de wetenschappelijke vraag, het onderzochte type hersenletsel en welke instrumenten zullen worden gebruikt om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen te bepalen. Uiteindelijk moet elk model van posttraumatische epilepsie zowel het ontstaan van spontane aanvallen na TBI als een eerste latentieperiode in een subgroep van TBI-dieren aantonen, omdat niet alle patiënten die een TBI oplopen, epilepsie ontwikkelen. Hiervoor wordt elektro-encefalografie (EEG) met gelijktijdige video-acquisitie gebruikt in dit protocol. Inzicht in de technische aspecten achter data-acquisitie hardware en benaderingen is van cruciaal belang voor nauwkeurige gegevensinterpretatie. De kritieke hardwareaspecten omvatten het type opnamesysteem, type elektroden (schroef of draadlood) en materiaal dat zij van worden gemaakt, gesynchroniseerde videoaanwinst (als deel van het systeem EEG of derde partij), en eigenschappen van het computersysteem. Het is absoluut noodzakelijk om de juiste acquisitieparameters in elk type systeem vast te stellen, afhankelijk van het studiedoel, eeg-gebeurtenissen van belang, verdere analysemethode en duurzaamheid van gegevensopslag. Ten slotte moet de methode van elektrodeconfiguratie (montage) worden overwogen, omdat elk van deze maatregelen en nadelen heeft en de interpretatie van de gegevens zal beïnvloeden.

Dit protocol beschrijft hoe het gewijzigde Marmarou-gewichtsvalmodel^10,11 moet worden gebruikt om diffuus letsel te veroorzaken, wat resulteert in spontane, niet-uitgelokte, terugkerende aanvallen bij muizen, beschrijft chirurgische benaderingen om een single- en multi-channel continue, en gesynchroniseerde video-EEG te verkrijgen met behulp van monopolaire, bipolaire of gemengde montage.

Protocol

Alle dierprocedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health's 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals' .

1. Protocol inzake de behandeling van dieren

OPMERKING: Dit protocol is bedoeld om dieren die na aankomst bij een verkoper naar de faciliteit worden besteld te wenning en om te voorzien dat ze door de experimentator worden behandeld. Dit verbetert het welzijn van dieren door stress en angst te verminderen en vereenvoudigt bepaalde procedures die het hanteren van dieren vereisen, waaronder het induceren van de TBI, postoperatieve monitoring en het verbinden van het dier met het aankoopsysteem.

1. Wanneer veel dieren worden ontvangen van de verkoper, oor-tag en willekeurig toewijzen aan een experimentele groep (TBI) of controlegroep (schijnoperatie) terwijl ze te combineren in kooien van 2-5 dieren. Huis TBI dieren los van schijndieren omdat sham muizen af en toe agressief handelen naar muizen die TBI ondergingen.
2. Behandelingsdag 1 (24−48 uur na oor-tagging): Bereid een grafiek voor het loggen van dieroormerken, geboortedatum, data van behandeling, diergewicht op de behandelingsdagen, duur van de behandeling en een sectie voor opmerkingen en opmerkingen.
3. Sluit het dier voorzichtig aan met beide handen. Pak het dier niet bij de staart omdat het afweermechanismen en een stressreactie veroorzaakt.
4. Controleer en leg het oorplaatje van het dier op.
5. Plaats het dier in de container op de weegschaal en leg het gewicht vast.
6. Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 1 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
7. Na 1 min van behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
8. Herhaal stap 1.3−1.7 voor de andere dieren in de kooi.
9. Behandelingsdag 2 (de volgende dag): Herhaal stappen 1.2−1.5.
10. Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 2 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
11. Na 2 min van behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
12. Herhaal stap 1.10−1.11 voor de andere dieren in de kooi.
13. Afhandeling dag 3 (de volgende dag): Herhaal stappen 1.2−1.5.
14. Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 4 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
15. Na 4 min van behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
16. Herhaal stap 1.14−1.15 voor de andere dieren in de kooi.
17. Afhandeling dag 4 (controledag, 1 week vanaf dag 1): Herhaal stappen 1.2−1.5.
18. Sluit het dier voorzichtig weer met beide handen aan en behandel het gedurende 4 min, waardoor het in de handen kan bewegen en verkennen. Voer dit uit over een bankje in de procedureruimte en wees voorzichtig om het dier niet op de grond te laten vallen.
19. Na 4 min behandeling, plaats het dier terug in zijn kooi.
20. Herhaal stap 1.18-1.19 voor de andere dieren in de kooi.
    OPMERKING: De controleafhandelingsdag test het behoud van het kalme gedrag na een driedaags behandelingsprotocol.

2. Gewichtsvalprocedure

1. Plaats de muis in een inductiekamer. Stel de toevoer van zuurstof en vacuüm zowel op 1 L/min en het niveau van isoflurane gas op 3%−5%. Verdoven de muis voor 5 min.
2. Haal de muis uit de inductiekamer en leg deze op een schuimpad. Test op het ontbreken van een reactie op een teen of staart knijpen.
3. Een pijnstiller (0,1 mg/kg buprenorfine) onderhuids toedienen. Als de EEG-operatie diezelfde dag wordt uitgevoerd, dient u de buprenorfine onderhuids toe in combinatie met de niet-steroïde ontstekingsremmende carprofen (5 mg/kg).
4. Voor of na de laatste botsing de natriumlactaatoplossing (3 μL per gram gewicht van het dier) onderhuids toedienen. De natriumlactaatoplossing kan worden gemengd met de pijnstillers voor snelle toediening in één injectie.
   OPMERKING: De natriumlactaatoplossing bevat een mengsel van natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride en natriumlactaat in water. Deze stap helpt om vloeistoffen en elektrolyten te vervangen, waardoor herstel wordt hersteld.
5. Plaats de kop van de muis onder de gewichtsvalbuis(figuur 1A)en plaats een platte roestvrijstalen schijf (1,3 cm diameter, 1 mm dik en 880 mg gewicht) in het midden van de kop, tussen de lijn van de ogen en oren.
   OPMERKING: Deze schijf verspreidt de impact over het oppervlak van de schedel(figuur 1B).
6. Verwijder de pin in de gewichtsdruppelbuis om de 100 g gewichtsstaaf los te laten van een hoogte van 50 cm. Om de schijnverwonding voor de controlemuizen te veroorzaken, verwijder de gewichtsstaaf van de buis om toevallige versie van de speld en de gewichtsdaling te verhinderen.
   LET OP: Het hoofd van het dier moet plat worden geplaatst, zodat de staaf vrij op het gehele oppervlak van de schijf valt.
7. Plaats het onbewuste dier op zijn rug voor herstel op een verwarmingskussen bedekt met een steriele polylined absorberende handdoek. De hersteltijd van de rechterkantreflex (d.w.z. de tijd die de muis nodig heeft om zichzelf van zijn rug recht te zetten) kan worden gemeten als een uitlezing voor de tijd die onbewust wordt doorgebracht.
8. Wanneer het dier weer bij bewustzijn komt, plaats het in een schone kooi die is opgewarmd op een verwarmingskussen, met herstelgel en een paar bevochtigde chowstukken om 45 minuten te herstellen. Zorg ervoor dat er voldoende strooisel is zodat de kooi niet oververhit raakt. Oververhitting van het dier kan net zo'n groot obstakel voor herstel blijken als waardoor de muis te koud wordt.
9. Herhaal na 45 min twee maal stappen 2.1−2.8, waarbij stap 2.3 wordt weggenomen (d.w.z. toediening van pijnstillers en ontstekingsremmende geneesmiddelen).
10. Laat de dieren 1,2 uur herstellen als op dezelfde dag een EEG-elektrodeimplantatieoperatie wordt uitgevoerd.

3. Chirurgische veldvoorbereiding voor implantatie van EEG-elektroden

LET OP: Autoclave de chirurgische instrumenten en schroeven voorafgaand aan de operatie. Reinig de chirurgische handschoenen door te spuiten en te wrijven met 70% ethanol voor en na het aanraken van het dier, niet-steriele materialen, en tussen de behandeling van de dieren. Steriliseer de chirurgische gereedschappen gedurende 2,3 min in de kraalsterilisator (zie Materiaaltabel)tussen dieren. Verander het steriele gordijn voordat u een nieuw dier in het stereotactische apparaat plaatst. Zorg ervoor dat het chirurgische veld alle benodigde componenten voor de operatie bevat (figuur 2). De afwezigheid van een invasieve chirurgische ingreep om de TBI in dit model te induceren heeft verschillende voordelen: 1) de implantatie van de elektroden is flexibel en kan worden uitgevoerd op dezelfde dag als TBI of na een bepaalde periode; 2) de hersteltijd van het dier sneller is; 3) de schedel intact blijft, waardoor meer oppervlakte en flexibiliteit voor het implanteren van elektroden.

1. Verdoven de muis in 3%−5% isoflurane gas in een inductiekamer voor 5 min.
2. Breng de muis van de inductiekamer naar het stereotactische apparaat en leg deze op een steriel gordijn op een verwarmingskussen met isofluranegas en vacuümbuizen die op de neuskegel zijn aangesloten.
3. Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C in de loop van de operatie. Plaats de temperatuursensor zo dat deze contact maakt met de borst- of buikwand van de muis.
4. Bevestig het hoofd van het dier op zijn plaats met behulp van de oorstaven.
5. Houd de anesthesie op 1,5%−3,5% isoflurane of op ~ 60 ademhalingen / min in het chirurgische vlak (zonder reactie op teen of staart knijpen).
6. Breng een oogzalf aan op de ogen van het dier om ze gedurende de operatie gesmeerd te houden.
7. Toedienen van een mengsel van pijnstillers (0,1 mg/kg buprenorfine) en de niet-steroïde anti-inflammatoire drug (5 mg/kg carprofen) in een enkele injectie onderhuids, tenzij de TBI eerder werd uitgevoerd op de dag, in welk geval het dier al pijnstillers en ontstekingsremmers ontvangen.
   OPMERKING: Buprenorfine moet opnieuw worden toegediend als de tijd tussen de eerste TBI- en EEG-plaatsingsoperatie meer dan 8 uur bedraagt of als het dier na de eerste toediening tekenen van pijn 8 uur vertoont, maar het moet worden gegeven zonder de toevoeging van carprofen.
8. Toedienen natriumlactaat oplossing (3 μL per gram van het gewicht van het dier) onderhuids ter vervanging van vloeistoffen en elektrolyten in het dier.
   OPMERKING: Als een operatie onmiddellijk na de TBI wordt uitgevoerd, moet deze stap goed worden getimed. Natriumlactaatoplossing moet om de 2 uur worden toegediend, terwijl het dier de procedures ondergaat en eenmaal na de operatie 2 uur na de vorige injectie.
9. Verwijder het haar van de hoofdhuid met behulp van een ontharingcrème.
10. Voor het maken van de incisie, desinfecteren de huid van de hoofdhuid met povidone-jodium chirurgische antiseptische oplossing en 70% ethanol in afwisselende wattenstaafjes met steriele gaaspads in een cirkelvormige beweging 3x (20 s per oplossing elke keer).
11. Met behulp van een scalpel, maak een rostral-caudal incisie op de hoofdhuid middellijn van net boven de ogen naar de achterkant van het hoofd. Deze methode van hoofdhuid opening heeft de voorkeur boven het afsnijden van de hoofdhuid af, als huid flappen kunnen worden verzegeld over of rond de EEG-cap zorgen voor meer stabiliteit.
    OPMERKING: Bij de voorbereiding van de schedel voor implantatie van de 3-EEG headmount, het afsnijden van de hoofdhuid af is vereist, als de grootte van de headmount zal niet mogelijk voor sluiting van de huid flappen over de headmount.
12. Breid het gebied van incisie uit door kleine hemostats toe te passen op de geopende huidranden. Als er bloeden optreedt na de incisie, reinig dan met een steriel katoenen gaas of wattenstaafje.
13. Verwijder voorzichtig het periosteum (d.w.z. het dunne membraan over het schedelbot) met een scalpelblad. Als er tijdens deze stap bloedingen optreden, drukt u op de bloedingsplaats met een steriel wattenstaafje totdat het stopt.
14. Gebruik steriele wattenstaafjes om de schedel schoon te maken met waterstofperoxide, maar vermijd het aanraken van het zachte weefsel rond het blootgestelde schedelgebied. Herhaal deze stap totdat de schedel is gereinigd van een zacht weefsel en heeft een witachtige uitstraling.
15. Droog de schedel met een steriel gaas of wattenstaafje.
    OPMERKING: Stappen 3.12−3.15 zijn belangrijk voor de juiste fixatie van de elektroden en tandcement. Elk zacht weefsel, niet-dichtgeschroeid bloeden, en puin kan leiden tot infectie, onstabiele headmount fixatie, vervormd of afwezig signaal, en verlies van het implantaat binnen enkele dagen of weken na de operatie.

4. Plaatsing van elektrode

1. Implanteer de enkele EEG (1EEG) kanaal headmount.
   OPMERKING: Afkortingen in de stereotactische coördinaten vertegenwoordigen ruimtelijke relaties en specificeren de afstand in millimeters van het doel van de bregma bij een bepaalde oriëntatie op het hoofd van het dier: anterior-posterior (AP) en mediaal-laterale (ML). Dorsale-ventral is niet van toepassing in dit protocol omdat alle elektroden in de epidurale ruimte worden geplaatst in plaats van in een bepaalde structuur in de hersenen (Figuur 3). Vin+ is een actieve elektrode en Vin is de referentie-elektrode.
   1. Gebruik een high-speed boor met een stalen bit (0,5 mm, ronde, 1/4 inch) bij ~ 5.000−6.000 rondes per min (rpm) om zes braamgaten (drie voor stabiliteitschroeven en drie voor elektroden) te maken met behulp van de meegeleverde stereotactische coördinaten¹². Voor de twee voorste schroeven: AP = +1,5 mm, ML = ±1,5 mm; voor de ene achterste schroef: AP = -5,2 mm, ML = -1,5 mm; voor de grondelektrode: AP = -5,2 mm, ML = +1,5 mm; voor de opname-elektroden: AP = -2,3 mm, ML = ±2,7 mm, met Vin+ aan de rechterkant en Vin- naar links.
   2. Voeg drie schroeven toe voor een verbeterde stabiliteit van het hoofdstadium. Met behulp van een schroevendraaier draai je schroeven 1−1,5 x elk om stabiel in de schedel te worden bevestigd.
      LET OP: Het plaatsen van de schroeven dieper zal de hersenen beschadigen.
   3. Steek de 1EEG-kopstel in een stereotactische houderarm en plaats de kopstel, zodat de drie elektroden zich langs de schedelmiddel bevinden. In deze configuratie is de grondelektrode en de respectievelijke opening op de top van de headmount aan de achterkant, de Vin+ elektrode in het midden en de Vin-elektrode aan de voorkant. Een merk kan worden gemaakt op de headmount met een permanente marker.
   4. Buig elke elektrode 90° zodat het uiteinde van elke draad naar beneden wordt gebogen en boven het overeenkomstige braamgat wordt geplaatst. Meet vervolgens 1 mm lengte van het gedeelte van de draad dat nu loodrecht op het braamgat staat en snijd het overtollige eraf (figuur 3). Dit zorgt voor de plaatsing van de elektroden. De elektroden moeten nauwelijks het dura mater oppervlak raken.
   5. Laat de headmount zakken en pas alle drie de elektroden aan om het betreffende braamgat aan te passen. Voor epidurale opname moeten de elektroden boven of nauwelijks de dura mater worden geplaatst.
   6. Bereid tandcement voor op toepassing door een 1/2 schep poeder te mengen met verschillende druppels oplosmiddel. Gebruik een mengspatel en roer tot het uiteindelijke mengsel is stopverf-achtige, smakeloos maar kneedbaar, en stijf genoeg om goed te worden gecondenseerd wanneer geplaatst op de schedel van het dier.
   7. Breng tandcement mengsel voor alle schroeven en elektroden en wacht ~ 3 −5 min voor het te stollen. Zorg ervoor dat u het plastic voetstuk niet bedekt met tandcement, omdat het onmogelijk zal zijn om het dier met een tether met de commutator te verbinden.
   8. Laat de hemostats met de huid flappen en sluit de incisie door het aansluiten van de huid flappen rond de plastic voetstuk. Breng verschillende druppels weefsellijm aan (zie Tabel met materialen)om de huidflappen te verzegelen.
   9. Breng chloorhexidine antiseptisch aan op het gebied rond het implantaat om infectie te voorkomen. Als het dier langer dan 2 uur onder narcose is na de vorige injectie van natriumlactaatoplossing, gegeven tijdens de TBI-inductie, dient u een andere injectie onderhuids toe. Om een goede hydratatie van het dier te behouden, herhaalt u de injectie om de 2 uur die het dier onder narcose doorbrengt.
   10. Geef na de operatie een laatste injectie van natriumlactaatoplossing 2 uur na de vorige injectie. Als de operatie minder dan 2 uur lang is, dient u vanaf de eerste injectie de uiteindelijke terugwinningsdosis van de natriumlactaatoplossing 2 uur toe.
   11. Verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en meet het gewicht van het dier na de EEG-operatie als referentie voor toekomstige monitoring. Door het implantaat zal het gewicht van het dier groter zijn dan voor de operatie.
   12. Plaats het dier in een schone kooi op een warm verwarmingskussen voor herstel.
2. Implanteer de twee EEG en een EMG (2EEG/1EMG) kanalen headmount.
   1. Gebruik de bregma als oriëntatiepunt voor plaatsing van de headmount. Breng een kleine hoeveelheid weefsellijm aan (zie Tabel met materialen)op de onderkant van de 2EEG/1EMG-kopzet, vermijd de vier schroefgaten en plaats de 2EEG/1EMG-kopstel op het oppervlak van de schedel.
      OPMERKING: Er zijn geen specifieke coördinaten voor de plaatsing van deze headmount. De kopsteunen zijn 8 mm lang en 5 mm breed, die het grootste deel van het schedeloppervlak bedekt. Het plaatsen van de kopbeugel met de voorrand van 3,0 mm vooraan in de bregma is optimaal en zorgt voor een goede signaalkwaliteit. Snelle handmatige plaatsing is noodzakelijk voordat de daling van weefsellijm kuren. Laat ongeveer 5 min voor weefsellijm volledig te genezen.
   2. Gebruik een steriele 23 G naald om piloot gaten voor de schroeven te creëren door de vier openingen in de headmount. Om dit te bereiken, duw voorzichtig de naald en langzaam draaien totdat het puntje van de naald de schedel penetreert zonder de hersenen te beschadigen. Verwijder eventuele bloeden uit de piloot gaten met behulp van een steriele wattenstaafje.
   3. Steek de 0,10 in schroeven in de piloot gaten en draai ze totdat elk is bevestigd in de schedel. Dit kan oplopen tot de helft van de schroeflengte, maar niet de volledige lengte, omdat dit de dura mater en cortex zou beschadigen. Als de headmount zo is geplaatst dat er een gat is tussen het schedeloppervlak en de achterzijde van de headmount gebruik twee 0,12 in schroeven in het achterste deel.
   4. Maak kleine opening aan de zijkanten van de twee-component epoxy (zilver-epoxy) twin-pack zakje. Neem een dubbelzijdige spatel en gebruik elke kant om een kleine en gelijke hoeveelheid van elk onderdeel uit het zakje te scheppen en meng ze door elkaar. Gebruik slechts een kleine hoeveelheid voldoende voor een enkele operatie, omdat het mengsel stolt binnen 20 min. Seal de zijkanten van het zakje om te voorkomen dat drogen.
      OPMERKING: De zilver-epoxy zorgt voor een goede elektrische contact tussen de schroef en kopbevestiging en verbetert de stabiliteit van de schroeven.
   5. Breng een kleine hoeveelheid van dit mengsel tussen schroefkop en schroefgat, draai dan elke schroef totdat de kop rust op de basis van het implantaat. Zorg ervoor dat er geen zilver-epoxy is het maken van contact tussen de twee schroeven, omdat elke schroef dient als een individuele elektrode en, om een nauwkeurig signaal te garanderen, mag het geen contact maken met de andere schroef.
   6. Als het zilver-epoxy mengsel was misplaatst, is er een paar seconden tijd venster om zorgvuldig schep uit het overtollige om de verbinding te scheiden. Buig beide EMG-leads vanaf de achterste rand van de kopstel voorzichtig om de contouren van het hoofd en de hals van het dier te volgen en steek ze vervolgens in de nuchal-spieren.
   7. Bereid tandcement voor op toepassing door een 1/2 schep poeder te mengen met verschillende druppels oplosmiddel. Gebruik een mengspatel en roer tot het uiteindelijke mengsel is stopverf-achtige, smakeloos maar kneedbaar, en stijf genoeg om goed te worden gecondenseerd wanneer geplaatst op de schedel van het dier.
   8. Breng tandheelkundige cement mengsel dat de gehele headmount, terwijl het vermijden van het bedekken van de zes gaatjes, omdat dit zal het onmogelijk maken om de voorversterker aan te sluiten. Wacht ~3−5 min tot het cement stolt. Zorg ervoor dat de huid niet is verzegeld aan de headmount met tandcement.
   9. Laat de hemostats met de huid flappen en sluit de incisie door het aansluiten van de huid flappen rond de plastic voetstuk. Breng verschillende druppels weefsellijm aan om de huidflappen te verzegelen.
      OPMERKING: Als de huidincisie langer is gemaakt om het rechttrekken van de EMG-draadlood mogelijk te maken, kan de huid worden verzegeld met weefsellijm of gehecht. Het afdichten van de huid met weefsellijm is meestal voldoende. Echter, als tijdens postoperatieve monitoring opening van de incisie wordt waargenomen, hechtingen worden aanbevolen in plaats daarvan.
   10. Breng chloorhexidine antiseptisch aan op het gebied rond het implantaat om infectie te voorkomen. Toedienen natriumlactaat oplossing (3 μL per gram van het gewicht van het dier) onderhuids om vloeistoffen en elektrolyten te vervangen als het dier onder narcose voor langer dan 2 uur na de vorige injectie.
   11. Verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en meet het gewicht van het dier na de EEG-operatie als referentie voor toekomstige monitoring. Door het implantaat zal het gewicht van het dier groter zijn dan voor de operatie.
   12. Plaats het dier in een schone kooi op een warm verwarmingskussen, met herstelgel en een paar bevochtigde chowstukken voor herstel.
3. Implanteer een drie EEG-kanalen (3EEG) headmount.
   1. Gebruik high-speed boor met een stalen bit (0,5 mm, ronde, 1/4) bij ~ 5.000−6.000 rpm om zes braamgaten (drie voor stabiliteitschroeven en drie voor elektroden) te maken met behulp van de meegeleverde stereotactische coördinaten¹². Voor grond- en gemeenschappelijke referentie voor EEG1 en EEG2: AP = 5,2 mm, ML = ±1,5 mm; voor EEG1 en EEG2: AP = -3,0 mm, ML = ±3,0 mm; voor onafhankelijk EEG3: AP =-1,4 mm, ML = ±1,5 mm.
   2. Plaats de zes schroefelektroden in de braamgaten.
      OPMERKING: Het plaatsen van de schroeven dieper zal leiden tot aanzienlijke schade aan de hersenen. Schroefelektroden zorgen voor een betere stabiliteit van de kopbeugel.
   3. Bereid tandcement voor op toepassing door een 1/2 schep poeder te mengen met verschillende druppels oplosmiddel. Gebruik een mengspatel en roer tot het uiteindelijke mengsel is stopverf-achtige, smakeloos maar kneedbaar, en stijf genoeg om goed te worden gecondenseerd wanneer geplaatst op de schedel van het dier.
   4. Breng tandcement mengsel over het gehele blootgestelde oppervlak van de schedel en elke schroef elektrode. Zorg ervoor dat de huid niet is verzegeld aan de headmount met tandcement. Wacht ~1−2 min tot het cement licht stolt. Het is niet nodig om te wachten tot volledige verharding voordat u doorgaat naar de volgende stap.
   5. Zet het soldeerbout aan om het op te warmen. Plaats de 3EEG headmount in een stereotactische houder arm.
      LET OP: Plaats de headmount zodat de zes draadloodposities overeenkomen met de positie van de draadkabels van elke schroefelektrode.
   6. Laat de headmount zakken zodat het ventrale deel bovenop het tandcement rust.
   7. Draai de draad van elk lood van elk van de schroefelektroden met de overeenkomstige draadlood van de headmount.
      OPMERKING: Het verdraaien van de verkeerde draadleads maakt de interpretatie van gegevens ingewikkeld of onmogelijk.
   8. Zorgvuldig trim de overtollige draad af met behulp van een schaar. Soldeer elk gedraaid ei voor een goede signaalgeleiding.
      OPMERKING: Elk paar draden moet contact maken met een ander paar, anders worden de signaalkwaliteit en de interpretatie van gegevens in het gedrang gekomen.
   9. Buig elk gesoldeerd paar draad leidt rond de headmount, het vermijden van contact tussen elk paar.
      OPMERKING: Als de draadkabels niet kort genoeg zijn bijgesneden, kan het moeilijk zijn om ze rond de kopte zetten zonder een andere draad aan te raken. In dit geval, buig een paar eerst, bedek het met tandheelkundige cement mengsel, wacht ~ 1 −2 min te stollen, ga dan verder met het volgende paar op dezelfde manier.
   10. Werk alle draad met tandcement af waardoor alleen het zwarte gedeelte van de headmount wordt blootgesteld.
       OPMERKING: Wees voorzichtig om geen tandcementpoeder of mengsel toe te passen op de bovenkant van het blootgestelde gedeelte van de headmount, omdat vuil of cement in de gaten het contact blokkeren en zal leiden tot afwezigheid van signalen of lawaai.
   11. Laat de hemostats los met de huidflappen. Breng chloorhexidine antiseptisch aan op het gebied rond het implantaat om infectie te voorkomen.
   12. Toedienen natriumlactaat oplossing (3 μL per gram van het gewicht van het dier) onderhuids om vloeistoffen en elektrolyten te vervangen als het dier is onder narcose voor langer dan 2 uur na de vorige injectie.
   13. Verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en meet het gewicht van het dier na de EEG-operatie als referentie voor toekomstige monitoring. Door het implantaat zal het gewicht van het dier groter zijn dan voor de operatie.
   14. Plaats het dier in een schone kooi op een warm verwarmingskussen, met herstelgel en een paar bevochtigde chowstukken voor herstel.
       OPMERKING: Waterstofperoxide helpt bij het verwijderen van het resterende zachte weefsel uit de schedel.

5. Dieren verbinden met het aankoopsysteem

1. Kop het dier met beide handen om het uit de aankoopkooi te verwijderen en breng het naar een schoon gebied met een vlakke ondergrond, zoals een Animal Transfer Station (ATS).
2. Pak voorzichtig de muis bij de huid van zijn rug. Pak het dier niet bij de staart, want dit veroorzaakt leed.
3. Identificeer de opening in de EEG-kopstel die overeenkomt met de grondelektrode en match de respectievelijke pin van de tether voor een goede verbinding.
   OPMERKING: Omgekeerde verbinding van de koppeling van de commutator met de dierlijke headmount zal resulteren in een andere meting dan de elektroden en mogelijk vervormde golfvormen.
4. Breng het dier terug naar de aankoopkooi en sluit het andere uiteinde van de tether (EEG System 1) of voorversterker (EEG System 2) aan op de commutator.
   OPMERKING: Bij het aansluiten van de voorversterker (EEG System 2) op de tether van de commutator, overeenkomen met de witte merken op de uiteinden van beide tethers. Reverse-aansluiting zal resulteren in blijvende schade van de versterker en vereist reparaties door de fabrikant, die duur zijn.
5. Draai voorzichtig de tether die het dier verbindt met de commutator om ervoor te zorgen dat het mechanisme goed werkt en het dier zich vrij kan bewegen.

6. INSTELLINGEN voor gegevensverwerving van EEG

1. Stel de acquisitieparameters van EEG System 1 in.
   1. Stel de samplingsnelheid in op 500 Hz; 5.000 te winnen; modus Norm 35 Hz; LPN uit. Stel het high pass-filter in op 0,5 Hz.
      LET OP: 100 Hz (low pass) is ingebouwd en vereist geen handmatige invoer.
2. Stel de acquisitieparameters van EEG System 2 in.
   1. Stel de samplingsnelheid in op 600 Hz; voorversterker winst 100; winst 1 (EEG1,2). Stel low pass-filter in op 100 Hz.
      LET OP: 1 Hz (high pass) is ingebouwd en vereist geen handmatige invoer.

7. Instellingen voor het verkrijgen van videogegevens

1. Acquisitieparameters instellen voor EEG-systeem 1.
   OPMERKING: Er is een videoacquisitiesysteem van derden nodig voor het verkrijgen van gelijktijdige videogegevens.
   1. Stel de framesnelheid in tussen 15 (minimaal aanbevolen) en 30 (maximaal beschikbaar) voor de juiste videokwaliteit. Stel de resolutie in op 640 x 640 pixels. Stel type compressie in op H.264H.
2. Acquisitieparameters instellen voor EEG System 2.
   OPMERKING: Dit EEG-systeem biedt een videosysteem en software die video- en EEG-gegevens synchroniseren in één bestand voor maximaal vier dieren (zie Tabel met materialen).
   1. Stel de framesnelheid in tussen 15 (minimaal aanbevolen) en 30 (maximaal beschikbaar) voor de juiste videokwaliteit. Stel de resolutie in op 640 x 480 pixels. Stel het type compressie in op de WebM-bestandsindeling.

Results

Het hier beschreven protocol beschrijft de methode voor inductie van een diffuus letsel in isolatie (bijvoorbeeld bij afwezigheid een brandpuntslaesie) met behulp van een muismodel van repetitieve diffuse TBI(figuur 1). Figuur 1A toont het gewichtsvalapparaat en de componenten daarvan ( figuur1A, a1−a5) die worden gebruikt voor inductie van TBI in dit model en cruciale stappen tijdens de procedure (...

Discussion

In tegenstelling tot CCI- en FPI-modellen die focale of combinatie van brandpunts- en diffuse verwondingen veroorzaken, maakt het model van repetitieve diffuse TBI, beschreven in dit protocol, de inductie van diffuus letsel mogelijk bij afwezigheid van brandpuntshersenletsel en vereist geen hoofdhuid- of schedelopeningen en de bijbehorende ontsteking. Een bijkomend voordeel van de afwezigheid van craniectomie in dit model is dat het niet alleen mogelijk maakt om de elektroden te implanteren voor chronische continue EEG-o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8209	0.10 inch lang roestvrij staal
0.10" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8403	0.10 inch lang met voorgesoldeerde draad
0.12" screw	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8212	0.12 inch lang roestvrij staal
1EEG headmount	Invitro1 (dochteronderneming van Plastics One), VA, USA	MS333/8-A/SPC	3 afzonderlijke Teflon-geïsoleerde platina-iridium draadelektroden (gedraaid of ongedreund, 0,005 inch diameter) die onder gedraaide kunststof sokkel uitsteken
2EEG/1EMG headmount	Pinnacle Technology Inc., KS, USA	8201	2EEG/1EMG kanalen
3% waterstofperoxide			Apotheek
Buprenorfine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
Buprenorfine	Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA	060969
C57BL/6 muizen	Harlan/Envigo Laboratories Inc		mannetje, 12-16 weken oud
C57BL/6 muizen	The Jackson Laboratory		mannetje, 12-16 weken oud
Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357	OPMERKING: dit geneesmiddel wordt alleen toegevoegd tijdens de gewichtsval als stereotactische elektrode-implantatie op dezelfde dag wordt uitgevoerd
Chlorhexidine antisepticum			Apotheek
Tandheelkundig cement en oplosmiddel kit	Stoelting Co., USA	51459
Boor	Foredom	HP4-917
Boortje	Meisinger USA, LLC, USA	HM1-005-HP	0,5 mm, Rond, 1/4, Staal
Droge sterilisator	Cellpoint Scientific, USA		Germinator 500
EEG System 1	Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2	Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70%	VWR, USA	71001-652	KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Oogzalf	Pro Labs Ltd, USA		Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant verkrijgbaar in algemene online winkels en apotheken
Fluriso vloeistof voor inhalatieanesthesie	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Haarverwijderingsproduct	Church & Dwight Co., Inc., USA		Nair crème
Isofluraan	MWI Veterinary Supply Co., USA	502017
Povidon-jood chirurgische oplossing	Purdue Products, USA	004677	Betadine
Rimadyl/Carprofen	Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA	026357
Soldeertin			Hardware winkel
Soldeerbout	Weller, USA	WP35	ST7-tip, 0,8 mm
Roestvrij stalen schijf			Op maat gemaakt
Steriele wattenstaafjes
Steriele gaasjes	Fisher Scientific, USA	22362178
Steriele poly-voering geabsorbeerde handdoeken	Cardinal Health, USA	3520
Weefselkleefstof	3M Animal Care Products, USA	1469SB