Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60398

⸱

6 november 2019

 ,  ,  ,  , 
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een beeldvormings aanpak voor de bepaling van de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor oligomeren geïnduceerd door ligand binding in het plasma membraan van levende cellen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N & B) analyse.

Samenvatting

Ondanks het belang en de alomtegenwoordigheid van de receptor oligomisatie, zijn enkele methoden van toepassing voor het detecteren van clustering gebeurtenissen en het meten van de mate van clustering. Hier beschrijven we een beeldvormings benadering om de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor-homo complexen in het membraan van levende cellen te bepalen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N & B) analyse. N & B is een methode die vergelijkbaar is met fluorescentie-correlatie spectroscopie (FCS) en foton Counting histogram (PCH), die gebaseerd zijn op de statistische analyse van de schommelingen van de fluorescentie intensiteit van fluoroforen die in en uit een verlichtings volume tijdens een observatietijd. In het bijzonder is N & B een vereenvoudiging van PCH om informatie te verkrijgen over het gemiddelde aantal eiwitten in oligomere mengsels. De intensiteit fluctuatie amplitudes worden beschreven door de moleculaire helderheid van de de en het gemiddelde aantal fluor Foren binnen het verlichtings volume. Zo beschouwt N & B alleen de eerste en tweede momenten van de amplitude verdeling, namelijk de gemiddelde intensiteit en de variantie. Dit is tegelijkertijd de sterkte en de zwakte van de methode. Omdat slechts twee momenten worden overwogen, kan N & B de molaire fractie van onbekende oligomeren in een mengsel niet bepalen, maar het schat alleen de gemiddelde oligomerisatie toestand van het mengsel. Niettemin kan het worden toegepast op relatief kleine tijdreeksen (vergeleken met andere moment methoden) van beelden van levende cellen op pixel-voor-pixel basis, simpelweg door de tijds schommelingen van de intensiteit van de fluorescentie te bewaken. Het vermindert de effectieve tijd per pixel tot een paar microseconden, waardoor acquisitie in het tijdsbereik van seconden tot milliseconden, die nodig is voor snelle oligomerisatie kinetiek. Ten slotte kunnen grote celgebieden en sub-cellulaire compartimenten worden verkend.

Inleiding

We beschrijven een totale interne reflectie fluorescentie-nummer en helderheid (TIRF-N & B) Imaging benadering voor het bepalen van de gemiddelde oligomere toestand van receptor moleculen op het plasma membraan van levende cellen, gericht op het koppelen van de receptor assemblage dynamiek aan de biologische functie van de eiwitten (Figuur 1).

Bij extracellulaire ligand binding initiëren receptoren de intracellulaire signaaltransductie afhankelijk van hun conformatie, oligomerisatie, potentiële co-receptoren en membraan samenstelling. Ondanks het belang en de alomtegenwoordigheid van de receptor oligomerisatie, herkend als een belangrijke gebeurtenis in cellulaire signalering1,2,3,4,5,6, 7, enkele methoden kunnen clustering gebeurtenissen detecteren en meten van de mate van clustering experimentaal8,9. Het confocale volume (x, y ≈ 300 nm, z ≈ 900 nm) is onvoldoende verdwenen voor het aantonen van moleculaire interactie en stoichiometrie, zelfs na optimalisatie door beeld restauratie algoritmen10. De samenstelling van de subeenheid van eiwit oligomeren kan niet op zuiver ruimtelijke basis worden opgelost, zelfs niet door super-resolutie methoden bij x, y-resolutie van 20-70 nm zoals PALM11, Storm12en STED13. Bovendien kan de tijdelijke resolutie (in de volgorde van minuten per afbeelding) kinetiek niet in het bereik van seconden volgen. Enkelvoudige molecuul stap-bleaching lost de stoichiometrie van eiwit oligomeren alleen op als ze immobiel zijn14.

Een van de meest veelzijdige methoden om dichtheid en oligomisatie van fluorescently gelabelde eiwitten binnen enkele afbeeldingen te meten, is de analyse van ruimtelijke intensiteits verdeling (SpIDA), die afhankelijk is van ruimtelijke bemonstering. Het is toepasbaar op zowel chemisch vaste als levende cellen, en maakt het mogelijk de analyse van verschillende gebieden van belang van de cel tegelijkertijd met behulp van standaard fluorescentiemicroscopie15. Als alternatief zijn moment methoden, zoals fluorescentie-correlatie spectroscopie (FCS)16, foton Counting histogram (PCH)17, en aantal en helderheid (N & B)18,19, geschikt voor kwantitatief oligomeren Metingen. Deze methoden analyseren de intensiteit van de fluorescentie schommelingen die in de tijd kunnen worden waargenomen wanneer de fluor Foren zich in en uit een verlichtings volume verspreiden. De amplitudes van de intensiteits schommelingen kunnen op unieke wijze worden beschreven door de moleculaire helderheid van de de (ε) en het gemiddelde aantal fluor Foren (n) binnen het verlichtings volume17 (Figuur 2). Normaalgesproken kan de diffusiecoëfficiënt van de fluor Foren en het gemiddelde aantal moleculen (omgekeerd gerelateerd aan de G (0)-waarde) binnen het verlichtings volume worden verkregen door FCS20. Aangezien de diffusie tijd echter alleen wordt geschaald met de kubieke wortel van de massa, is FCS niet voldoende gevoelig voor het detecteren van veranderingen in molecuulmassa21. In de praktijk, single Color FCS kan niet detecteren door dimerisatie van membraan receptoren. PCH lost mengsels van verschillende oligomeren nauwkeurig op. Met behulp van meer dan twee momenten van de amplitude-verdeling, detecteert het moleculen van verschillende helderheid die hetzelfde verlichtings volume innemen. Scanning FCS22 en ontwikkelingen, zoals de interessante pair-correlatie van moleculaire helderheid (pcomb) approach23, geïntroduceerd om het bereik van toepasbaarheid van fluorescentie correlatie methoden in biologische systemen uit te breiden24 , blijven methoden met één punt ontbreken van snelle metingen in een groot gebied van een cel, waarbij veel opeenvolgende waarnemingen bij elke pixel en het verzamelen van gegevens in de volgorde van seconden worden vereist.

N & B is een vereenvoudigde versie van PCH die alleen de eerste en tweede momenten van de amplitude van de fluorescentie verdeling beschouwt, namelijk de gemiddelde intensiteit, < I >, en de variantie, σ2 (Figuur 2)18,19 en daarom kan het de molaire fractie van onbekende oligomeren in een mengsel niet bepalen, maar slechts schattingen van de gemiddelde oligomerisatie toestand van het mengsel. Niettemin heeft N & B het voordeel van het werken met relatief kleinere tijdreeksen beelden van levende cellen dan PCH per pixel, simpelweg door de schommelingen op de tijd van de intensiteit van de fluorescentie te bewaken. Omdat N & B de tijd per pixel tot een paar microseconden verlaagt, kan het snelle oligomerisatie kinetiek volgen op grote celgebieden, waardoor beeld verwerving op een tijdschaal van seconden in raster scanning microscopie (bijv. confocale, 2-photon) en milliseconden op camera gebaseerde microscopie (bijv. TIRFM).

Verschillende rapporten hebben aangetoond dat N & B het aantal subeenheden in eiwit clusters kwantificeren door uitgebreide celregio's. Paxillin-EGFP-clusters werden aangetroffen op de adhesieve plekken in de CHO-K1-cellen25, en de intracellulaire aggregatie van het pathogene Httex1p peptide werd beschreven in cos-7-cellen26. N & B werd toegepast voor het volgen van de ligand-gestuurde oligomisatie van de ErbB-receptor27, en het effect van de LIGAND FGF21 op Klothob (klb) en FGFR1c in HeLa-cellen28. De combinatie van tirf-beeldvorming en N & B-analyse werd gebruikt om aan te tonen dat dynamin-2 voornamelijk tetramere is in het gehele celmembraan29. We hebben N & B toegepast op zowel raster scanning als tirf-beelden om ligand-gestuurde door dimerisatie van upar en FGFR1 celmembraan receptoren30,31te bewijzen.

Fluorescentie-correlatie methoden, zoals N & B, FCS en PCH, zijn gebaseerd op de gedachte dat in een open volume het bezettings getal van deeltjes een Poisson-verdeling volgt. Omdat alleen de fotonen die de fluoroforen uitzenden kunnen worden gedetecteerd, de gemiddelde waarde voor een gemeten fluorescentie intensiteit versus tijd in een pixel van het beeld, figure-introduction-1 , is het product van het gemiddelde aantal fluor Foren in het verlichtings volume, n, en hun moleculaire helderheid, ε17:

figure-introduction-2

waarbij ε wordt uitgedrukt als het aantal fotonen dat per tijdseenheid (conventioneel per seconde) per molecuul wordt uitgezonden wanneer het molecuul zich in het midden van het verlichtings volume bevindt.

Helderheid is een eigenschap van elke de in een bepaalde overname instellen, terwijl intensiteit de som is van alle bijdragen van alle fluor Foren. Bij biologische wedstrijden zal de helderheid toenemen met de toename van het aantal fluoroforen dat samen fluctueert, wat informatie geeft over de oligomerisatie toestand van het fluorescently-gelabelde eiwit. De fluctuatie amplituden op een bepaalde pixel wordt gemeten aan de variantie van het fluorescentie signaal, σ2:

figure-introduction-3

Wanneer het gemiddelde van het kwadraat van de intensiteit figure-introduction-4 , en het kwadraat van het gemiddelde van de intensiteit figure-introduction-5 , worden berekend op basis van de individuele intensiteitswaarden in elke pixel van elk frame:

figure-introduction-6

waarbij K het totale aantal frames in de tijdreeks is. Experimenteel is het noodzakelijk om voor de hele Afbeeldingsreeks de variantie te berekenen die de spreiding van de individuele intensiteitswaarden op elke pixel van één afbeelding rond de gemiddelde intensiteitswaarde beschrijft. De variantie omvat alle schommelingen van verschillende oorsprongen. Bij een eerste benadering kan de variantie als gevolg van de diffusisolerende deeltjes in het verlichtings volume σ20worden gescheiden van de variantie als gevolg van de detector schot ruis, σ2d. De twee varianties zijn onafhankelijk; Zo wordt de totale variantie gegeven door hun som:

figure-introduction-7

De variantie, als gevolg van moleculaire schommelingen in en uit het detectie volume, is lineair afhankelijk van de moleculaire helderheid en intensiteit:

figure-introduction-8

EQ. 6 opnieuw rangschikken volgens EQ. 1:

figure-introduction-9

Volgens het typische concept in fluorescentie correlatie spectroscopie, stelt vergelijking 7 dat de variantie als gevolg van het aantal schommelingen afhangt van het kwadraat van de deeltjes helderheid.

Vervolgens is de variantie als gevolg van schommelingen in de detector een lineaire functie van de gedetecteerde intensiteit, onder de aanname dat de detector onder de verzadigings limiet19wordt bediend:

figure-introduction-10

In het geval van foon tellings detectoren a= 1 en c= 0 is de variantie van de detector gelijk aan de gemiddelde intensiteit:

figure-introduction-11

Om deze concepten op echte metingen in levende cellen toe te passen, definiëren Gratton en collega's18 de schijnbare helderheid, B, voor elke pixel als de verhouding van de variantie over de gemiddelde intensiteit:

figure-introduction-12

B is de parameter die experimenteel wordt gemeten. In dit werk, time series beelden van FGFR1 receptoren op het plasma membraan van HeLa cellen worden gevangen door TIRF microscopie en de gemiddelde schijnbare helderheid, B, wordt bepaald door de N & B analyse. Vervolgens, na toevoeging van FGF2, opeenvolgende tijdreeksen worden gevangen om de veranderingen in de zelf-assemblage van de receptor moleculen in het membraanoppervlak na stimulatie van de receptor met de canonieke ligand te volgen.

Aangezien de detector van de TIRF-Microscoop echter een EMCCD-camera is, moet de uitdrukking voor de schijnbare helderheid worden gewijzigd als19:

figure-introduction-13

waarbij Offset de intensiteit offset is van de detectie-elektronica die kenmerkend is voor de detector instellingen. De variantie en gemiddelde intensiteit voor een analoge detector worden respectievelijk gegeven door:

figure-introduction-14

waarbij G de analoge winst in digitale niveaus (DL/fotonen), S, de digitale niveaus per foton19, wordt gegeven door de helling van een intensiteit versus variantie plot voor een lichtbron met constante intensiteit (geen tijdelijke schommelingen). De γ-factor is gerelateerd aan de vorm van het pixel detectie volume. Volgens Hassler et al.32is de γ-factor gelijk aan 0,3 voor tirf-beeldvorming die werkt op de maximale Gain van de detectie camera19. De parameters offset, S en G zijn kenmerken van de camera en de Microscoop. De schijnbare helderheid, B, wordt verkregen door het herschikken van EQ. 11 volgens EQ. 12 en 13:

figure-introduction-15

Experimenteel is ε een complexe functie van laserintensiteit en de detectie-efficiëntie van het systeem. Niettemin, aangezien B/S lineair afhankelijk is van ε, is het alleen belangrijk om de relatieve waarde van ε te bepalen voor een bepaalde detectiemodus:

figure-introduction-16

waar ε ' evenredig is aan ε. Toch wordt een kalibratie uitgevoerd met een interne referentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. monstervoorbereiding

  1. Dag 1. Zaad HeLa cellen in volledig medium bij een concentratie van 100000-200000 cel/mL in glazen bodem gerechten. Seed 6-8 repliceert gerechten.
    Opmerking: In dit voorbeeld wordt het medium aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 1 mM natrium pyruvate, 100 U/100 μg penicillaire/streptomycine. Er worden verschillende replicaatgerechten bereid.
  2. Dag 2-3. Wanneer cellen in subconfluency zijn, transfect de helft van de gerechten met het eiwit plasmide en de tweede helft met referentie plasmiden (monomeer en dimeer), in serumvrij medium.
    Opmerking: Transfectie wordt gemaakt in serumvrij medium aangevuld met antibiotica, 0,1% runderserum albumine en 25 mM HEPES-buffer, zonder fenolrood.
  3. Dag 3-4. Controleer of de gefixeerde cellen zich aan de onderkant van de gerechten hechten en het celmembraan fluorescerend is. Gooi gerechten met overwoekerde cellen weg of met een zeer lage fluorescentie.
    Opmerking: Laat cellen niet overgroeien. De cellen moeten goed verdeeld zijn en worden vastgehouden in het glasoppervlak van de schaal (Figuur 1A). Voorgecoate glazen bodem gerechten kunnen worden gebruikt voor het voorkeur aan celadhesie. De celcultuur wordt vóór een experiment getest op Mycoplasma besmetting. In dit voorbeeld worden cellen met een (A207K) megfp-FGFR1 plasmide getransfeerd en worden de referentiecellen met een GPI-(A207K) megfp en een GPI-(A207K) megfp-(A207K) megfp plasmiden gebruikt met behulp van standaardprotocollen. Voor levende cellen microscopie wordt een indicator vrij medium aanbevolen; 25 mM HEPES-buffer wordt toegevoegd om pH-veranderingen tijdens beeldvorming te voorkomen.

2. TIRF Imaging — uitlijning van de laser lijn en optimalisatie van TIRF-verlichting

  1. Vier uur voor het experiment, activeer de temperatuur Incubator van de Microscoop bij 37 °C.
  2. Schakel de Microscoop, computers en camera's in en wacht tot de camera's de juiste werktemperatuur hebben bereikt.
    Opmerking: De werktemperatuur van de camera die in deze studie wordt gebruikt, is-75 °C.
  3. Plaats een kleine druppel olie op het doel. Zet een monster schotel op zijn plaats. Sluit de deuren van de incubator en laat de temperatuur van de schotel equilibreren (~ 10 min).
  4. Zet de epifluorescentie lamp en de 488 nm laser aan.
  5. Selecteer de epifluorescentie contrast modus om het monster te verkennen en zoek een cel om zich te concentreren vanaf het oculair.
    Opmerking: Het gebruik van een fluorescerende lamp voor het doorzoeken van cellen via het oculair is niet verplicht. In plaats daarvan kan een geschikte laser lijn worden gebruikt.
  6. Selecteer het juiste filter voor het verzamelen van de groene emissie via de Microscoop camera (band pass ex 490/20 (500) band doorgeven em 525/50, of iets dergelijks.
  7. Schakel van het oculair naar de camera poort (camera #1 in Figuur 1) in de epifluorescentie modus, Verfijn de scherpstelling en verander naar de tirf-modus. Epifluorescentie en TIRF-modi kunnen worden genoemd met een andere nomenclatuur, afhankelijk van het merk van de Microscoop.
    Opmerking: Er kunnen problemen zijn met het scherpstellen of uitlijnen van de laser als er geen fluorescerende markeringen in de afdek interface zijn. Om de laser op de juiste manier uit te lijnen (essentieel voor goede TIRF), moet u zich concentreren op de coverslip. Het is vaak heel moeilijk om te bepalen of de dekslip scherp is. Als suggestie, focus op de randen van de cellen.
  8. Activeer de automatische uitlijning volgens de instructies van de TIRF-Microscoop.
    Opmerking: Kort, voor stappen van 2,4 tot 2,8, Zoek eerst de cellen door het oculair en concentreer op hen, stuur dan de emissie naar de camera poort van de TIRF-Microscoop, richt de cellen opnieuw op het scherm van de Microscoop en activeer de procedure voor laser uitlijning. De uitlijning bestaat uit het vinden van de kritische hoek waarbij de belichting wordt weer licht (Figuur 3). Commerciële microscopen kunnen enigszins verschillende uitlijnings protocollen hebben en ook volledig geautomatiseerd zijn; anderen kunnen een kleine camera hebben om de visualisatie van de kritieke hoek condities te vergemakkelijken.
  9. Kies een geschikte verlichtings diepte en Optimaliseer de richting van het veld met de klachten (Figuur 3).
    Opmerking: De penetratie diepte wordt constant gehouden voor alle bedieningselementen en samples.

3. TIRF Imaging: opname van de tijdreeks

  1. Definieer een regio van belang (ROI) van ten minste 256 x 256 pixels.
    Opmerking: In deze set-up wordt de opname gedaan met camera #2 onder software die rechtstreeks alleen de camera bestuurt (Zie Figuur 1 legende).
  2. Stel de belichting in op 1 MS en de EM-versterking tot 1.000 (dit is de G-factor in EQ. 12 en 13). Bij een dergelijke snelheid kan het nodig zijn om het Laser vermogen aan te passen of te verhogen. Hier is laser vermogen 0,5 mW.
    Opmerking: Afhankelijk van het type camera en de limieten die worden opgelegd door de diffusiecoëfficiënt van het eiwit, de intensiteit van de fluorescentie en de achtergrond, zijn de algemene criteria voor het instellen van het Laser vermogen niet om de detector te verzaderen, foto bleken te minimaliseren en vast te leggen als snel mogelijk bij een redelijke S/N. De EM-versterking wordt altijd ingesteld op het maximum van de camera (Zie Inleiding).
  3. Voer een eerste proef reeks uit onder initiële omstandigheden en schat ruwweg de S/N-waarde. De voorwaarden zijn aanvaardbaar op S/N = 2-3 of hoger, zoals gemeten in het eerste frame van de eerste tijdreeks.
  4. Gebruik de schuifregelaar van het emissiesplitsings systeem dat de camera #2 verbindt met de Microscoop voor het maskeren van een zijde van de afbeelding (Figuur 1b, Figuur 4a-b)
    Opmerking: In deze set-up is een multi channel Imaging connector geïnstalleerd op camera #2 om de overname van twee ruimtelijk identieke beelden tegelijk mogelijk te maken. Het systeem is uitgerust met glijbanen voor het monteren van verschillende emissie filters. Een van de schuifregelaars koppelt een zwart masker om een zijde van de afbeelding te bedekken. Het gemaskerde gebied wordt gebruikt voor de interne kalibratie van elke tijdreeks, om de camera parameters te bepalen (EQ. 12 en EQ. 13). Op deze manier is er geen behoefte aan een onafhankelijke kalibratie stap en, belangrijk, de kalibratie wordt parallel aan de opname van elke tijdreeks uitgevoerd. Bij afwezigheid van dit systeem kan de camera worden gekalibreerd door gepubliceerde protocollen33toe te passen.
  5. Selecteer de optie voor het automatisch opslaan van het camera bestand.
  6. Start de overname van de Afbeeldingsreeks. Verkrijg minimaal 700 frames met een minimale S/N-ratio van 2.
    Opmerking: Het aantal frames dat nodig is voor de analyse is afhankelijk van de monster stabiliteit voor fotobleaching en de spreiding van de gegevens. Daarom wordt de kwaliteit van elke tijdreeks geëvalueerd tijdens N & B-analyse.
  7. Voeg de ligand toe zonder het gerecht uit de Microscoop te halen.
  8. Selecteer een cel met een helder fluorescentie membraan en start snel de eerste tijdreeks van de kinetische run.
    Opmerking: Als de toevoeging van de ligand snel wordt gedaan, stelt deze eerste opname het punt = 0 tijd van de ligand kinetiek in. De software registreert het exacte tijdstip van de opname.
  9. Zoek een tweede cel en verkrijg het tweede tijdpunt van de kinetiek.
    Opmerking: Punt-bezoek routines zijn beschikbaar in sommige microscopen die zijn uitgerust met gemotoriseerde x-, y-en z-fasen. Deze laten het onthouden van meerdere posities op de celschaal toe en kunnen helpen bij het bijhouden van een meer constant tijdsinterval tussen de beeld reeks op verschillende cellen.
  10. Leg een nieuwe cel vast voor elk tijdpunt van de kinetische run.
    Opmerking: Na het vastleggen is een cel deels fotogebleekt en kan deze niet opnieuw worden afgebeeld. Hierdoor wordt de kinetiek verkregen door het combineren van tijdreeksen van veel cellen, elk gevangen op een ander tijdstip.
  11. Herhaal voor elk nieuw gerecht het Protocol van stap 2,3 tot en met 3,9.
    Opmerking: Voor referentie gerechten, voeg een volume van het voertuig (PBS aangevuld met 0,01% boviene serumalbumine) equivalent aan die gebruikt voor de ligand.

4. nummer & helderheid (N & B): kwaliteitscontrole van de tijdreeks

  1. Converteren en opslaan als. TIFF de bestanden die zijn verkregen met de camera software (sif-bestanden in dit voorbeeld).
  2. Importeren. TIFF-bestanden in de analyse software routine door het activeren van de N & B grafische gebruikersinterface (GUI) MATLAB.
    Opmerking: Een aangepaste MATLAB uitvoerbare N & B routine wordt hier gebruikt (N & B analyse op https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Door een geïmporteerde te openen. TIFF-bestand, genereert de routine de gemiddelde intensiteits afbeelding, het gemiddelde intensiteits profiel en u de serie frame-voor-frame (aanvullende figuur 1) inspecteren. Andere software zijn beschikbaar voor N & B-analyse (bijvoorbeeld SimFCS-software).
  3. Serie verwijderen waarvoor het gemiddelde intensiteits profiel meer dan 10% foto bleken vertoont, en reeksen waarin een duidelijke celmembraan vervorming of-vertaling is opgetreden tijdens de overname.
  4. Uitsnijd kaders die duidelijk buiten de focus liggen.
    Opmerking: Een bijsnijd hulpmiddel wordt in de routine geïmplementeerd om enkele of meerdere frames binnen de reeks afbeeldingen te kunnen weggooien. Deze bewerking is toegestaan omdat frame-naar-frame tijd niet essentieel is, terwijl de pixel dwelltijd (belichtingstijd) is (zie discussie).
  5. Houd voor de analyse alleen reeksen met ten minste 500 tijdframes.

5. aantal & helderheid (N & B): bepaling van de camera parameters (offset, σ en S)

  1. Activeer de routine Kalibreer camera.
  2. Selecteer een oppervlak van ten minste 20 x 50 pixels in de geluids regio van de melder (Figuur 4).
    Opmerking: De routine is afkomstig van een histogram van de waarden (ook gedefinieerd digitaal niveau, DL) en retourneert een logaritme plot van de frequentie versus digitale niveaus.
  3. In de log frequentie versus digitale niveau plot, verplaats de lineaire rode cursor om de Gaussiaan en het lineaire deel van de curve te scheiden.
    Opmerking: De rode cursor verdeelt de twee delen van de curve en activeert de routine die de verschuiving retourneert, wat het middelpunt is van de Gaussiaanse functie van de camera respons, de σ van de Gaussiaanse pasvorm en de S-factor, die de helling is van het lineaire deel van de camera Response e (Figuur 4C-D).

6. nummer & helderheid (N & B): berekening van de B-waarden in geselecteerd regio-van-belang (ROI)

  1. Activeer de B -toets.
    Opmerking: Deze actie genereert de afbeelding met de gemiddelde intensiteit (Figuur 5, eerste kolom) en de b-afbeelding waarin elke afzonderlijke b-waarde is gekoppeld aan de gerelateerde pixel in de afbeelding (aanvullend figuur 1).
  2. Breng een minimum binning (2 2) aan om de spreiding van de gegevens te verminderen en het B-I histogram te genereren (Figuur 5, tweede kolom).
    Opmerking: Het B-I-histogram vertegenwoordigt de verdeling van de B-waarden van alle pixels van de afbeelding versus de pixel intensiteit. Y = B/S; X = (figure-protocol-1 -offset)/S (aanvullende figuur 1 en EQ. 11 en 15).
  3. Inspecteer het B-I-histogram met behulp van de interactieve vierkante cursor.
  4. Selecteer een vierkante ROI voor de analyse (afbeelding 5, derde kolom).
    Opmerking: De cursor synchroniseert een mobiel masker op de afbeelding met gemiddelde intensiteit, waarbij de pixels worden gemarkeerd die zijn geselecteerd binnen het vierkante cursor gebied (aanvullend figuur 1). Door deze inspectie is het mogelijk om de achtergrond en gebieden met een zeer lage intensiteit van de analyse uit te sluiten.
  5. Genereer de B-map van de geselecteerde ROI (afbeelding 5, vierde kolom).
  6. Sla het ASCII-bestand op van de B-waarden die aan de selectie zijn gekoppeld.
  7. Importeer het ASCII-bestand in een grafische software om de frequentieverdeling van de gegevens te berekenen en de gemiddelde B-waarde ± S. E te verkrijgen (Figuur 5, vijfde kolom).
    Opmerking: Als de gegevens homogeen zijn, benadert de frequentieverdeling van de B-waarden een Gaussiaanse verdeling.
  8. Pas EQ. 15 toe om de gemiddelde helderheid figure-protocol-2 = figure-protocol-3 -1 [(tellingen/molecuul) per dwelltijd] voor elke cel op elk tijdstip van de kinetische uitvoering af te leiden. Normaliseer de gegevens volgens:
    figure-protocol-4
    waar figure-protocol-5 is de gemiddelde b-waarde gemeten op tijd "t" na ligand optellen, en figure-protocol-6 is de gemiddelde b-waarde gemeten op het moment t = 0 (10-20 s na ligand optellen).
    Opmerking: De normalisering van de resultaten maakt de directe vergelijking van experimenten die worden uitgevoerd in verschillende dagen. Het compenseert de verschillen in de gemeten helderheid als gevolg van laser vermogen en technische schommelingen.
  9. Plot de genormaliseerde gemiddelde helderheid versus acquisitie tijd om de kinetische run te bouwen (Figuur 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten voor twee representatieve HeLa-mEGFP-FGFR1 cellen die in hetzelfde cultuur gerecht zijn geseelde, worden weergegeven in Figuur 5 en aanvullende tabel 1. De twee cellen werden gevangen op tijd 0 min (Figuur 5a, boven) en 7 min (Figuur 5a, onder) na toevoeging van de FGF2 ligand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

N & B vereist verschillende voorzorgsmaatregelen bij de keuze van het celmodel en de etiketterings strategie. Het kan alleen worden toegepast op levende cellen die stabiel blijven gehecht tijdens de opnametijd van de foto. Extra schommelingen als gevolg van de gehele cel rigide verplaatsing kunnen worden behandeld met de juiste beeld restauratie benaderingen38. Echter, in het algemeen wanneer een cel beweegt, de celmembraan ook vervormt, en structuur vervorming, produceren van grote extra varianti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De CNIC wordt ondersteund door het ministerie van Ciencia, innovacion y Universidades en de Pro CNIC Foundation, en is een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). We worden ook gesteund door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (FEDER) "una manera de hacer Europa". UC erkent de steun van de Associazione Italiana ricerca Sul cancro, de vereniging voor internationaal kankeronderzoek (nu bekend als wereldwijd kankeronderzoek) en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid. A.T. erkent de "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" voor het gedeeltelijk ondersteunen van zijn werk met de PV Fellowship "Progetto professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC geïnverteerd microscoop, met smi-automatische TIRF-uitlijning. Het microscoop wordt geleverd met een 488 nm diodelaser, een 100x 1.46 olie TIRF objectief, Ex/Em Bandpass filters op 490/20 en 525/50, temperatuur/CO2 incubator en Andor DU 8285 VP EMCCD camera. Het microscoop wordt bediend door Leica LIF software.Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland
Albumine uit bovien serum 98% minimumSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM zonder Fenol Rood met 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA21063029Gebruikt serum vrij voor microscopie
DMEM hoge glucose GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10566-016Gebruikt voor compleet medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FrankrijkX0515-500
Emissie splitsingssysteem Photometrics DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, BraziliëGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA1027010610% geïnactiveerd supplement voor compleet medium
Glasbodem 35 mm steriele 1.5 schalenMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Congecoat, glas dikte 0.17 microns
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervix carcinoom (HeLa), serum-vrij dierlijk component (AC) cellenMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, DuitslandCB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera bestuurd door ANDOR Solis softwareOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UKDeze camera, geïnstalleerd in een extra poort van het microscoop, wordt gebruikt voor het verwerven van de N&B tijd reeksen
Matlab Uitvoerbaar N&B routineUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spanjedownloaden op https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAhttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicilline:Streptomycine voor weefselcultuur 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esupplement voor medium bij Penicilline/Streptomycine 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expressievectorUnit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milaan, ItaliëZamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expressievectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpanjeHellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expressievectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpanjeHellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2PeproTech EC, Ltd., Londen, UKLigand oplossing: 20 ng/mL van FGF2 in PBS aangevuld met 0.01%BSA.
Natriumpyruvaat GIBCOThermoFisher Scientific113600701 mM supplement voor medium
TransIt-LT1 Transfectie ReagensMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsine-EDTA (0.25%), fenol roodGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA25200056
Type F Immersie vloeistof 10 mLLeica Microsystems, Wetzlar, Duitsland11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180.1% supplement voor medium zonder fenol rood gebruikt voor transfecties

Referenties

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047(2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994(2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007(2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Receptoro ligomerisatiefluorescentieschommelingsmethodenlive cell imagingTIRF microscopieFGFR1 mEGFPfluorescentie intensiteitsschommelingenbepaling van de oligomere staat
Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.