Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

Summary

We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.

Abstract

Een driedimensionale spheroid-celcultuur kan nuttiger resultaten verkrijgen in celexperimenten, omdat het de celmicroomgevingen van het levende lichaam beter kan simuleren dan de tweedimensionale celcultuur. In deze studie hebben we een elektrisch motorgestuurd lab-on-a-CD-platform (compact disc) gemaakt, een centrifugale microfluïdisch-gebaseerd spheroid (CMS)-cultuur systeem, om driedimensionale (3D) celsferoïden te maken die een hoge centrifugale kracht implementeren. Dit apparaat kan rotatiesnelheden variëren om zwaartekracht condities te genereren van 1 x g tot 521 x g. Het CMS-systeem is 6 cm in diameter, heeft 500 μm micro putten, en is gemaakt door molding met Polydimethylsiloxaan in een polycarbonaat mal premade door een computer numerieke besturings machine. Een barrière muur bij de ingang van het kanaal van het CMS-systeem maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen gelijkmatig in de chip te verspreiden. Aan het einde van het kanaal is er een diagebied dat de cellen in staat stelt om de micro putjes in te voeren. Als demonstratie werden sferoïden gegenereerd door monocultuur en cocultuur van stamcellen en menselijke Long fibroblasten met een hoge zwaartekracht, met behulp van het systeem. Het CMS-systeem gebruikte een eenvoudig bedienings schema om cocultuurspheroids van verschillende structuren van concentrische, Janus en sandwich te produceren. Het CMS-systeem zal nuttig zijn in celbiologie en weefsel engineering studies die sferoïden en organoïde cultuur van enkele of meerdere celtypen vereisen.

Introduction

Het is gemakkelijker om biologische in vivo micro-omgevingen te simuleren met driedimensionale (3D) spheroid-celcultuur dan met tweedimensionale (2D) celkweek (bijv. conventionele Petri schaalcelcultuur) om fysiologisch realistische experimentele resultaten¹. Op dit moment beschikbare spheroid-vormings methoden omvatten de hangende druppel techniek², vloeistofoverlay-techniek³, Carboxymethyl cellulose techniek⁴, op magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek⁵, en het gebruik van bioreactoren⁶. Hoewel elke methode zi....

Protocol

1. centrifugale microfluidic-gebaseerde spheroid (CMS) cultuur chip fabricage

1. Maak PC-mallen voor de bovenste en onderste lagen van de CMS-kweek chip door CNC-bewerking. Gedetailleerde afmetingen van de chip worden gegeven in Figuur 1.
2. Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1 (w/w) gedurende 5 min en plaats in een exsiccator voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
3. Na het gieten van het PDMS mengsel in de mallen van de CMS cultuur chip, verwijder luchtbellen voor 1 h meer en genezen in een warmte kamer bij 80 ° c voor 2 h.
4. Plaats ze in de gestofzuigd plasma reiniger met ....

Results

De CMS cultuur chip met 6 cm diameter (Figuur 2) werd met succes gemaakt volgens het bovenstaande protocol. Eerst werd de chip afzonderlijk gemaakt van een toplaag en een onderlaag en vervolgens door plasmaverlijming aan elkaar gebonden. Resulterende sferoïden kunnen gemakkelijk worden verzameld door het loskoppelen van de chip. Het kanaal van de CMS cultuur chip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, glijbaan en micro well regio's (Figuur 3). De cel-, medium-.......

Discussion

Het CMS is een gesloten systeem waarin alle geïnjecteerde cellen zonder verspilling de titer binnenkomen, wat het efficiënter en zuiniger maakt dan conventionele titer-based spheroid-generatie methoden. In het CMS-systeem wordt de media elke 12 – 24 h vervangen door een zuigopening die is ontworpen om de media in de chip te verwijderen (Figuur 3a). Tijdens het zuig proces van de media worden nauwelijks media uit de titer ontsnapt door de oppervlaktespanning tussen de media en de wand van de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021