We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een driedimensionale spheroid-celcultuur kan nuttiger resultaten verkrijgen in celexperimenten, omdat het de celmicroomgevingen van het levende lichaam beter kan simuleren dan de tweedimensionale celcultuur. In deze studie hebben we een elektrisch motorgestuurd lab-on-a-CD-platform (compact disc) gemaakt, een centrifugale microfluïdisch-gebaseerd spheroid (CMS)-cultuur systeem, om driedimensionale (3D) celsferoïden te maken die een hoge centrifugale kracht implementeren. Dit apparaat kan rotatiesnelheden variëren om zwaartekracht condities te genereren van 1 x g tot 521 x g. Het CMS-systeem is 6 cm in diameter, heeft 500 μm micro putten, en is gemaakt door molding met Polydimethylsiloxaan in een polycarbonaat mal premade door een computer numerieke besturings machine. Een barrière muur bij de ingang van het kanaal van het CMS-systeem maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen gelijkmatig in de chip te verspreiden. Aan het einde van het kanaal is er een diagebied dat de cellen in staat stelt om de micro putjes in te voeren. Als demonstratie werden sferoïden gegenereerd door monocultuur en cocultuur van stamcellen en menselijke Long fibroblasten met een hoge zwaartekracht, met behulp van het systeem. Het CMS-systeem gebruikte een eenvoudig bedienings schema om cocultuurspheroids van verschillende structuren van concentrische, Janus en sandwich te produceren. Het CMS-systeem zal nuttig zijn in celbiologie en weefsel engineering studies die sferoïden en organoïde cultuur van enkele of meerdere celtypen vereisen.
Inleiding
Het is gemakkelijker om biologische in vivo micro-omgevingen te simuleren met driedimensionale (3D) spheroid-celcultuur dan met tweedimensionale (2D) celkweek (bijv. conventionele Petri schaalcelcultuur) om fysiologisch realistische experimentele resultaten1. Op dit moment beschikbare spheroid-vormings methoden omvatten de hangende druppel techniek2, vloeistofoverlay-techniek3, Carboxymethyl cellulose techniek4, op magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5, en het gebruik van bioreactoren6. Hoewel elke methode zijn eigen voordelen heeft, is verdere verbetering van de reproduceerbaarheid, productiviteit en het genereren van cocultuursspheroïden noodzakelijk. Bijvoorbeeld, terwijl de magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5 relatief goedkoop is, moeten de effecten van sterke magnetische velden op levende cellen zorgvuldig worden overwogen. De voordelen van spheroid-cultuur, met name in de studie van mesenchymale stamcel differentiatie en proliferatie, zijn gemeld in verschillende onderzoeken7,8,9.
Het centrifugale microfluïdische systeem, ook bekend als lab-on-a-CD (compact disc), is handig om de vloeistof binnen eenvoudig te regelen en de rotatie van het substraat te benutten en is dus gebruikt in biomedische toepassingen zoals immunoassays10, colorimetrische assays voor het opsporen van biochemische markers11, nucleïnezuur versterking (PCR) testen, geautomatiseerde bloedanalyse systemen12, en all-in-One centrifugale microfluïdische apparaten13. De drijvende kracht die de vloeistof bestuurt, is de centripetale kracht die wordt gecreëerd door rotatie. Bovendien kunnen meerdere functies van mengen, valving en monster splitsing eenvoudig worden gedaan in dit enkele CD-platform. In vergelijking met de bovengenoemde biochemische analysemethoden zijn er echter minder proeven uitgevoerd om cd-platforms toe te passen op kweekcellen, met name sferoïden14.
In deze studie tonen we de prestaties van het centrifugale microfluïdische spheroid-systeem (CMS) door monocultuur of cocultuur van stamcellen die afkomstig zijn van menselijke adipeus (hASC) en humane Long fibroblasten (MRC-5). Dit artikel beschrijft in detail de onderzoeksmethodologie van onze groep15. Zo kan het spheroid Culture lab-on-a-CD-platform eenvoudig worden gereproduceerd. Er wordt een CMS-genererend systeem gepresenteerd dat bestaat uit een CMS-kweek chip, een chip houder, een DC-motor, een motor bevestiging en een draaiend platform. De Motorsteun is 3D bedrukt met acrylonitril butadieen styreen (ABS). De chip houder en het roterende platform zijn CNC (computer numerieke besturing) bewerkt met de PC (polycarbonaat). De rotatiesnelheid van de motor wordt geregeld van 200 tot 4.500 rpm door het coderen van een PID (proportioneel-integraal-afgeleid) algoritme op basis van Pulsbreedtemodulatie. De afmetingen zijn 100 mm x 100 mm x 150 mm en het weegt 860 g, waardoor het gemakkelijk te hanteren is. Met behulp van het CMS-systeem kunnen sferoïden onder verschillende zwaartekracht condities worden gegenereerd van 1 x g tot 521 x g, zodat de studie van de promotie van celdifferentiatie onder hoge zwaartekracht kan worden uitgebreid van 2D-cellen16,17 naar 3D spheroid. Cocultuur van verschillende soorten cellen is ook een belangrijke technologie voor het effectief nabootsen van de in vivo omgeving18. Het CMS-systeem kan eenvoudig monocultuur-sferoïden genereren, evenals cocultuursspheroids van verschillende structuurtypen (bijv. concentrisch, Janus en sandwich). Het CMS-systeem kan niet alleen worden gebruikt in eenvoudige spheroid-studies, maar ook in 3D-organoïde-studies, om menselijke orgaan structuren te overwegen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. centrifugale microfluidic-gebaseerde spheroid (CMS) cultuur chip fabricage
- Maak PC-mallen voor de bovenste en onderste lagen van de CMS-kweek chip door CNC-bewerking. Gedetailleerde afmetingen van de chip worden gegeven in Figuur 1.
- Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1 (w/w) gedurende 5 min en plaats in een exsiccator voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
- Na het gieten van het PDMS mengsel in de mallen van de CMS cultuur chip, verwijder luchtbellen voor 1 h meer en genezen in een warmte kamer bij 80 ° c voor 2 h.
- Plaats ze in de gestofzuigd plasma reiniger met de te verlijmen oppervlakken en stel ze bloot aan luchtgeassisteerd plasma met een vermogen van 18 W gedurende 30 sec.
- Bind de twee lagen van de CMS cultuur chip en plaats deze in de warmte kamer bij 80 °C gedurende 30 minuten om de adhesie sterkte te verhogen.
- Steriliseer de CMS Culture chip in een autoclaaf sterilisator bij 121 °C en 15 psi.
2. voorbereiding van de cel
- Ontdooit de 1 mL injectieflacon met 5 × 105– 1 × 106 HASCS-of MRC-5s-cellen in een waterbad van 36,5 °c gedurende 2 minuten.
- Voeg 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) toe aan een injectieflacon en meng zachtjes met een pipet van 1.000 μL.
- Zet 15 mL van de DMEM voorverwarmd tot 36,5 °C in een Petri schaaltje van 150 mm diameter met behulp van een pipet en voeg de cellen uit de injectieflacon toe.
- Na 1 dag, aspireren de DMEM en vervangen door 15 mL verse DMEM. Verander vervolgens de media elke 2 of 3 dagen.
- Om de cellen los te maken van de petrischaal, Voeg 4 mL trypsine toe aan de petrischaaltjes en plaats ze in een incubator bij 36,5 °C en 5% CO2 gedurende 4 min.
3. monocultuur-spheroid-vorming
- Zet 2,5 mL van 4% (w/v) pluronic F-127-oplossing in het inlaat gat van de CMS-kweek chip (Figuur 2a) terwijl u de chip draait met 500 – 1000 rpm en draai vervolgens de chip bij 4.000 rpm gedurende 3 minuten met behulp van het CMS-systeem (Figuur 2b).
Opmerking: de pluronic coating voorkomt celbevestiging aan de inlaatpoort terwijl de chip draait. Zorg ervoor dat er geen lucht in de micro putjes zit. - Incuberen de CMS cultuur chip gevuld met pluronische oplossing 's nachts bij 36,5 °C in 5% CO2.
- Verwijder de pluronische oplossing, spoel de resterende pluronische oplossing met DMEM uit en droog de chip voor 12 uur op een schone Bank.
- Voeg 2,5 mL DMEM toe aan de CMS Culture chip en draai de chip bij ~ 4.000 rpm gedurende 3 min voor het voorbevochtigen van de binnenkant van de chip.
- Stop de rotatie en trek 100 μL van de DMEM uit om ruimte te maken voor het injecteren van de celsuspensie.
- Voeg 100 μL celsuspensies toe die 5 × 105 hascs of 8 × 105 MRC-5s bevatten door Pipetteer de cellen gelijkmatig te verdelen door Pipetteer 3 – 5x voor resuspensie.
- Draai de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 minuten om de cellen in elke titer te overvullen met een centrifugale kracht.
Opmerking: overmatige rotatiesnelheid kan leiden tot het ontsnappen van de cel door de oplossing uitwerpen gaten. - Kweek de cellen gedurende 3 dagen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2, draaibaar bij 1000 – 2000 rpm. Verander elke dag het kweekmedium.
4. cocultuurspheroid-vorming
-
Concentrische sferoïden-vorming
- Voeg de eerste cellen, 2,5 × 105 hascs, en draai de chip op 3.000 rpm. Na 3 min, voeg de tweede cellen, 4 × 105 MRC-5S, en draai de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min. Injecteer een totaal van 100 μL celsuspensies door pipetteren. Wanneer de cellen worden geïnjecteerd, verschuift u de rotatiesnelheid naar 500-1000 rpm.
- Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid% en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De concentrische sferoïden worden binnen 24 uur aangemaakt. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.
-
Janus spheroid-formatie
- Voeg 100 μL celsuspensies met de eerste cellen, 2,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip op 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.
- Voeg 100 μL celsuspensies met de tweede reeks cellen, 4 × 105 MRC-5S, toe door pipetteren terwijl de chip met 500 – 1000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De Janus sferoïden worden binnen 24 uur gecreëerd. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.
-
Sandwich-spheroid-vorming
- Voeg 100 μL celsuspensies met de eerste cellen, 1,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip op 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.
- Voeg 100 μL celsuspensies met de tweede cellen, 3 × 105 MRC-5S, toe door pipetteren terwijl de chip met een snelheid van 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid%, en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.
- Voeg 100 μL celsuspensies met de derde cellen, 1,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip met een snelheid van 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid% en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De sandwich sferoïden worden binnen 12 uur aangemaakt. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.
5. celkleuring
- Verwarm de celfluorescentie kleurstof op kamertemperatuur (20 °C).
- Voeg 20 μL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) per injectieflacon toe om een 1 mm oplossing te maken.
- Verdun de fluorescentie tot een uiteindelijke werkconcentratie van 1 μM met behulp van DMEM.
- Voeg de fluorescentie toe aan de celsuspensie en breng zachtjes door met een pipet.
- Inincuberen 20 min bij 36,5 °C, vochtigheid van > 95%, en 5% CO2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De CMS cultuur chip met 6 cm diameter (Figuur 2) werd met succes gemaakt volgens het bovenstaande protocol. Eerst werd de chip afzonderlijk gemaakt van een toplaag en een onderlaag en vervolgens door plasmaverlijming aan elkaar gebonden. Resulterende sferoïden kunnen gemakkelijk worden verzameld door het loskoppelen van de chip. Het kanaal van de CMS cultuur chip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, glijbaan en micro well regio's (Figuur 3). De cel-, medium-...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het CMS is een gesloten systeem waarin alle geïnjecteerde cellen zonder verspilling de titer binnenkomen, wat het efficiënter en zuiniger maakt dan conventionele titer-based spheroid-generatie methoden. In het CMS-systeem wordt de media elke 12 – 24 h vervangen door een zuigopening die is ontworpen om de media in de chip te verwijderen (Figuur 3a). Tijdens het zuig proces van de media worden nauwelijks media uit de titer ontsnapt door de oppervlaktespanning tussen de media en de wand van de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het basis wetenschaps onderzoeksprogramma (2016R1D1A1B03934418) en het bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) van het NRK, en gefinancierd door de Koreaanse overheid, MSIT.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymale stamcellen (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibioticum-Antimyoticum | Gibco | 15240-062 | Bevat 1% van voltooid medium en buffer |
| CellTracker Groen CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Rood CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numeriek bestuurde (CNC) draaigraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC-motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's gemodificeerd eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetaal bovien serum | ATCC | 30-2020 | Bevat 10% van voltooid medium |
| menselijke longfibroblasten (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computerondersteund ontwerpprogramma | |
| Petrischaal Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Oppervlaktebehandeld |
| Plasmareiniger | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Verdunnen met fosfaatgebufferde zoutoplossing tot 4% (w/v) oplossing |
| Polycarbonaat (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxaan (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsine | Gibco | 12604021 |
Referenties
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
