Hier presenteren we een protocol voor het opwekken van oculaire hypertensie en glaucomateuze neurodegeneratie in muis ogen door intracamerale injectie van siliconenolie en de procedure voor het verwijderen van siliconenolie uit de voorste kamer om verhoogde intraoculaire druk terug te Normale.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een omkeerbare silicium olie-geïnduceerde oculaire hypertensie model in muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verhoogde intraoculaire druk (IOP) is een goed gedocumenteerde risicofactor voor glaucoom. Hier beschrijven we een nieuwe, effectieve methode voor het consequent induceren van stabiele IOP-hoogte in muizen die de postoperatieve complicatie van het gebruik van siliconenolie (SO) nabootst als een tamponade-agent in de menselijke vitreoretinale chirurgie. In dit protocol, dus wordt geïnjecteerd in de voorste kamer van het oog van de muis om de leerling te blokkeren en te voorkomen dat instroom van waterige humor. De achterste kamer accureert waterige humor en dit verhoogt op zijn beurt de IOP van het posterieure segment. Een enkele dus injectie produceert betrouwbare, voldoende, en stabiele IOP hoogte, die induceert significante glaucomateuze neurodegeneratie. Dit model is een ware nabootsen van secundair glaucoom in de Oogkliniek. Om de klinische setting verder na te bootsen, kan dus uit de voorste kamer worden verwijderd om het afvoer traject te heropenen en toestroom van waterige humor mogelijk te maken, die door het trabeculaire gevlochten (TM) wordt afgevoerd onder de hoek van de voorste kamer. Omdat IOP snel terugkeert naar normaal, het model kan worden gebruikt voor het testen van het effect van het verlagen van IOP op glaucoom retinale ganglioncellen. Deze methode is eenvoudig, vereist geen speciale apparatuur of herhaalde procedures, simuleert nauwgezet klinische situaties en kan van toepassing zijn op diverse diersoorten. Er kunnen echter kleine wijzigingen nodig zijn.
Inleiding
Het progressieve verlies van retinale ganglioncellen (Rgc's) en hun axonen is het kenmerk van glaucoom, een gemeenschappelijke neurodegeneratieve ziekte in het netvlies1. Het zal gevolgen hebben voor meer dan 100.000.000 individuen 40 − 80 jaar oud door 20402. IOP blijft de enige veranderbare risicofactor in de ontwikkeling en progressie van glaucoom. Om de pathogenese, progressie en mogelijke behandelingen van glaucoom te onderzoeken, is een betrouwbaar, reproduceerbaar, en induceerbaar experimenteel oculair hypertensie/glaucoom model dat belangrijke kenmerken van menselijke patiënten repliceert noodzakelijk.
IOP is afhankelijk van waterige humor instroom naar de voorste kamer van het Ciliaire lichaam in de achterste kamer en uitstroom door het trabeculaire gevlochten (TM) onder de hoek van de voorste kamer. Bij het bereiken van een stabiele toestand, wordt IOP gehandhaafd. Wanneer de instroom hoger of lager is dan de uitstroom, stijgt of daalt de IOP respectievelijk. Door het verlagen van de waterige uitstroom door het occluderen van de hoek van de voorste kamer of door beschadiging van de TM, verschillende glaucoom modellen zijn vastgesteld3,4,5,6,7,8,9,10. Deze modellen worden normaalgesproken geassocieerd met onomkeerbare schade aan het oogweefsel en de hoge IOP in de voorste kamer veroorzaakt ook ongewenste complicaties zoals corneale oedeem en intraoculaire ontsteking, waardoor retinale beeldvorming en visuele functie assays moeilijk uit te voeren en te interpreteren.
Om een model te ontwikkelen dat deze tekortkomingen overkomt, hebben we ons geconcentreerd op het goed gedocumenteerde secundaire glaucoom veroorzaakt door siliconenolie (so) die optreedt als postoperatieve complicatie van de menselijke vitreoretinal chirurgie11,12. DUS wordt gebruikt als een tamponade in retinale operaties vanwege de hoge oppervlaktespanning. Echter, zo kan fysiek occlude leerling omdat het lichter dan de waterige en glasvocht vloeistoffen, die voorkomt waterige stroming in de voorste oogkamer. De obstructie veroorzaakt IOP elevatie in de achterste kamer als gevolg van de waterige humor accumulatie. Dit motiveerde ons om een nieuw oculaire hypertensie muismodel te ontwikkelen en te karakteriseren op basis van intracameral, dus injectie en pupil blok13, met belangrijke kenmerken van het secundaire glaucoom: effectief pupil blok, significante IOP hoogte die kan terugkeren naar de normale na zo verwijdering, en glaucoom neurodegeneratie.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor zo geïnduceerde oculaire hypertensie in het muis oog, inclusief injectie en verwijdering en IOP meting.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Stanford-universiteit.
1. oculaire hypertensie inductie door intracamerale injectie van SO
- Maak een glazen micropipet voor intracameral, zodat de injectie door een glazen capillair met een pipet trekker aan te trekken om een micro pipet te genereren. Knip een opening aan de punt van de pipet en slijp de punt verder met een microgrinder-Afschuining machine om een schuine kant van 35 ° − 40 ° te maken.
- Poets de randen van de schuine kant en verwijder alle vuil door te wassen met water. De micropipet voor gebruik te Autoclaveren.
- Bereid de paracentese naald voor de cornea-ingang. Om dit te doen, bevestig een 32 G naald op een 5 mL spuit op een Luer slot, en verder te beveiligen met tape. Buig de punt van de naald schuine zijde omhoog op 30 °.
- Bereid de zo injector door het bevestigen en vastzetten van een stompe eind 18 G naald op een 10 mL spuit eerst. Bevestig vervolgens een plastic buis met de 18 G naald aan het ene uiteinde en vul zo nodig aan het andere uiteinde.
- Bevestig de gesteriliseerde micropipet aan de plastic buis en duw de zuiger van de spuit in om de volledige micro pipet met zo te vullen.
2. intracameral dus injectie voor één oog
- Plaats een 9 − 10 weken oude mannelijke C57B6/J-muis in een inductie kamer met 3% Isofluraan vermengd met zuurstof bij 2 L/min gedurende 3 min.
- Intraperitoneaal injecteren 2, 2, 2-tribromoethanol bij 0,3 mg/g lichaamsgewicht.
Opmerking: in tegenstelling tot ketamine/xylazine veroorzaakt 2, 2, 2-tribromoethanol geen duidelijke pupilverwijding. - Controleer het gebrek aan reactie op een teen knijpen en het gebrek aan beweging van de snorharen of de staart om de verdoving sterkte te bepalen.
- Plaats de muis in een laterale positie op een operatie platform. Om de gevoeligheid tijdens de procedure te verminderen, breng een druppel van 0,5% ooganestheticum hydrochloride aan het hoornvlies vóór de injectie.
- Maak een intrede incisie met de 32 G paracentese naald in het superotemporale Kwadrant, ongeveer 0,5 mm van de limbus.
- Tunnel door de lagen van het hoornvlies voor ongeveer 0,3 mm voordat piercing in de voorste oogkamer. Let op dat u de lens of Iris niet aanraakt.
- Trek de naald langzaam op om een waterig humeur (ongeveer 1 − 2 μL) uit de voorste kamer door de tunnel (paracentesis) vrij te geven.
- Wacht ~ 8 min om de IOP verder te verlagen. Dit kan worden bepaald door het meten van de contralaterale, controle oog.
- Plaats de glazen micropipet met de vooraf geladen, door de corneale tunnel in de voorste kamer, met de schuine kant naar beneden naar het Iris oppervlak.
- Duw de zuiger van de spuit langzaam in om zo in de voorste kamer te injecteren totdat de zo druppel het grootste deel van het Iris oppervlak bedekt, ~ 2,3 − 2,4 mm in diameter.
- Laat de pipet in de voorste oogkamer voor 10 sec. voordat u het langzaam intrekt.
- Duw het bovenste ooglid zachtjes om de cornea incisie te sluiten om zo lekkage te minimaliseren.
- Breng antibiotica zalf (bacitracine-neomycine-Polymyxine) aan op het oogoppervlak.
- Tijdens de procedure, regelmatig bevochtigen het hoornvlies met kunstmatige tranen.
- Houd de muis op de verwarmingsblok totdat volledig hersteld van anesthesie.
3. zo verwijderen
- Bereid het irrigatiesysteem voor.
- Bereid de geïrigeerde oplossing volgens de instructies van de fabrikant en plaats deze in de irrigatie fles. Verhoog de irrigatie oplossing fles naar 110 − 120 cm (81 − 88 mmHg) boven het operatie platform.
- Bevestig een IV Administration set aan de irrigatie oplossing fles. Verwijder luchtbellen uit de I.V.-slang. Sluit een 33 G-naald gebogen tot 20 ° met het gezicht tot aan de I.V.-slang.
- Om het drainage systeem voor te bereiden, verwijder de zuiger van een 1 mL spuit. Bevestig een 33 G naald aan de spuit en buig de naald tot 20 °.
- Verwijder dit uit de voorste kamer.
- Intraperitoneaal injecteren 2, 2, 2-tribromoethanol (0,3 mg/g lichaamsgewicht). Controleer het gebrek aan reactie op de teen pinch om de verdoving sterkte en het gebrek aan beweging van de snorharen of de staart te bepalen.
- Plaats de muis op een operatie platform en bevestig het in de laterale positie met tape. Breng één druppel 0,5% ooganestheticum hydrochloride aan op het hoornvlies om de gevoeligheid ervan te verminderen.
- Maak twee incisies in het temporale kwadrant van het hoornvlies tussen ~ 2 en 5 uur aan de rand van de so druppel met behulp van de premade 32 G paracentese naald.
- Plaats een 33 G irrigatie naald verbonden aan irrigatie oplossing via één corneale incisie, maximale snelheid.
- Plaats een andere 33 G drainage naald die aan de spuit is bevestigd zonder een zuiger door de andere corneale incisie, zodat de zo druppel de voorste oogkamer kan verlaten tijdens het bevateren met een irrigatie oplossing.
- Trek de drainage naald, dan de irrigatie naald.
- Injecteer een luchtbel in de voorste kamer om de normale diepte te behouden en druk op om het hooral incisie te sluiten.
- Breng antibiotica zalf aan op beide ogen.
- Houd de muis op de verwarming Recovery pad totdat volledig hersteld van de anesthesie.
4. IOP meting eenmaal per week
- Plaats de muis in een inductie kamer geperfundeerd met 3% Isofluraan vermengd met zuurstof bij 2l/min gedurende 3 minuten.
- Intraperitoneaal injecteren xylazine en ketamine (0,01 mg xylazine/g, 0,08 mg ketamine/g).
- Houd het hoornvlies vochtig door het toepassen van kunstmatige tranen tijdens de procedure.
- Wacht ongeveer 15 minuten om de leerling volledig te laten verwijden.
- Meet de IOP van beide ogen met behulp van een tonometer volgens de instructies van het product. Breng de tonometer in de buurt van het muis oog. Houd de afstand van de punt van de sonde naar de muis hoornvlies op ongeveer 3 − 4 mm. Druk op de meetknop 6x om één lezing te genereren. Drie machinaal gegenereerde aflezingen worden verkregen uit elk oog om de gemiddelde IOP te verwerven.
- Opofferen van de dieren op 8 weken na de injectie en het uitvoeren van Immunohistochemie van de hele-Mount retina, RGC tellen, oogzenuw (op) semi-dunne secties, en kwantificering van overgebleven axonen, die zijn beschreven vóór13.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Kort na de injectie kunnen we gemakkelijk muizen identificeren die geen stabiele oculaire hypertensie produceren omdat de druppels te klein zijn (≤ 1,5 mm)13. Deze dieren zijn uitgesloten van latere experimenten. Na de injectie procedures eindigen meer dan 80% van de zo geïnjecteerde muizen met druppeltjes groter dan 1,6 mm. We hebben de IOP van deze muis ogen één keer per week gemeten gedurende 8 weken na een enkele injectie. De IOP van het oogje zo bleef hoog, over het algemeen verdubbelen de IO...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier demonstreren we een eenvoudige maar effectieve procedure voor het induceren van aanhoudende IOP elevatie in de muis oog door intracamerale injectie van SO. Deze procedure kan snel worden geleerd door iedereen met ervaring in micro dissectie onder een microscoop. Het primaire potentiële risico op falen is de lekkage van zo uit de corneale incisie. Een van de voordelen van het gebruik van SO is echter dat, omdat de olie druppel zichtbaar en meetbaar is, we gemakkelijk muizen kunnen identificeren die te klein zijn ontv...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door NIH grants EY024932, EY023295 en EY028106 aan YH.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
Referenties
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
