Detecteren van de totstandbrenging van gedeelde bloedtoevoer in parabiotische muizen door Caudal Vein Glucose Injection

Samenvatting

Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het opsporen van een succesvolle vaststelling van gedeelde bloedcirculatie van twee parabionten door middel van een caudale ader injectie van glucose, die minimale schade veroorzaakt en is niet fataal voor de parabionts.

Samenvatting

Parabiose is een experimentele methode voor het chirurgisch combineren van twee parallelle dieren langs de lengteas van het lichaam. We presenteren een protocol voor het opsporen van de succesvolle oprichting van bloedchimerisme in parabionts door een caudal aderinjectie van glucose. Parabiotische muizen werden geconstrueerd. Glucose werd geïnjecteerd in de donormuis door de staartader, en de fluctuatie van de bloedsuikerspiegel werd gemeten bij beide muizen met behulp van een bloedglucometer op verschillende tijdspunten. Onze resultaten toonden aan dat na glucose-injectie het bloedglucoseniveau bij donormuizen na 1 min sterk steeg en daarna langzaam daalde. Ondertussen piekte de bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen 15 min na injectie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Evans blauw, gebruikt als een positieve controle voor glucose. De synchrone fluctuatie van de bloedsuikerspiegel geeft aan dat de bloedstroom tussen de twee muizen met succes werd vastgesteld.

Inleiding

Parabiose is een modelleringsmethode waarbij twee levende organismen chirurgisch worden samengevoegd en zich ontwikkelen als één fysiologisch systeem met een gedeelde bloedsomloop¹. Dergelijke modellen zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de fysiologie vanwege het voordeel dat de stoffen die door één enkel individu worden geproduceerd, tegelijkertijd via de gedeelde bloedsomloop op beide dieren kunnen werken. Sinds het midden van de jaren 1800, toen parabiotische experimenten werden gepionierd door Paul Bert², zijn de methoden voor de bouw van parabiotische modellen gestandaardiseerd geworden. Echter, een eenvoudige en handige methode voor het verifiëren van de succesvolle oprichting van bloedchimerisme is verdwenen. Er is gemeld dat cross-circulation met succes kan worden beoordeeld door intraperitoneally injecteren 0,5% Evans blauwe kleurstof in een van de parabionten, gevolgd door meting van de absorptie van Evans blauw in het bloed van beide parabionts met een microplate lezer³. Een andere methode vereist een specifiek muisras dat CD45.1⁺- en CD45.2⁺-gelabelde monocyten in elke parabiont bevat. Celcytometrie wordt vervolgens gebruikt om bloedchimerisme te bepalen door de frequentie van de twee markers in monocyten van milt of bloed te meten⁴. Deze methoden zijn echter vaak dodelijk of omslachtig voor de dieren, en een veilige en eenvoudige methode voor snelle en betrouwbare verificatie van parabiotische modellen is zeer wenselijk. In deze studie hebben we hiervoor een nieuwe methode vastgesteld, die werd gevalideerd in een muismodel van parabiose. Glucoseconcentratie in bloedmonsters uit een staartader wordt gemeten met behulp van een glucometer, en het patroon van veranderingen van glucoseniveau bij donor- en ontvangende muizen wordt beschouwd als een indicatie van circulatiechimerisme. We noemden deze methode de "glucose fluctuatiemethode". De toepassing van deze validatiemethode is niet beperkt tot muizen, maar kan worden uitgebreid tot diverse pathologische modellen, behalve voor modellen met ernstige dysregulatie van het glucosemetabolisme. De procedure is eenvoudig, tijdbesparend en veilig.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren en hun zorg werden goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van de Harbin Medical University.

OPMERKING: De gereedschappen en apparatuur die nodig zijn voor de methode zijn opgenomen in de tabel met materialen.

1. Bereiding van materialen en dieren

1. Bestel C57BL/6 mannelijke muizen met een gewicht tussen 20 g-25 g bij een standaard leverancier van laboratoriumdieren.
2. Huis de muizen in een cyclus van 12 uur licht: 12 uur duisternis bij 24−26 °C met ad libitum toegang tot water en voedsel.

2. Parabiose

1. Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol bij een concentratie van 0,1 mL/10 g. Bevestig een goede verdoving zoals aangegeven door spierontspanning, langzame en gestage ademhaling, verlies van huidstimulatiereflex en verdwijning van hoornvliesreflex.
2. Breng oogheelkundige zalf aan met een Q-tip om droge ogen te voorkomen.
3. Voer de parabioseprocedure uit zoals eerder beschreven⁵.
   1. Plaats de muizen in de supine positie. Scheer grondig de linkerkant van de ene muis en de rechterkant van de andere muis vanaf ongeveer 1 cm boven de elleboog tot 1 cm onder de knie met een elektrisch scheerapparaat. Gebruik ontharingscrème om de vacht op de geschoren huid volledig te wissen.
   2. Veeg de geschoren gebieden met iodophor. Plaats de muizen op een verwarmde pad bedekt met een steriele pad.
   3. Maak longitudinale huidinsnijdingen vanaf 0,5 cm boven de elleboog tot 0,5 cm onder het kniegewricht met behulp van een scherpe schaar aan de geschoren kant van elk dier.
   4. Maak de huid voorzichtig los van de onderhuidse fascia na de incisie.
   5. Sluit de olecranon en knie van de parabiont aan met een 3-0 hechting.
   6. Hecht de geschoren huid met een continue 5-0 hechting.
4. Injecteer 0,5 mL van 0,9% NaCl onderhuids aan elke muis om uitdroging te voorkomen.
5. Injecteer tramadol (10 mg/25 g/dag) intramusair aan elke muis om pijn te verlichten.

3. Validatie van circulatiechimerisme

1. Glucosefluctuatiemethode
   OPMERKING: Controleer de succesvolle constructie van circulatiechimerisme tussen parabionts met behulp van de glucosefluctuatiemethode (geen vasten) op de 10e dag na de parabiosechirurgie.
   1. Verdoven de parabionts door intraperitoneale injectie van 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol aan elke muis bij een concentratie van 0,1 mL/10 g.
   2. Bevestig de donormuizen in een Venous visuele muisstaartfixator.
   3. Wrijf de staartaders in de flank van een van de staart van de parabiont met een katoenen bal gedrenkt in 70−75% alcohol om de staart schoon te maken en de bloedvaten te verwijden.
   4. Houd een 1,0 mL spuit met glucose in de rechterhand en houd de naald parallel aan de ader (minder dan 15°).
   5. Plaats de naald op een positie ongeveer 2−4 cm van de staartpunt.
   6. Injecteer 100 μL glucose (1,2 g/kg) in de donor binnen 10 s.
      OPMERKING: De term donor verwijst naar de parabiont die de glucose-injectie ontvangt via de staartader. De ontvanger is de andere parabiont, die niet direct glucose ontvangt.
   7. Maak de tenen schoon met iodophor. Snijd de tenen van de donor en de ontvangende muizen af met een schaar en verzamel een druppel bloed op verschillende tijdpunten na de injectie van glucose (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min en 60 min). Verwijder het bloedstolsel op elk verzamelmoment punt om meer schade te voorkomen.
      OPMERKING: Het volume van het verzamelde bloed was 10-25 ul voor een test, en 90-225 ul in totaal.
   8. Druppel het bloed in het midden van glucometer teststrips voor glucoseniveau detectie.
2. Gebruik Evan's blauwe Counterstain als een positieve controle³.
   1. Injecteer 200 μL van 0,5% Evan's blauwe Counterstain intraperitoneally in de donormuis.
   2. 2 uur later, euthanaseren de parabionten door intraperitoneale injectie van 20 g/L 2,2,2-tribromoethanol aan elke muis bij een concentratie van 0,2 mL/10 g, en verzamel bloed van beide parabionts door cardiale punctie.
   3. Centrifugeer de bloedmonsters op 916 x g gedurende 15 min.
   4. Verzamel serum van de supernatant.
   5. Verdun het serum met 0,9% NaCl om 1:50.
   6. Meet de absorptie van de verdunde serummonsters op 620 nm met een spectrofotometer.

Resultaten

Bij zes donormuizen steeg de bloedsuikerspiegel sterk tot 26,5 μmol/L (173% toename) met een gemiddelde van 1 min na de injectie van 100 μL glucose (1,2 g/kg) door de staartader en daalde vervolgens geleidelijk tot 13,3 mol μ/L bij 60 min. Bij de ontvangende muizen nam de bloedglucose na de injectie langzaam toe en bereikte het eerste piekniveau op 15 min (47% toename, 12,2 μmol/L). Op basis van de bovenstaande resultaten werd de norm voor circulatiechimerisme als volgt vastgesteld: 1) ee...

Discussie

Parabiose verwijst naar de chirurgische techniek om twee levende dieren met elkaar te verbinden om een gemeenschappelijk vasculair systeem op te zetten met experimentele middelen^6,7,8. Het voordeel van dit model is dat de stoffen die door één enkel individu worden geproduceerd tegelijkertijd op beide dieren kunnen werken. Zo kan het parabiosemodel worden gebruikt om de rol van een stof of factor in een verwante ziekte te onderzo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
curved forceps	JZ chirurgische instrumenten, China	J31340
fijne schaar	JZ chirurgische instrumenten, China	WA1030
naaldtang	JZ chirurgische instrumenten, China	60017961
2,5 mL spuiten	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicilline	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
ontharingscrème	Nair, USA	LL9161
Verwarmingsdeken (Verwarmingskussen)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Elektrisch scheerapparaat	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 chirurgische hechting	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#