Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Samenvatting

Deze methode beschrijft het gebruik van het R26R-Confetti (Confetti) muismodel om gemineraliseerde weefsels te bestuderen, die alle stappen van de fokstrategie naar het beeld acquirements bedekken. Inbegrepen is een algemeen protocol dat kan worden toegepast op alle zachte weefsels en een gemodificeerd protocol dat kan worden toegepast op gemineraliseerde weefsels.

Samenvatting

Het labelen van een individuele cel in het lichaam om te controleren welke celtypen kan leiden tot en het bijhouden van de migratie door het organisme of bepalen de levensduur kan een krachtige manier om te onthullen mechanismen van weefsel ontwikkeling en onderhoud. Een van de belangrijkste tools die momenteel beschikbaar zijn voor het bewaken van cellen in vivo is het confetti muismodel. Het confetti model kan worden gebruikt voor het genetisch labelen van individuele cellen in levende muizen met verschillende fluorescerende eiwitten in een celtypespecifieke manier en het volgen van hun lot, evenals het lot van hun nakomelingen in de loop van de tijd, in een proces genaamd van klonen genetische tracing of klonale Lineage tracing. Dit model werd bijna een decennium geleden gegenereerd en heeft bijgedragen aan een beter begrip van veel biologische processen, met name in verband met stamcel biologie, ontwikkeling en vernieuwing van volwassen weefsels. Echter, behoud van het fluorescerende signaal tot het verzamelen van beelden en gelijktijdige opname van verschillende fluorescerende signalen is technisch uitdagend, met name voor gemineraliseerd weefsel. In deze publicatie wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor het gebruik van het confetti model om de groei plaat kraakbeen te analyseren die kan worden toegepast op alle gemineraliseerde of niet-gemineraliseerde weefsels.

Inleiding

Verbeterde methoden om het gedrag van cellen te bewaken, zijn wenselijk om de experimentele efficiëntie te verhogen bij het gebruik van diermodellen. Een van de meest informatieve benaderingen voor het bewaken van Celgedrag in vivo is van klonen Lineage tracing met multicolor reporter muis stammen¹, met inbegrip van de veelgebruikte R26R-Confetti (Confetti) muis². Door het genetisch labelen van individuele cellen met fluorescerende eiwitten en het volgen van die cellen in de loop van de tijd, hebben onderzoekers op veel gebieden de confetti muis gebruikt om inzichten te onthullen in een veelheid van verschillende biologische systemen.

De confetti muis is een loxP-based reporter systeem waarin CRE afhankelijke DNA recombinatie de permanente expressie van een van de verschillende mogelijke fluorescerende eiwitten op een stochastische manier²veroorzaakt. De R26R-confetti allel bevat de alomtegenwoordige CAGG Promoter, die direct stroomopwaarts ligt van een loxP-geflankeerd Neo^R-cassette², waarvan de polyadenylatie sequentie de transcriptie³beëindigt, gevolgd door de Brainbow 2,1 construct⁴. Vandaar dat CRE-gemedieerde recombinatie tegelijkertijd de neo^R-cassette uitblinkte en leidt tot de productie van bepaalde fluorescerende eiwitten, afhankelijk van welke delen van de brainbow 2,1 constructie zijn weggesneden. Deze functie maakt de confetti muis uiterst aanpasbaar, omdat deze kan worden gebruikt om elke cellulaire populatie in een muis te targeten waarvoor een specifieke CRE-stam beschikbaar is. De kruising van een weefsel-specifieke CRE stam met de R26R-confetti stam biedt de specificiteit van labeling. De belasting van de CRE moet echter ook noodzakelijk zijn (bijv. CreERT of CreERT2, die Tamoxifen binding nodig heeft om hen in staat te stellen de Nucleus binnen te komen en DNA recombinatie⁵te induceren), zodat het labelen op bepaalde tijdstippen kan worden bereikt. Zo kan een cellulaire populatie worden gelabeld door het injecteren van de resulterende CreERT-positieve/confetti-positieve nakomelingen met tamoxifen op het gewenste tijdstip en getraceerd tot een bepaalde leeftijd, wanneer de weefsels van belang kunnen worden verzameld voor analyse. Na weefsel verwerking kunnen de fluorescerende gelabelde cellen direct worden gevisualiseerd door confocale microscopie, zodat de nakomelingen van elke aanvankelijk gelabelde cel kunnen worden gescheiden van de nakomelingen die worden gegenereerd door een andere gelabelde cel op basis van hun specifieke fluorescerende van de etiketten, waardoor clonaliteit kan worden beoordeeld (d.w.z. een klonale genetische tracering).

Door de flexibiliteit van het confetti model is het toegepast om de ontwikkeling en het onderhoud van veel verschillende weefsels in gezondheid en ziekte^{2,6,7,8,9, 10,11}. Een veelgebruikte manier om het model te gebruiken is om een bepaalde populatie cellen te labelen en te bepalen in welke weefsels zij (en/of hun nakomelingen) hebben bijgedragen. Een dergelijke bevinding met behulp van deze aanpak was dat de volwassen tand bestaat uit cellen met een gliale oorsprong⁶. Een andere toepassing van het model is het bestuderen van stamcel homeostase. Bijvoorbeeld, het confetti model onthulde dat stamcel niches in de intestinale crypten geleidelijk monoklonaal worden, omdat sommige stamcel klonen dominant zijn tijdens de competitie tussen stamcellen². Het model kan ook worden gebruikt om celproliferatie te beoordelen, wat vooral nuttig is voor het bestuderen van langzaam cellen verdelen. Bijvoorbeeld, klonale vorming in het articulaire kraakbeen¹² werd beoordeeld, en de korte-termijn effecten van een egel-antagonist op groei plaat chondrocyten in vijf weken oude muizen werd bestudeerd¹³.

Ondanks de relatieve eenvoud van het confetti model, kan het fluorescerende signaal technisch uitdagend zijn om te behouden tot de beeld verzameling, vooral bij het analyseren van gemineraliseerde weefsels. Hier beschrijft het protocol een geoptimaliseerd model om de confetti muis te gebruiken met het postnatale bot (tot 6 maanden oud), waardoor fluorescerende eiwitten direct gevisualiseerd kunnen worden door confocale microscopie zonder dat er immunodetectie nodig is. Dit vereenvoudigde protocol kan worden toegepast op niet-gemineraliseerde weefsels. Bovendien is inbegrepen een beschrijving van het opslaan van de monsters om het fluorescerende signaal gedurende een langere periode van ten minste 3 jaar te bewaren. Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.

Protocol

Alle muiswerk werd goedgekeurd door het ethisch comité voor dierproeven (Stockholm North Committee/Norra Djurförsöksetiska Nämd) en uitgevoerd in overeenstemming met de bepalingen en richtlijnen van het Zweedse dieren Bureau voor dierproeven.

1. muis fokken

1. Om de stam te genereren, steekt u de R26R-confetti muis over met de CRE-lijn van belang. Wean de pups op 21 dagen oud.
   Opmerking: muizen kunnen worden gebruikt voor de fokkerij vanaf ongeveer 8 weken oud, of volgens de lokale richtlijnen. Genotypering (hier niet beschreven) kan worden uitgevoerd vanaf biopsieën verzameld bij het spenen. De leeftijd bij het spenen kan aangepast worden volgens de lokale richtlijnen.

2. confetti labelen

Opmerking: deze etiketterings strategie is geschikt voor Tamoxifen-induceerbaar CRE stammen.

1. Bereid een oplossing van maximaal 2,5 mg/mL tamoxifen in maïsolie in een glazen fles. Los op door te verwarmen tot 37 °C in een oven tot 60 minuten, waarbij elke 5 minuten wordt geaglukt met behulp van een Vortex totdat het poeder is opgelost.
   Opmerking: voor verhoogde doses Tamoxifen kunnen oplossingen tot 20 mg/mL worden bereid met deze methode.
2. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden, beschermd tegen licht.
3. Induceren recombinatie door toediening van 50 μL 2,5 mg/ml Tamoxifen opgelost in maïsolie intraperitoneaal op de eerste postnatale dag (P1).
   Opmerking: in principe kan Tamoxifen op elke leeftijd worden toegediend, al vanaf de F1-generatie. De dosis Tamoxifen moet worden gevarieerd op basis van CRE-expressie, muis leeftijd en experimentele toepassing. Meer informatie vindt u in de sectie discussie. CRE-negatieve muizen die op dezelfde manier worden behandeld, kunnen worden gebruikt als een negatieve controle voor confetti-fluorescerende signalen.
   Let op: Zorg ervoor dat dieren behandellers worden gewaarschuwd voor het gebruik van Tamoxifen en ervoor zorgen dat kooi materialen worden afgevoerd volgens lokale milieu-en veiligheidsrichtlijnen.

3. weefsel verzameling

1. Euthanaseren muizen op postnatale dag 27 (P27) door het geleidelijk vullen van de ruimte met de muizen met koolstofdioxide tot ten minste 80% volume en het handhaven van deze concentratie voor 3 min. Voer baarmoederhals dislocatie. Houd muizen op ijs tijdens het dissectie van de andere dieren.
2. Dissect het weefsel van belang. Hieronder wordt een protocol beschreven voor het verzamelen van de proximale tibiale en distale femorale groei platen en articulaire kraakbeen van de knie, geschikt voor postnatale muizen tot de leeftijd van 6 maanden.
   1. Verwijder de huid rond de achterpoten tot aan de voet, met behulp van een scherpe schaar en getande Tang.
   2. Trim ruwweg het spier-en vetweefsel van de benen met een scherpe schaar.
      Opmerking: Reinig de botten niet perfect, omdat de omringende weefsels structurele ondersteuning bieden bij het snijden, maar zorg ervoor dat alle huid wordt verwijderd.
   3. Gebruik een scalpel, snijd door het zachte weefsel waar de bovenkant van het been voldoet aan het lichaam totdat de femur kop zichtbaar is, snijd dan de ligamenten in het heupgewricht om het been te verwijderen.
      Opmerking: als het niet mogelijk is om de dijbeen kop te vinden, snijd dan door het dijbeen dicht bij de heup met een sterke schaar.
   4. Ontleden de voet van de rest van het been met een scalpel of een scherpe schaar.

4. weefsel fixatie en-verwerking

Opmerking: op basis van het weefsel van belang, volg een van de twee onderstaande protocollen (4,1 voor zachte weefsels of 4,2 voor gemineraliseerde muizen weefsels over de leeftijd van ongeveer 45 dagen, zoals hieronder beschreven). Bewaar voor beide methoden de ontleed monsters in de 3,7% formaldehyde/fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs terwijl de overblijvende dieren worden ontleed.

1. Voor zachte weefsels en gemineraliseerde tibiae en dijbenen tot de leeftijd van ongeveer P45, fixeer het weefsel in voorgekookt 3,7% formaldehyde/PBS voor 6 h, dat zachtjes op een Rotator op 4 °c rolt. Gebruik een volume dat minstens 10 x groter is dan dat van het weefsel. Ga rechtstreeks naar stap 4,3.
2. Voor gemineraliseerde weefsels, met inbegrip van de tibiae en dijbenen over de leeftijd van ongeveer P45, is een decalcificatie stap vereist.
   1. Bereid 1 L 10% EDTA/dH₂O-oplossing voor met de pH-aanpassing met natriumhydroxide 8,05. Verdun vervolgens de formaldehyde tot 3,7% met deze oplossing. De werkconcentratie van EDTA zal 9% zijn.
   2. Bevestig het weefsel door 's nachts in de voorooled 3,7% formaldehyde/PBS te plaatsen en zachtjes op een rotator te rollen bij 4 °C.
   3. Plaats het weefsel in voorgekookte 3,7% formaldehyde/9% EDTA/dH₂O-oplossing (pH 8,05) en draai zachtjes bij 4 °c in een volume dat ten minste 10 x groter is dan dat van het weefsel. Herhaal deze stap door de botten in vers, voorgekookt 3,7% formaldehyde/9% EDTA/dH₂O voor 3x over de volgende 48 h te plaatsen.
      Opmerking: deze korte decalcificatie is voldoende om het snijden van de dijbeen en de Tibia botten van maximaal 6 maanden oude muizen mogelijk te maken. Voor meer dicht gemineraliseerde weefsels kan verdere decalcificatie nodig zijn om de histologie te verbeteren.
3. Breng het weefsel over in gekoelde 30% sucrose/DH₂O. Vul de container tot de rand en draai zachtjes 's nachts bij 4 °c. Gebruik een volume dat minstens 10 x groter is dan dat van het weefsel. Het weefsel zal vaak zweven wanneer het voor het eerst in deze oplossing en zinken naar de bodem van de fles door de ochtend.
4. Om de resterende sacharoseoplossing te verwijderen, moet u het weefsel kort wassen door het uit de sacharoseoplossing met een tang te verwijderen en het monster volledig te bedekken met ongeveer 5 ml optimale snijtemperatuur Compound (OCT) gedurende enkele seconden.
5. Vul een prelabeled cryomold met OCT en plaats het weefsel aan de onderkant. Werk snel om te voorkomen dat de monsters te lang op kamertemperatuur zitten.
   Opmerking: het is belangrijk om het monster in een handige oriëntatie voor de snij stap te plaatsen. Om de kans op snijden door hele groei plaat kolommen na het traceren met Col2CreERT vergroten: confetti, plaats de mediale zijde naar beneden met behulp van de femur Head als een geleider, en Positioneer het monster als plat naar de bodem van de mal mogelijk.
6. Sluit het monster door de mal op droogijs te plaatsen en te wachten tot de LGO volledig stollen. Plaats de cryomolds zo plat mogelijk om beweging/glijden van het weefsel in de mal te voorkomen. Eenmaal klaar, bewaar de monsters bij-20 °C, als ze niet onmiddellijk worden gebruikt.
   Opmerking: gebruik binnen 12 weken, want met de leeftijd worden de blokken moeilijker in de sectie.

5. snijden

Opmerking: Voer cryosectioning uit met een cryostaat met wegwerpmessen die geschikt zijn voor hard weefsel. Elke standaard cryostaat is geschikt.

1. Verwijder het blok van de mal en bevestig het aan de klauwplaat door het aanbrengen van een LGO tussen de bovenkant van het blok en de boorkop en koeling in het cryostaat bij-20 °C gedurende ten minste 5 minuten, zodat de LGO volledig is gestijgd.
2. Precool zowel de monsterhouder als de meshouder tot-20 °C en plaats het monster/de klauwplaat in de houder van de klauwplaat en het blad in de meshouder om enkele minuten te equilibraten.
   Opmerking: de gespecificeerde temperaturen kunnen variëren met verschillende graden, afhankelijk van de cryostaat en het weefsel van belang.
3. Gebruik de cryostaat om het blok en snijd weefsel secties van een geschikte dikte te trimmen om de visualisatie van de klonen in het weefsel van belang mogelijk te maken.
   1. Voor de postnatale groei plaat analyse u secties van 30 − 160 μm voorbereiden en op dia's verzamelen. Sommige cryostaat modellen kunnen alleen de verzameling van dikke delen toestaan met behulp van de trim-instelling.
4. Lucht drogen de glaasjes bij kamertemperatuur totdat ze volledig droog zijn.
   Opmerking: de duur van deze stap kan variëren op basis van weefsel eigenschappen en sectie dikte. De temperatuur van de ruimte is waarschijnlijk ook van invloed op de snelheid van deze stap.
5. Bewaar de dia's bij-20 °C gedurende maximaal 36 maanden, of als de verwerking onmiddellijk wordt uitgevoerd, gaat u verder met stap 6,2.

6. dia voorbereiding en montage

1. Verwijder de schuif uit de vriezer en breng de kamertemperatuur horizontaal in een schuif houder aan. Laat elke condensatie verdampen.
2. Verwijder de LGO met behulp van een Pasteur-pipet om PBS op kamertemperatuur zachtjes op de dia aan te brengen. Hoe dikker de sectie, hoe langer de tijd nodig is. Voor 160 μm dikke delen, twee spoelen uitvoeren: eenmaal 15 minuten inbroed en de vloeistof verwijderen, en vervolgens verse PBS aanbrengen gedurende 5 minuten en de vloeistof verwijderen.
   Opmerking: deze stap is om de LGO te verwijderen en kan worden gevarieerd op basis van weefsel eigenschappen en sectie dikte, indien van toepassing. De temperatuur van de ruimte is waarschijnlijk van invloed op de snelheid van deze stap.
3. Monteer de dia's in een oplossing van 75% 2, 2-Thiodiethanol/dH₂O bij kamertemperatuur met 60 mm lange afdek stroken.
   Opmerking: Dia's kunnen direct voor de beeldvorming worden bereid, maar het fluorescerende signaal is gedurende 1 − 2 weken stabiel als het uit het licht wordt gehouden in een bevoficeerde kamer bij 4 °C.

7. beeldvorming door confocale microscopie

1. Stel de Microscoop in.
   1. Zet de Microscoop aan en open de software. Klik op de knop systeem starten .
   2. Selecteer de kanalen door eerst op Smart Setup te klikken onder het tabblad acquisitie en vervolgens de drie kanalen te selecteren die corresponderen met rood FLUORESCERENDE eiwit (RFP), geel FLUORESCERENDE proteïne (yfp) en cyaan FLUORESCERENDE eiwitten (GVB) onder de Kleurstof kop. Klik op beste signaal vervolgens toepassen om de lasers te selecteren.
      Opmerking: de inhoud van het tabblad acquisitie wordt weergegeven in aanvullend bestand 1a. Als de vereiste kanalen niet aanwezig zijn, voegt u ze toe met de knop '+' onder de kop van de kleurstof . De nodige informatie over laser, excitatie golflengten en het bereik van de opgenomen emissie golflengten wordt getoond voor de drie confetti fluorescerende eiwitten in aanvullend bestand 1B-D.
   3. Selecteer de objectief lens van 20 x onder de kop objectief op het tabblad acquisitie modus .
2. Zoek de groei plaat of ander weefsel van belang.
   1. Als u een afzonderlijke weergave wilt opgeven, selecteert u eerst het RFP-kanaal door op de naam op het tabblad kanalen te klikken. Dit zorgt ervoor dat details van het RFP-kanaal worden weergegeven op het tabblad lichtpad . Klik op het selectievakje naast T-bet.
      Opmerking: T-PMT-kanaal toont niet-gereflecteerde laserlicht, dat wordt gebruikt om de niet-fluorescerende delen van het weefsel te visualiseren.
   2. Plaats de glijbaan in de houder en Positioneer de groei plaat of ander weefsel van belang direct tussen het lichtpad en de objectief lens.
   3. Om te vereenvoudigen lokaliseren van het weefsel, Deselecteer de YFP en CFP kanalen met behulp van de selectievakjes onder de tracks kop van de kanalen tab.
   4. Selecteer het T-PMT-kanaal door op de naam te klikken in de kop tracks . Klik op Live op het tabblad acquisitie en verhoog de versterking (Master) voor het T-PMT-kanaal om de weefsel sectie op het scherm te visualiseren, die in grijstinten wordt weergegeven.
   5. Verplaats de positie van de dia met behulp van de joystick om het interessegebied te lokaliseren en focus vervolgens met behulp van de juiste Microscoop-knop.
   6. Klik op stoppen op het tabblad acquisitie om de belichting van de laser uit te schakelen.
3. Definieer de imaging parameters.
   1. Gebruik de selectievakjes op het tabblad kanalen om een van de kanalen te selecteren en klik op Live op het tabblad acquisitie om de afbeelding van dat kanaal op het scherm weer te geven. Pas vervolgens met de linkermuisknop op de muis de schuifbalken aan om het bereik van het uitgezonden fluorescerende signaal dat wordt verzameld in te stellen, het Laser vermogen (schuifbalk onder lasers kop), Gain (Master) en digitale offset in de Op het tabblad kanalen om de met confetti gelabelde cellen op het scherm te visualiseren. Richtlijn waarden voor al deze parameters zijn beschikbaar in het aanvullende bestand 1B-D voor RFP, yfp en CFP. Voltooi deze stap voor elk kanaal, één voor één.
      Opmerking: om ervoor te zorgen dat het gevisualiseerde signaal niet autofluorescentie is, kan een gedeelte van een negatief dier van CRE tijdens deze stap worden gebruikt als een negatieve controle. Aangezien T-PMT is gecombineerd met de RFP-Laser (stap 7.2.1) zal het aanpassen van de laser stroom voor RFP het T-PMT-signaal beïnvloeden.
   2. Pas de grootte van de pinhole aan om zo nodig de fluorescentiedetectie te verhogen.
      Opmerking: hoe hoger de pinhole grootte, hoe meer fluorescerende signaal wordt gedetecteerd in de Z-richting. Een richtsnoer hiervoor is de resulterende luchtige eenheid (AU), die automatisch wordt aangegeven onder de pinhole -indicator, waarbij 1 au optimaal is voorbeeld kwaliteit. Het verhogen van de AU te veel zal afbreuk doen aan latere analyse, omdat het moeilijker wordt om afzonderlijke cellen in de Z-richting te onderscheiden).
   3. Controleer de instellingen om ervoor te zorgen dat de opgenomen signalen elkaar niet overlappen.
      1. Klik op de selectievakjes op het tabblad kanalen om alle drie de kanalen te selecteren en druk op de knop magnetisch op het tabblad acquisitie .
      2. Scroll in de resulterende afbeelding tussen de weergegeven kanalen door te klikken op de blauw gemarkeerde vakken boven elk weergegeven kanaal op het tabblad dimensies . Controleer handmatig of de kanalen op het scherm elkaar overlappen. Als de signalen elkaar overlappen (bijvoorbeeld als elke rode cel ook geel is), keert u terug naar het begin van stap 7,3 en herhaalt u de parameters voor de overlappende kanalen totdat ze van elkaar kunnen worden onderscheiden. Zorg ervoor dat voor elk label (dat wil zeggen, RFP, YFP of CFP) ten minste één kloon kan worden gevisualiseerd die slechts één van de labels bevat.
4. Afbeelding ophalen.
   1. Selecteer het tabblad acquisitie modus om de beeldkwaliteit op te geven met de waarden voor frame grootte, snelheiden Middelings nummer .
      Opmerking: de typische instellingen voor deze experimenten worden aangegeven in aanvullend bestand 1a. Als u de Zoom factor onder de kop Scan gebied op het tabblad acquisitie verlaagt, u het gezichtsveld vergroten zonder de tijd te wijzigen die nodig is voor het verzamelen van afbeeldingen.
   2. Klik op het tabblad acquisitie onder de kop dimensionale verwerving op het selectievakje Z-stack . Open het tabblad z-stack om het interval tussen de afbeeldingen in de z-richting in te stellen op 2,5 μm.
   3. Als u de juiste locaties wilt instellen, selecteert u alleen de RFP/T-PMT in het tabblad kanalen en klikt u op Live om de rode klonen met een zichtbare omtrek van het weefsel te visualiseren. Stel het eerste en laatste segment in door op eerst instellen te klikken en laatste in te stellen op het corresponderende segment, waarbij de scherpstelling wordt aangepast met behulp van de Microscoop-knop.
   4. Klik op de tegel scan tabblad op de acquisitie tabblad en voer het totale aantal tegels in de horizontale en verticale richtingen in de respectieve vakken.
   5. Voor het vastleggen van afbeeldingen selecteert u alle gewenste kanalen in het tabblad kanalen en klikt u vervolgens op de knop magnetisch om één afbeelding te verzamelen of de knop experiment starten om een Z-stack/tegel scante verzamelen.
5. Zodra de afbeelding is verkregen, klikt u op bestand en slaat u op als en slaat u de afbeelding op in een bestandstype dat zoveel mogelijk informatie over de Microscoop-instellingen bewaart, zodat u later controleren en hergebruiken.
6. Voer een verdere analyse uit met behulp van Image Analysis software.

Resultaten

Om chondrocyten in het epifyseal kraakbeen te labelen en hun klonale expansie met de leeftijd te visualiseren met behulp van Tamoxifen administratie op P1, Col2CreERT: confetti muizen werden gelabeld, en hun achterpoten werden verzameld op P27. Het centrale deel werd bepaald door de visualisering van het Kruis ligament (Figuur 2a) en de klonen in de proximale tibiale groei plaat werden gevisualiseerd (Figuur 2b). Deze gegevens tonen aan dat individuele cellen die col2-positief waren op P1 en werden gelabeld met confetti fluorescerende eiwitten toen Tamoxifen werd toegediend, onderging klonale expansie, en vervolgens bleef in de groei plaat tot P27. De initiële veranderingen in de klonale expansie van een soortgelijk ontwikkelings tijdpunt zijn te zien in figuur 1 van een recente publicatie¹³.

Om een voorbeeld te geven van het fluorescerende signaal na langdurige opslag (stap 5,5), werd het verzamelde gedeelte onmiddellijk na (Zie Figuur 2A, B) opgeslagen voor meer dan 3 jaar voordat het werd voorbereid en gefotografeerd (figuur 2c, Video 1) .

Om enkele veelvoorkomende problemen met het protocol aan te tonen, wordt een sectie die tijdens de cryosectioning-stap is gebroken, weergegeven in Figuur 3a. De regio van de sectie (tussen de groei plaat en het articulaire kraakbeen) uitgebreid in Figuur 3b toont aan dat deze dosis Tamoxifen leidt tot zo'n hoog niveau van recombinatie op dit gebied dat het de van klonen-analyse uitsluit.

Figuur 1: experimenteel overzicht. Stroomdiagram waarin de belangrijkste fasen van de methode worden samengevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: confetti afbeeldingen van een Col2CreERT: confetti muis. A) monsters van Col2CreERT: confetti muizen werden verwerkt zonder decalcificatie of de lange termijn opslag stap. Het centrale deel was gelegen met behulp van het Kruis ligament als een marker. Deze afbeelding is gevisualiseerd met behulp van een tegel scan na het detecteren van RFP met T-PMT (scale Bar = 300 μm). B) klonale kolommen worden weergegeven in de proximale tibia van de groei plaat die zichtbaar is in (a), na 3D-reconstructie. C) een aangrenzende dia die wordt weergegeven ondera) enB) die gedurende meer dan 3 jaar in lange termijn opslag wordt gehouden, werd verwerkt voorbeeld vorming en 3D-reconstructie. RFP, YFP en CFP worden weergegeven in (B) en (C) (schaalbalken = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: uitdagingen bij het gebruik van de methode. A) de witte stippellijnen beschrijven een splitsing in de sectie door de groei plaat van Col2CreERT: confetti muizen (schaalbalk = 50 μm). Het gebied in het witte vak wordt weergegeven in (B) (schaalbalk = 25 μm). RFP, YFP en CFP worden in beide panelen weergegeven en het niet-gereflecteerde laserlicht (T-PMT)-kanaal wordt ook weergegeven in (a) om het weefsel te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Video 1: driedimensionale reconstructie van een groei plaat van Col2CreERT: confetti Mouse. Een dia bereid uit een Col2CreERT: confetti muis werd vastgehouden in lange termijn opslag na het snijden voor meer dan 3 jaar, en vervolgens verwerkt voor Imaging. Driedimensionale reconstructie werd automatisch uitgevoerd met beeldanalyse software en geëxporteerd als een video. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: typische opstelling van de confocale Microscoop. A) de belangrijkste controles die op het tabblad acquisitie aanwezig zijn.B−D) de laser parameters, de golflengte van de excitatie en het bereik van de opgenomen emissie golflengten worden weergegeven voor drie fluorescerende eiwitten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het confetti model werd veelvuldig gebruikt om de gemineraliseerde kraakbeen weefsels^12,13en¹⁴ te bestuderen en om het geoptimaliseerde protocol te beschrijven. Confetti muizen² met één exemplaar of twee exemplaren van de R26R-confetti allel kunnen worden gebruikt voor de fokkerij en experimenten. Recombinatie in muizen met één allel van de Brainbow 2,1 construct zal geven vier potentiële Labels: rood fluorescerende eiwit (RFP, Cytoplasmic), geel fluorescerende eiwit (YFP, Cytoplasmic), cyaan fluorescerende eiwit (GVB, membraan-gelokaliseerd), en groen fluorescerende proteïne (GFP, Nucleus-gelokaliseerd), terwijl recombinatie in de homozygoot confetti muizen (d.w.z. met twee kopieën van de Brainbow 2,1 construct) 10 mogelijke kleur uitgangen geven (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + GVB, YFP + GFP, GVB + GVB, GVB + GFP, GFP + GFP). Echter, omdat de DNA-excisie en inversie gebeurtenissen op een stochastische manier optreden, recombinatie voor de productie van GFP treedt op in slechts een kleine fractie van cellen, zoals eerder gerapporteerd², en schijnbaar verschilt per cel-type of CRE lijn gebruikt^{2, 12,13}. Daarom zijn zes kleur uitgangen de meest voorkomende bij homozygoot confetti muizen, gezien het lage optreden van recombinatie gebeurtenissen die tot de GFP-uitdrukking leiden.

Een belangrijke overweging bij het plannen van experimenten met de confetti muis is het vinden van een geschikte CRE stam. Ten eerste, omdat de confetti allel verschillende loxP-sites heeft, sluit één recombinatie gebeurtenis een tweede⁴niet uit. Dit betekent dat als een cel wordt gelabeld en verdeelt om een kloon van één kleur te produceren, een tweede recombinatie gebeurtenis in een van de dochtercellen een andere kleur genereert, waardoor de echte van klonen-uitbreiding wordt maskeert. Dus, niet-indugbaar CRE stammen, waar het enzym is altijd actief als de bijbehorende promotor actief is, zijn niet aan te raden. Ten tweede komt in sommige stammen de uitdrukking van CRE of vaak ten koste van een endogeen eiwit, waardoor een fenotype van zichzelf ontstaat (bv. voor de Prg4-GFPCreERT2 klop-in muis stam waarbij muizen twee CRE-allelen¹⁵), een enkel exemplaar van het CRE-allel is dus wenselijk. In alle beschreven experimenten, een enkel exemplaar van de Col2CreERT¹⁶ werd gedragen door ofwel de mannelijke of de vrouwelijke ouder om Col2CreERT te genereren: confetti muizen, zoals beschreven¹³. Vervolgens is de specificiteit van de CRE-lijn naar het celtype van belang een belangrijke overweging. Bijvoorbeeld, Col2CreERT is Chondrocyte-specifieke, maar labels verschillende populaties van chondrocyten in vroege postnatale kraakbeen¹⁷. Ten slotte kan de activiteit van verschillende CRE-stammen aanzienlijk veranderen met de dieren tijd, omdat de endogene activiteit van de organisator wordt gebruikt voor CRE-expressie wijzigingen, zelfs in cellen van hetzelfde type (bijvoorbeeld Prg4-GFPCreERT2, die een toenemende aantal doses Tamoxifen om oppervlakkige zone cellen te labelen als muizen leeftijd¹⁵).

Het aantal gelabelde cellen zal worden weerspiegeld door de hoeveelheid Tamoxifen gegeven, dus het is niet altijd wenselijk om de maximale dosis te geven, omdat het onderscheiden van klonen van elkaar moeilijk kan zijn. Omdat CRE uitdrukking zal variëren onder de regulering van verschillende promotors en met de leeftijd, de Tamoxifen dosering zal moeten worden aangepast aan het optimaliseren van de labeling. Het is belangrijk op te merken dat cellen niet onmiddellijk worden fluorescerend bij het triggeren van recombinatie, omdat de tijd nodig is om de recombinatie te laten plaatsvinden en de resulterende fluorescerende eiwitten voldoende accumuleren voorbeeld vorming. Een breed scala aan uren (tussen 24 − 72 uur) is nodig, die lijkt te worden beïnvloed door de CRE-lijn, het celtype en de dier leeftijd. Aangezien Tamoxifen biologisch actief kan zijn lang na toediening¹⁸ is het altijd raadzaam om de recombinatie-efficiëntie in elk model grondig te controleren.

Tijdens de confocale microscopie stap, excitatie van de confetti fluorescerende eiwitten vereist penetratie van het weefsel door laserlicht. Omdat verschillende weefsels verschillende eigenschappen hebben, laserlicht kan niet doordringen 160 μm dikke delen van alle weefsels. Echter, dergelijke dikke secties kunnen worden gebruikt voor groei plaat kraakbeen, zoals gebruikt in Figuur 2, Figuur 3. Merk op dat elke Microscoop anders is, en het is onwaarschijnlijk dat de beschreven instellingen (aanvullend bestand 1) perfect zullen werken zonder kleine aanpassingen. Een van de grootste uitdagingen is het onderscheiden van de verschillende fluorescerende eiwitten om ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging van het ene kanaal naar het andere is. Bijvoorbeeld, het signaal in de YFP kanaal veroorzaakt door de fluorescentie afkomstig van GFP overlappingen tussen de YFP en RFP kanalen. YFP-en CFP-kanalen moeten ook zorgvuldig worden gecontroleerd. Dit kan op verschillende manieren gebeuren. Ten eerste kan het emissie bereik van tl-licht golflengten die voor elk fluorescerende eiwit worden opgenomen, worden verkleind. Ten tweede kan het aanpassen van het Laser vermogen in combinatie met de digitale versterking het signaal optimaliseren. In deze studie waren deze stappen voldoende, maar ze vertrouwen op een sterk fluorescerende signaal. Dit betekent dat in theorie, inefficiënte weefsel verwerking de activiteit van de fluorescerende eiwitten kan verminderen, of een zwakke laserlichtbron kan de scheiding van het kanaal belemmeren.

Een van de voordelen van de confetti muis is dat het kan worden gecombineerd met een groot aantal genetisch gemuteerde stammen die beschikbaar zijn, zodat de impact van specifieke genen op de klonale dynamiek kan worden bestudeerd^{10,11,12 ,13,14,19,20}, zij het met enkele beperkingen. Bijvoorbeeld, recombinatie van de confetti allelen en het gen van belang kan niet worden gescheiden bij het gebruik van CRE loxp-gebaseerde mutanten gecombineerd met van klonen Lineage tracing. Niettemin, dergelijke samenvalt recombinatie gebeurtenissen kunnen effectief zijn^10,14,20. Deze mogelijkheid werd bijvoorbeeld gebruikt om het toegenomen aantal cellen in de rustzone van muizen te onderzoeken na de postnatale Chondrocyte-specifieke ablatie van TSC1 in de groei plaat²¹ en onthulde de klonale relatie tussen deze cel na verloop van tijd ¹³. Daarnaast kan de Weefselspecifieke klonale analyse met confetti muizen worden gebruikt met niet-CRE loxp-gebaseerde Mutante muizen¹¹, en het is ook mogelijk om deze benaderingen te combineren met farmacologische^{8,9 ,13} en/of chirurgische modellen⁸ om klonale reacties op andere functionele verstoringen te visualiseren. Verdere kansen ontstaan bij het combineren van confetti gelabelde secties met immunodetectie van endogene eiwitten door immunofluorescentie. Een dergelijke analyse maakt de identificatie mogelijk van getraceerde cellen en hun colokalisatie met een bekende marker. Met de hierin beschreven fixatie methode is het mogelijk immunofluorescentie uit te voeren en de fluorescentie van de confetti fluorescerende eiwitten^12,13nog steeds te visualiseren. In de genoemde documenten was geen antigeen-opvraging echter niet vereist. Harde antigeen retrieval methoden, zoals koken in citraat buffer, leidt tot een volledig verlies van confetti fluorescentie. Hoewel de confetti fluorescerende eiwitten vervolgens kunnen worden gedetecteerd met behulp van antilichamen²², kan een verlies van klonale identiteit optreden.

Samengevat is het gebruik van het confetti model om cellen in vivo te labelen een informatief hulpmiddel om het lot van die cellen in de loop van de tijd te analyseren. De beschreven methode biedt een snelle en efficiënte manier om de fluorescerende eiwit expressie in gemineraliseerde weefsels direct te visualiseren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,2-thiodiethanol	Sigma	MKCF9328
60 mm-lange dekglasjes	Mendel-Gläzer	220588
Confocal laser scanning microscoop	Zeiss	LSM 710
Corn olie	Sigma	C8267
Cryomold (standaard)	Sakura	4557
Cryostat	Thermo	Model: NX70
Wegwerp cryostaatmesjes	Histolab	207500014	Specifiek voor gebruik met hard weefsel
EDTA	Scharlan	AC0960005P
Formaldehyde concentraat	Merck	8.18708.1000
Glazen flessen	Sigma	V7130	Kan worden gebruikt voor tamoxifen verdunning en voor weefsel fixatie en verwerking
Imaris software	Oxford Instruments	N/A	Beeldanalysesoftware voor 3D reconstructie
Isofluraan	Zoetis	11-8162
OCT	Sakura	102094-104
Pasteur pipet	Sarstedt	86.1171
PBS	Gibco	14200075
Natriumhydroxide	Merck	1.06498.1000
Sucrose	Sigma	S0389
Superfrost UltraPlus slides	Mendel-Gläzer	J3800AMNZ
Tamoxifen	Sigma	T5648
Zen2 software	Zeiss	N/A	Freeware voor confocale laser scanning microscopie