Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

10.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60440

⸱

12 november 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.

Samenvatting

Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) vertonen opmerkelijke weerstand tegen degeneratieve motorische neuron ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) in vergelijking met spinale motorneuronen (Smn's). De mogelijkheid om de primaire muis CN3s, CN4s en Smn's te isoleren en te cultuur zou een aanpak bieden voor het bestuderen van mechanismen die aan deze selectieve kwetsbaarheid ten grondslag liggen. Tot op heden maken de meeste protocollen gebruik van heterogene celculturen, wat de interpretatie van experimentele uitkomsten kan Verdoe- Om de problemen in verband met gemengde celpopulaties te minimaliseren, zijn zuivere culturen onmisbaar. Hier beschrijft het eerste protocol gedetailleerd hoe efficiënt CN3s/CN4s naast SMNs-tegenhangers uit dezelfde embryo's te zuiveren en te cultiveren met behulp van embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muis embryo's. Het protocol bevat details over de weefsel dissectie en dissociatie, FACS-gebaseerde celisolatie, en in vitro teelt van cellen uit CN3/CN4 en SMN kernen. Dit protocol voegt een roman in vitro CN3/CN4 cultuur systeem toe aan bestaande protocollen en biedt tegelijkertijd een zuivere soort en leeftijdsgebonden SMN-cultuur ter vergelijking. Analyses gericht op de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van motorneuronen zijn haalbaar in dit cultuur systeem. Dit protocol zal onderzoek mogelijk maken naar de mechanismen die de ontwikkeling van motorische neuron, selectieve kwetsbaarheid en ziekte bepalen.

Inleiding

De cultuur van primaire motorneuronen is een krachtig hulpmiddel dat de studie van neuronale ontwikkeling, functie, en gevoeligheid voor exogene stressoren mogelijk maakt. Motorische neuron culturen zijn vooral nuttig voor de studie van neurodegeneratieve ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (als)1,2, waarvande ziekte mechanismen zijn niet volledig begrepen. Belangwekkend, ondanks de significante celdood van wervelkolom motorneuronen (smn's) in zowel als patiënten en als model muizen, celdood in Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) zijn relatief schaars1,3,4,5,6,7,8,9. Daarom kunnen vergelijkende analyses van zuivere culturen van CN3s/CN4s en Smn's belangrijke aanwijzingen geven over mechanismen die onderliggende relatieve kwetsbaarheid vormen. Helaas is een belangrijke barrière voor dergelijke analyses het onvermogen om gezuiverde culturen van deze motorneuronen te kweken.

Veel protocollen zijn beschreven voor de zuivering van Smn's uit diermodellen. De meeste van deze protocollen maken gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren10,11,12 en/of P75NTR-antilichaam-gebaseerde cel-Sorteer pannen technieken13,14,15,16. Met dichtheidsgradiënt centrifugeren wordt de grotere grootte van Smn's ten opzichte van andere spinale cellen benut, terwijl P75NTR een extracellulair eiwit is dat uitsluitend door smn's in het ruggenmerg wordt uitgedrukt. Bijna 100% zuivere SMN-culturen zijn gegenereerd door een of beide van deze protocollen11,12,14. Deze protocollen zijn echter niet gelukt bij het genereren van CN3/CN4-culturen omdat CN3s/CN4s geen P75NTRExpress en andere specifieke CN3/CN4-markeringen niet zijn geïdentificeerd. Ze zijn ook kleiner dan de Smn's en daarom moeilijker te isoleren op basis van grootte. Integendeel, in vitro studies van CN3s of CN4s hebben zich gebaseerd op dissociatie van17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, en slice27,28 culturen, die zijn samengesteld uit heterogene celtypen, en er bestaan geen protocollen voor de isolatie en cultuur van primaire CN3s of CN4s.

Hier wordt een protocol beschreven voor de visualisatie, isolatie, zuivering en teelt van CN3s, CN4s en Smn's van dezelfde embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muizen29 (Figuur 1, Figuur 2a). ISLMN: GFP heeft specifiek betrekking op motorneuronen met een door farnesylated GFP die naar het celmembraan lokaliseert. Dit protocol maakt het mogelijk om soorten en leeftijdgebonden vergelijkingen van meerdere soorten motorische neuronen te verhelderen om pathologische mechanismen in de motorische neuron ziekte uit te leggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met behulp van proefdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en met de goedkeuring van het Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Boston Children's Hospital.

1. getimede Matings instellen voorafgaand aan de dissectie

  1. Voor het genereren van prenatale embryonale muizen voor de oogst van de motorische neuron, weeg elke vrouwelijke muis en instellen getimede paring tussen volwassen ISLMN: GFP transgene muizen 11,5 dagen vóór de dag van neuron isolatie. Met het oog op de ontwikkeling van dit protocol, 129S1/C57BL/6J ISLMN: GFP muizen, leeftijd 2 − 9 maanden, werden gebruikt en getimede paring werd ingesteld in de avond.
  2. Onderzoeken van vrouwelijke muizen voor vaginale stekkers de volgende ochtend. Houd rekening met de datum waarop de stekker is geïdentificeerd als embryonale dag (E) 0,5.
  3. Weeg vrouwelijke muizen en onderzoeken voor pups met behulp van echografie (Zie tabel van de materialen) tussen e 8.5 − 11. Controleer de tekenen van succesvolle paring.
    1. Bevestig de succesvolle paring door gewichtstoename bij vrouwelijke muizen te detecteren (meestal > 1.5 g op E 9.5 als er meer dan 5 − 6 embryo's zijn).
    2. De embryo's onder ECHO visueel te bevestigen. Embryo's zijn na E 9.5 gemakkelijk detecteerbaar door echografie. Ultrasounds worden alleen uitgevoerd op vrouwtjes die gewicht hebben opgedaan omdat ze vaker zwanger zijn dan degenen die dat niet doen.
      Opmerking: Vrouwelijke muizen kunnen gewicht krijgen om andere redenen dan zwangerschap, dus gewichtstoename alleen is geen betrouwbare indicator van de zwangerschap. Echografie voorkomt onnodige opoffering van vrouwtjes die niet zwanger zijn, maar is niet cruciaal indien niet beschikbaar.

2. dissectie voorwaarden en voorbereiding van instrumenten

  1. Voer alle coatings uit (behalve zuurreiniging van dekstroken), media voorbereiding, weefsel dissociatie (behalve centrifugeren en incubatie) en cultuur werk in een laminaire stroom afzuigkap om de steriliteit van de media en embryonale motorneuronen te waarborgen.
  2. Met zorgvuldige aandacht voor steriele techniek, het uitvoeren van weefsel dissectie buiten een laminaire stroom kap met minimaal risico van besmetting.
  3. Steriliseer een dissectie plaat, een paar microdissecting schaar, een paar duim dressing Tang, twee paren van Dumont #5 pincet, een microdissecting mes, en een Moria mini geperforeerde lepel door onderdompelen in 70% ethanol vóór gebruik.

3. PDL/laminin coating van gerechten/Dekstroken

Opmerking: Cultuur gezien primaire motorneuronen in 96 goed of 24 goed platen, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is voor de toepassing. Cellen kunnen direct in de weefselcultuur plaat worden afgebeeld zonder het gebruik van dekstroken als de putten optisch transparant zijn en de diktes compatibel zijn met beeldvorming.

  1. Voor toepassingen waarvoor dekstroken nodig zijn, moet u ten minste 2 dagen vóór de neuron-isolatie, zuur schoongemaakt, gesteriliseerd en Luchtgedroogde dekstroken bereiden zoals eerder beschreven30. Batches van dekstroken kunnen op deze manier goed worden voorbereid op voorhand van experimenten en kunnen worden opgeslagen tot 6 maanden zonder impact op de experimentele kwaliteit.
  2. Bereid een werkoplossing van 20 μg/mL poly D-Lysine (PDL) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 2 dagen voorafgaand aan de neuron isolatie.
    1. Aliquot PDL (1 mg/mL) van tevoren en bij-20 °C opslaan als een stamoplossing.
  3. Bedek het oppervlak van elke afdekplaat of de put van het weefselkweek plaatje met voldoende werkoplossing van de PDL-oplossing (bijv. 100 μL per put op 96 put-platen of 500 μL per put op 24-put platen met of zonder dekstroken). Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
  4. De volgende dag was 3x met gesteriliseerd water.
    1. Sluit de platen af met paraffine folie en bewaar de gewassen PDL-gecoate platen bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand als ze na de laatste wasbeurt volledig zijn gedroogd.
  5. Bereid een werkoplossing met 10 μL laminine (1,1 − 1,2 mg/mL) in 1,2 mL PBS.
    1. Aliquot laminine aandelen (1,1 − 1,2 mg/mL) van tevoren en bewaren bij-80 °C.
  6. Bedek het oppervlak van elke afdek of goed met voldoende laminine oplossing om het oppervlak gelijkmatig te bedekken. Inincuberen gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C vóór gebruik.
    Opmerking: PDL/laminine-gecoate platen en dekstroken kunnen tot 1 week worden bewaard bij 37 °C, maar vers gecoate laminine heeft de voorkeur. Verwijder laminine direct voor het beplating30. Laminin mag niet uitdrogen. Indien de platen langer dan enkele uren bewaard moeten worden, dienen ze verpakt te worden in paraffine folie.

4. bereiding van dissectie, motor neuron cultuur media en dissociatie oplossingen

Opmerking: De concentraties tussen haakjes duiden op de uiteindelijke concentraties van elk reagens.

  1. Bereid het dissectie medium voor.
    1. Ontdooi het met hitte geïnactiveerde paarden serum 's nachts bij 4 °C, bereid 1 mL aliquots voor en bewaar bij-20 °C. De aliquots bij RT direct voor gebruik ontdooien.
    2. Bewaar B27-supplement (50x) in 1 mL aliquots bij-20 °C. Aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien. Vermijd invriezen/ontdooien.
    3. Bewaar glutamine supplement (100x) bij 4 °C of-20 °C. Verdeel in 0,5 mL aliquots bij-20 °C.
    4. Bewaar penicillaire-streptomycine (10.000 U/mL) in 1 mL aliquots bij-20 °C. Aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien.
    5. Om het dissectie medium te maken, meng u 9,4 mL slaapstand E met 200 μL paarden serum (2%), 200 μL 50x B27 supplement (1x), 100 μL 100x glutamine supplement (1x) (bijv. GlutaMAX) en 100 μL van 10.000 U/mL penicillaire-streptomycine (100 U/mL). Gebruik dit medium voor het verzamelen van ontleed weefsels en het maken van de uiteindelijke suspensie van gezien cellen.
    6. Voeg de dag vóór de neuron-isolatie 500 μL van het dissectie medium toe aan individuele 1,7 mL micro centrifugebuizen voor de weefsel verzameling. Bereid één buis voor elk weefseltype dat wordt verzameld (bijv. positieve controle, negatieve controle, CN3/CN4, SMN) en bewaar bij 4 °C voorafgaand aan het gebruik.
    7. Combineer 49 mL slaapstand E lage fluorescentie media met 1 mL B27 supplement (1x) en vul een 24 goed plaat met dit medium (2 mL/goed) de dag vóór de neuron isolatie. Gebruik dit gerecht voor het verzamelen van muis embryo's. Bewaren bij 4 °C vóór gebruik.
  2. Bereid de motor neuron kweekmedium.
    1. Bereid 250 μL aliquots van 25 mM 2-mercaptoethanol uit in Leibovita's L15 medium. Bewaren bij-20 °C.
    2. Genereer 5 μL aliquots van 100 μg/mL oplossingen van BDNF, CNTF en GDNF, verdund in gesteriliseerd water. Bewaren bij-80 °C en aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien.
    3. Bereid 10 mM Forskolin oplossing door toevoeging van 64 μL Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) aan 5 mg (1,0670 μM) van Forskolin en Vortex goed volledig op te lossen. Voeg vervolgens gesteriliseerd water (1,003 mL) toe aan de DMSO-oplossing en Vortex goed. Bewaar 12 μL aliquots van 10 mM Forskolin bij-20 °C en dooi aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik.
    4. Bereid 12 μL aliquots van 100 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) verdund in DMSO. Bij-20 °C bewaren en aliquots bij RT onmiddellijk voor gebruik ontdooien.
    5. Om de motorische neuron kweekmedium te maken, meng 9,4 mL neurobasal medium met 200 μL paarden serum (2%), 200 μL 50x B27 supplement (1x), 100 μL 100x glutamine supplement (1x), 100 μL 10.000 e/m: penicillaire-streptomycine (100 U/mL), en 20 μL van 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), bij voorkeur direct voor gebruik. Deze stap kan tot 1 dag vóór neuron isolatie worden uitgevoerd.
    6. Voeg vlak voor het gebruik 1 μL van 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) en GDNF (10 ng/mL) en 10 μL 10 mM Forskolin (10 μM) en 10 μL 100 mM IBMX (100 μM) toe aan het kweekmedium van de motor neuron. Prewarm het medium tot 37 °C.
  3. Bereid de dissociatie oplossingen voor.
    1. Bereid de papaïne oplossing (20 e/mL papaïne en 0,005% DNase) en een albumine-ovomucoïde remmer oplossing (1 mg/mL ovomucoïde remmer, 1mg/mL albumine, en 0,005% DNase) volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Bereid 500 μL aliquots van elk van de ovomucoïde remmer en papaïne-oplossingen en bewaar bij-80 °c. Aliquots op 37 °C ontdooien onmiddellijk voor gebruik.

5. ventrale tussen hersenen en ruggenmerg dissectie

Opmerking: Voer alle volgende stappen uit behalve de stappen 5.1.1 − 5.1.3 en 5.1.5 − 5.1.6 onder een stereomicroscoop met fluorescentie-dissectie. De totale dissectie tijd per experiment is doorgaans 3 − 5 uur, afhankelijk van de vaardigheid bij de dissectie techniek en het aantal motorneuronen dat voor elk experiment is vereist.

  1. Ventrale veroorzaakt dissectie
    1. Euthanize een zwangere muis ongeveer 11,5 dagen na de bevruchting door koolzuurgas en cervicale dislocatie.
    2. Spuit de buik grondig met ethanol en verwijder de baarmoeder met behulp van steriele microdissecting schaar en duim dressing Tang. Was de baarmoeder kort in steriele PBS en breng vervolgens over naar de dissectie plaat gevuld met voorgekoelde steriele PBS.
    3. Verwijder de ISLMN: GFP-positieve embryo's zorgvuldig uit de baarmoeder met behulp van steriele microdissecting schaar, duim dressing pincet, en Dumont #5 pincet in IJSKOUDE steriele PBS onder het heldere licht van de Microscoop. Gebruik een steriele Moria mini-geperforeerde lepel, breng elk embryo over naar een aparte put van een 24-put gevuld met voorgekoelde slaapstand-E laag fluorescentie medium aangevuld met 1x B27. Houd de 24 goed plaat op ijs.
    4. Breng een embryo over in een steriele dissectie plaat en bedek het geheel met de gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van de ijskoude steriele Hank.
    5. Zorg ervoor dat de dissectie stappen worden uitgevoerd onder fluoresceïne isothiocyanaten (FITC) verlichting van de Microscoop. Met behulp van een pincet, verwijder de staart en het gezicht van het embryo zonder beschadiging van de veroorzaakt (Figuur 2BA). Plaats het embryo dat gevoelig is met ledematen onder en staart die naar de voorkant van de Microscoop wijst, naar de Dissector (aangeduid met een sterretje, Figuur 2BB).
    6. Met behulp van pincet, spleet open het dak van de vierde ventrikel om een kleine opening te genereren. Gebruik deze opening om pincet te haken in de ruimte die is gecreëerd tussen de vierde ventrikel en het dak. Ontleden langs het rugoppervlak van het embryo rostrale migratoire naar de cortex en de laterale naar de vloerplaat en de motor kolom (Figuur 2CA, b). Open het ontleed weefsel op een open-boek manier om de GFP-positieve CN3 en CN4 kernen te onthullen.
      Opmerking: Een klein stukje weefsel van de ventrale veroorzaakt met Mesenchyme, CN3, en CN4 zal nu worden blootgesteld.
    7. Scheid de ventrale veroorzaakt voorzichtig van het embryo en verwijder het Meningeale weefsel met behulp van een pincet en een microdissecting mes. Ontleden de bilaterale GFP-positieve CN3 en CN4 kernen van de vloerplaat en andere GFP-negatieve omringende weefsels met behulp van een pincet en een microdissecting mes (Figuur 2D). Maximaliseer het aantal GFP-positieve motorneuronen in het bekrachtigd weefsel, maar vermijd het aanraken of beschadigen ervan.
    8. Als een verzameling van afzonderlijke CN3 en CN4 kernen gewenst is, snijdt u langs de middenlijn van deze twee kernen (gele stippellijn in Figuur 2D). Verzamel met behulp van een P1000-pipet het ontleed ventrale-midhersen weefsel met minimale HBSS en plaats het in een gelabelde micro centrifugebuis van 1,7 mL, gevuld met een dissectie medium (zie stap 4.1.5). Bewaar op ijs tot dissociatie.
    9. Blijf ventrale midbrains van extra embryo's in dezelfde buis bundelen tot het totale aantal voldoet aan de experimentele eis (zie stap 8 voor ideale celnummers).
      Opmerking: Een gepoolde verzameling van ten minste 10 ventrale midbrains die ongeveer 1 x 104 CN3/CN4 motorneuronen oplevert, wordt aanbevolen omdat weefsels onderhevig zijn aan stress tijdens de dissociatie en sortering.
  2. Ventrale ruggenmerg dissectie
    1. Houd het embryo gevoelig met het hoofd naar de voorkant van de Microscoop, naar de Dissector. Houd het embryo vast met één paar pincet en steek de punt van het andere paar pincet in het ongeopende caudale deel van de vierde ventrikel.
    2. Open de rest van de achterhersenen en het ruggenmerg dorsaal over de hele rostrocaudale omvang van het embryo. Open door het snijden van dorsale weefsel, beginnend vanaf de vierde ventrikel en werken naar het centrale kanaal van het caudale ruggenmerg met behulp van de Tang als schaar (Figuur 2CA, b). Wees voorzichtig om te voorkomen dat u het ventrale ruggenmerg aanraakt of beschadigt tijdens deze procedure.
    3. Houd het embryo vast met één pincet en knijp de flap van het rugweefsel aan elke kant af met het andere paar pincet (Figuur 2EA, b).
      Opmerking: Excised dorsale weefsels bevatten dorsale huid, Mesenchyme, rugwortel ganglia (Drg's), dorsale hindbrain en ruggenmerg. Verwijder zoveel mogelijk van deze weefsels zonder de SMN-kernen te beschadigen, omdat ze lijm zijn en Smn's kunnen overlappen tijdens het filteren of verstopping veroorzaken tijdens het sorteren van FACS.
    4. Verwijder het ventrale ruggenmerg met behulp van het microdissection-mes om direct onder de GFP-positieve SMN te boren. Til het ventrale ruggenmerg met zaag achtige bewegingen aan beide zijden (Figuur 2FA, b). Snijd het zwevende ventrale ruggenmerg dwars direct boven C1, waar de eerste GFP-positieve anterieure hoorn projecten (Figuur 2G). Ook, dwars doorsneden op de bovenste grens van de onderste ledemaat (Figuur 2G). Verwijder het cervicale (C1)-lumbale (L2-L3) gedeelte van het ventrale ruggenmerg na deze procedure.
    5. Plaats het ventrale ruggenmerg van de rugzijde omhoog en houd het vast door het GFP-negatieve weefsel tussen de GFP-positieve SMN-kolommen te drukken met één paar pincet. Verwijder de overgebleven bijgevoegde Mesenchyme, Drg's en rugruggen merg door beide zijden van de GFP-positieve SMN-kolom te trimmen met het microdissection-mes (Figuur 2H). Zorg voor maximale GFP-positieve motorneuronen zonder ze te beschadigen.
    6. Gebruik een P1000 pipet en verzamel het ontleed ventrale ruggenmerg weefsel met minimale HBSS en plaats in de SMN-gelabelde 1,7 mL micro centrifugebuis gevuld met dissectie medium. Bewaar op ijs tot dissociatie. Blijf de ventrale ruggengraat van andere embryo's in dezelfde buis bundelen tot het totale aantal aan de experimentele eisen voldoet.
      Opmerking: Het is raadzaam om ten minste drie ventrale ruggenmerg koorden te verzamelen die ongeveer 2,1 x 104 SMN opleveren, omdat weefsels onderhevig zijn aan stress tijdens dissociatie en sortering.
    7. Verzamel gezichts motorneuronen en extremiteiten van de ISLMN: GFP muis embryo's als GFP-positieve en GFP-negatieve controles voor respectievelijk fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Extremiteiten zijn GFP-negatief omdat de GFP-positieve axonen van de Smn's nog niet zijn uitgebreid tot de extremiteiten op deze embryonale leeftijd.

6. weefsel dissociatie

Opmerking: Totale dissociatie tijd is meestal 1,5 h per experiment.

  1. Warme papaïne en albumine-ovomucoïde remmer oplossing aliquots tot 37 °C 30 min voorafgaand aan dissociatie.
  2. Draai kort microdissected weefsels met een lage snelheid.
  3. Gebruik een P100 pipet en verwijder voorzichtig zo veel mogelijk slaapstand E zonder aspirerende weefsels.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u alle resterende slaapstand E na deze stap te verwijderen om te voorkomen dat het verminderen van de werkzaamheid van papaïne dissociatie in de volgende stap.
  4. Voeg het juiste volume papaïne-oplossing (tabel 1) toe aan elk van de microcentrifugebuisjes van 1,7 ml die de microdissected-weefselmonsters bevatten.
    Opmerking: De juiste hoeveelheid papaïne voor de dissociatie werd bepaald om de effectieve dissociatie te maximaliseren terwijl het minimaliseren van stress op de cellen.
  5. Voorzichtig wrijf 8x met een P200 pipet. Voer alle trituratie stappen zachtjes uit om de levensvatbaarheid van de motor neuron te behouden.
  6. Inbroed de buisjes met de weefsels gedurende 30 minuten bij 37 °c, met een vinger die 10x elke 10 min. zachtjes wrijf elke suspensie 8x met een P200 pipet na incubatie. Draai de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten.
  7. Om de werkzaamheid van ovomucoïde remming in de volgende stap te waarborgen, gebruikt u een P1000 pipet om zo veel mogelijk supernatant te verwijderen en weg te gooien zonder de weefsels te aspireren.
  8. Respendeer pellets in de juiste hoeveelheid albumine-ovomucoïde remmer oplossing (tabel 1) door zachtjes te tritureren 8x met een P200 pipet.
  9. Wacht 2 min om alle overgebleven stukjes van niet-dissociated weefsel te laten vestigen op de bodem van de buis.
  10. Verzamel zo veel mogelijk supernatant zonder ongedissocieerde weefsels te gebruiken met een P200 pipet. Breng de supernatant over naar verse 1,7 mL micro centrifugebuizen.
  11. Als sommige stukjes weefsel na stap 6,10 zonder dissociatie blijven, herhaalt u de stappen 6.8 − 6.10 voor de niet-gezien weefsels die in de originele micro centrifugebuizen van 1,7 ml achterblijven om de uiteindelijke opbrengst van gedisiteerde cellen te maximaliseren, terwijl de stress op de cellen wordt geminimaliseerd eerder in de supernatant van stap 6,10.
  12. Draai de cellen op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg met een P1000 pipet.
  13. Rebreng de pellet in de juiste hoeveelheid dissectie medium (tabel 1) door het pipetteren van 8x met een P1000 pipet. Het juiste volume van de uiteindelijke suspensie werd bepaald zodat de celdichtheid niet hoger is dan 107 cellen/ml, die de stroom van de flow cytometrie machine kunnen blokkeren, maar ook zodat cellen niet overmatig worden verdund, wat resulteert in een vertraagde sorteersnelheid.
  14. Filtreer de suspensies door middel van 70 μm celstrainers om grote klonten of onverteerd weefsel te elimineren. Breng de suspensies in 5 mL ronde bodem polystyreen reageerbuisjes en bewaar op ijs totdat het nodig is.

7. fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van een FACS sorteerder uitgerust met een 15 MW 405 nm violet laser, een 100 MW 488 nm blauwe laser, een 75 MW 594 nm oranje laser, en een 40 MW 640 nm rode laser. Cellen werden gesorteerd als mantel vloeistof in steriele PBS onder aseptische condities door middel van een 100 μm nozzle. Om de celbelasting te minimaliseren, werd de stroomsnelheid ingesteld op een steekproef druk van 1 − 3, zodat er maximaal 1000 − 4000 gebeurtenissen per seconde werden verworven. De totale FACS-tijd is meestal 1 − 2 uur per experiment.

  1. Stel spanningen voor forward en side Scatter in, zodat de celpopulatie correct kan worden gevisualiseerd. Het instellen van de juiste spanningen voor het sorteren van cellen is complex en vereist een ervaren FACS operator.
  2. Om verschillende celpopulaties te onderscheiden, plot cellen op basis van grootte zoals bepaald door het voorwaartse spreidings gebied (FSC-A) versus interne complexiteit, zoals bepaald door het Zijspreidings gebied (SSC-A). Teken een hek rond de levende cellen zoals aangegeven in Figuur 3AA en figuur ba om puin en dode cellen uit te sluiten. Groepeer de cellen binnen het gated gebied als populatie 1 (P1).
  3. Plot P1-cellen op basis van de Zijspreidings breedte (SSC-W) versus de SSC-A om celklonten en dubbeltjes uit te sluiten. Poort de populatie van enkelvoudige cellen als populatie 2 (P2) (Figuur 3AB en figuur BB).
  4. Plot P2-cellen op basis van de voorwaartse Spreidingsbreedte (FSC-W) versus de FSC-A en poort de populatie van enkelvoudige cellen als populatie 3 (P3) (Figuur 3AC en figuur BC).
    Opmerking: het gebruik van twee opeenvolgende Gates in 7,3 en 7,4 Sluit celklonten en-dubbeltjes (High FSC-W en High FSC-A) uit.
  5. Poort P3-cellen op basis van GFP versus allophycocyanin (APC). Het APC-kanaal detecteert autofluorescentie. Gating op dit kanaal vermijdt het vastleggen van autofluorescerende cellen. Gebruik GFP-negatieve cellen om de spanning voor FITC/GFP-fluorescerende kanalen aan te passen. Ideaal, positie poorten voor deze celpopulaties rond 102. Selecteer Gate drempels voor GFP-positieve populatie 4 (P4) afzonderlijk voor elk type motor neuron (Figuur 3ad en figuur BD).
    Opmerking: Stel de GFP-poort veel hoger in voor Smn's dan voor CN3s/CN4s om een zuivere cultuur te verkrijgen (Figuur 3-advertentie en figuur BD). Een lagere GFP-poort voor SMN-culturen leidt tot besmetting van de culturen door glia en niet-motorische neuronen. Dit is waarschijnlijk omdat er een laag niveau GFP expressie in sommige glia en niet-motorische neuronen als gevolg van een lekkende promotor. Het percentage GFP-positieve cellen in vergelijking met de totale cellen is meestal 0,5 − 1,5% voor CN3s/CN4s en 1,5 − 2,5% voor Smn's. Als de sectie succesvol was, kunnen deze getallen worden gebruikt als benchmark voor het bepalen van de juiste positie voor de GFP-positieve poort (Figuur 3AE en Figure be).
  6. FACS uitvoeren volgens het Protocol van de fabrikant. Verzamel P4-cellen in verse 1,7 mL micro centrifugebuizen gevuld met 500 μL motor neuron kweekmedium. Bewaar op ijs tot het beplating.
    Opmerking: Hoewel de cellen rechtstreeks in de putjes kunnen worden gesorteerd, resulteert dit in een ongelijk aantal cellen per putje. Sorteer de cellen in 1,75 mL micro centrifugebuizen en vervolgens plaat handmatig met het oog op een meer gelijkmatige plating verdeling te bereiken.

8. cultuur van gezuiverde primaire motor neuronen

  1. Verdunde FACS-geïsoleerde CN3/CN4 en SMN suspensies met motor neuron kweekmedium voorverwarmd tot 37 °C tot dichtheden van respectievelijk 5 x 103 en 1 x 104 cellen/ml.
    Opmerking: Eén E 11,5 embryo levert ongeveer 1 x 103 CN3/CN4 en 7 x 103 SMN op. Deze opbrengsten zijn echter sterk afhankelijk van de zuiverheid van ontleed weefsels, de grondigheid van celdissociatie en de juiste drempel van GFP-Gates tijdens FACS.
  2. Overdracht 96 goed platen voorgecoat met PDL en laminine van de 37 °c weefselcultuur incubator naar de laminaire flow Hood en aspiraat laminine van elke put. Gebruik platen en dekstroken onmiddellijk zonder te wassen.
  3. Voeg 200 μL verdunde CN3/CN4 en SMN suspensies toe aan de elk goed van PDL/laminine gecoate 96 well Plates. Uiteindelijke celdichtheden moeten 1 x 103 en 2 x 103 cellen/goed voor respectievelijk CN3/CN4 en SMN zijn.
    Opmerking: Initiële plating dichtheid van Smn's in 96 goed platen (2 x 103 cellen/well) is dubbel dat van CN3s/CN4s (1 x 103 cellen/goed) om soortgelijke eind motor neuron getallen en dichtheden te verkrijgen op 2 en 9 dagen in vitro (DIV) (4 − 6 x 102 en 2 − 4 x 102 cellen per put, respectievelijk).
  4. Cultuur neuronen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  5. Voer neuronen elke 5 dagen door de helft van de oude media (100 μL) te verwijderen en te vervangen door hetzelfde volume van het kweekmedium van de verse motor neuron. Zorg ervoor dat neuronale processen zichtbaar worden op 1 DIV en dikker en langer worden met 14 DIV (Figuur 4). Neuronale cellichamen worden vergroot en hebben de neiging om te aggregeren in lange-termijn culturen, met name voor Smn's (Figuur 4).
    Opmerking: Voer alle medium-en oplossings wijzigingen uit door de helft van het originele medium volume te verlaten om te voorkomen dat gekweekte cellen worden losgekoppeld. Dit omvat fixatie en immunocytochemie (ICC) stappen. Als alle media wordt verwijderd, ongeacht hoe zacht, de meeste van de cellen zal loskoppelen en worden weggewassen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het doel van dit protocol was om zowel de primaire CN3s/CN4s als de KMO op lange termijn te zuiveren en te kweken om vergelijkende analyses mogelijk te maken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan motorische neuron stoornissen (Zie Figuur 1 en Figuur 2 voor overzicht).

Zodra neuronen met succes werden geïsoleerd en gekweekt in cultuur, werden bijna zuivere prim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Historisch gezien, in vitro studies van CN3 en/of CN4 motorneuronen hebben vertrouwd op heterogene culturen zoals gezien17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

We bedanken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, VS) voor instructie in SMN dissectie technieken; het Dana Farber Cancer Institute flow Cytometrie faciliteit, de immunologie divisie flow Cytometry faciliteit van Harvard Medical School, de Joslin Diabetes Center flow Cytometrie kern, Brigham en Women's Hospital flow Cytometrie kern, en Boston Children's Hospital flow Cytometrie onderzoek faciliteit voor FACS isolatie van primaire motorneuronen; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, extra Engle laboratorium leden en project ALS consortium leden voor technische assistentie en doordachte discussie. Deze studie werd ondersteund door project ALS. Daarnaast werd R.F. gefinancierd door de Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant in het buitenland en NIH training Grant in genetica T32 GM007748; J.J. werd gesteund door het NIH/NEI trainingsprogramma in de moleculaire basissen van oogziekten (5T32EY007145-16) via het Schepens Eye Research Institute en door het ontwikkelingsneurologie trainingsprogramma Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) via het Boston Children's Hospital; M. C. W werd gesteund door NEI (5K08EY027850) en Children's Hospital Ophthalmologie Foundation (Faculty Discovery Award); en E.C.E. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow CytometerBD Bioscience-Dit heeft een 4-lasersysteem uitgerust met 405, 488, 594 en 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell StrainersCORNING352350Voor het filteren van de dissociërende cellen vóór FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap CapCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well)Greiner Bio-One International655090We hebben meerdere 96-well platen geprobeerd en deze was de beste voor cultuur en analyses na ICC
Circular Cover Glasses for microscopyKarl Hecht & Assistent1001/14We gebruikten dit dekglas omdat het gebied groot was (diameter: 14 mm).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. Een van de ER-stressoren.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie TipsRoboz Surgical InstrumentRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-305
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E low fluorescenceBrainBitsHELFFluorescentie die de waarneming van de GFP-expressies van embryo's belemmert, moet laag zijn.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutylmethylxanthine
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz’s L15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Micro Dissecting ScissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm bladeRoboz Surgical InstrumentRS-6272
Moria Mini Perforated SpoonFine Science Tools10370-19
Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements softwareNikon-Differentiaal interferentie contrast beelden en immunocytochemie beelden van de celculturen werden vastgelegd met deze apparatuur
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS)Fisher ScientificA202-212Voor het spoelen van deksels
Olympus 1.7 mL Microtubes, ClearGenesee Scientific22-281Dit zijn de buisjes die we beschreven als "1.7 mL microcentrifugebuisjes" in de context.
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorpLK003150Papaine oplossing en alubumin-ovomucoid inhibitor oplossing worden bereid uit dit kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lysin (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Rabbit monoclonal antibody to Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 cameraNikon-Dissectie werd uitgevoerd en beelden van gedissecteerde embryo's en weefsels worden vastgelegd onder deze fluorescentie microscopen.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kitDow Corning1696157We maken dissectie schotels met behulp van dit kit.
TC treated Dishes, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202We maken dissectie schotels met behulp van dit schaal.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip WidthRoboz Surgical InstrumentRS-8100
Transducer for LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSVoor echografie bij vrouwelijke muizen
Veterinary ultrasound machineGE HealthcareLOGOQ e VETVoor echografie bij vrouwelijke muizen
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen SoftwareCarl Zeiss-Confocal beeld van het embryo werd vastgelegd met deze apparatuur

Referenties

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
  3. Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  6. Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
  7. Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
  8. Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
  9. Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
  10. Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
  11. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  12. Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763(2015).
  13. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  14. Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  17. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  18. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  19. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  20. Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
  21. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
  22. Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
  23. Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  24. Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
  25. Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
  26. Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
  27. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  28. Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911(2019).
  29. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
  30. Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
  31. An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423(2019).
  32. Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
  33. Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
  34. Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
  35. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  36. Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  37. Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
  38. Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
  39. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

oculomotore neuronentrochleaire neuronenIsl1 GFP muizencelisolatie via FACSdissectie van weefselprimaire neuronencultuurzuivering van motorneuronenembryonale dag 115GFP positieve cellen
Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.