Methodenartikel

Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties

DOI:

10.3791/60446

⸱

31 mei 2020

 ,  ,  , 
1Department of Marine Biology and Ecology, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Science, University of Miami, 2Department of Biology, University of Miami, 3The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, Faculty of Health Sciences, and Regenerative Medicine and Stem Cell Research Center, Ben Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koralen creëren biodiverse ecosystemen die belangrijk zijn voor zowel mensen als mariene organismen. We begrijpen echter nog steeds niet het volledige potentieel en de functie van veel koraalcellen. Hier presenteren we een protocol ontwikkeld voor de isolatie, etikettering en scheiding van steenachtige koraalcelpopulaties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koraalriffen worden bedreigd als gevolg van antropogene stressoren. De biologische reactie van koraal op deze stressoren kan op cellulair niveau optreden, maar de mechanismen zijn niet goed begrepen. Om de reactie van koraal op stressoren te onderzoeken, hebben we tools nodig voor het analyseren van cellulaire reacties. We hebben met name instrumenten nodig die de toepassing van functionele tests vergemakkelijken om beter te begrijpen hoe celpopulaties reageren op stress. In de huidige studie gebruiken we fluorescentie-geactiveerde celsordening (FACS) om verschillende celpopulaties in steenachtige koralen te isoleren en te scheiden. Dit protocol omvat: (1) de scheiding van koraalweefsels van het skelet, (2) het creëren van een eencellige suspensie, (3) het labelen van de koraalcellen met behulp van verschillende markers voor stroomcytometrie, en (4) gating en celsorling strategieën. Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om te werken aan koralen op cellulair niveau voor analyse, functionele testen, en genexpressie studies van verschillende celpopulaties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koraalriffen zijn een van de belangrijkste ecosystemen op aarde. Ze vergemakkelijken de biodiversiteit door het verstrekken van kritieke habitats voor vissen en ongewervelde dieren en zijn van cruciaal belang voor het behoud van antropogene gemeenschappen door het verstrekken van voedsel en economisch levensonderhoud door middel van toerisme1. Als de belangrijkste bouwer van koraalriffen, het koraal dier (Phylum: Cnidaria) helpt ook kustgemeenschappen door het creëren van grote calcium carbonaat kaders die golf en storm schade te verzachten2.

Koralen als volwassenen zijn sessile dieren die een breed scala van endosymbiotische partners, waaronder virussen, archaea, bacteriën, protisten, schimmels, en vooral, leden van de algen dinoflagellate familie Symbiodiniaceae3host . Veranderingen in het milieu kunnen leiden tot onevenwichtigheden in deze gemeenschap, vaak leidt tot ziekte-uitbraken en koraal bleken waarin de symbiotische Symbiodiniaceae worden verdreven uit de koraalkolonie, waardoor de belangrijkste bron van voeding voor het koraal wordt geëlimineerd. Beide scenario's veroorzaken vaak de dood van de koraalgastheer4,5,6. Effecten van antropogene geïnduceerde stressoren, zoals snelle klimaatverandering, versnellen de massa koraalsterfte, wat leidt tot een wereldwijde achteruitgang van koraalriffen7.

Onlangs zijn er veel verschillende methoden ontwikkeld om het verlies van koraalriffen te helpen beperken. Deze methoden omvattenoutplanting van koralen op bestaande riffen, genetische kruising met behulp van thermisch tolerante genotypen, en cellulaire manipulatie van de microbiële en symbiotische gemeenschappen gehost binnen het koraal8,9. Ondanks deze inspanningen blijft er veel onbekend over koraalceldiversiteit en celfunctie10,11,12,13. Een grondig begrip van koraalceltypediversiteit en celfunctie is noodzakelijk om te begrijpen hoe het koraalorganisme zich gedraagt onder normatieve en stressvolle omstandigheden. Inspanningen om de efficiëntie van herstel en behoud te maximaliseren, zullen profiteren van een beter begrip van de manier waarop celdiversiteit en genfunctie worden gekoppeld.

Eerdere werkzaamheden over celdiversiteit en -functie waren voornamelijk gericht op histologische studies en RNA-bemonstering met volledig weefsel14,15,16,17. Om meer details te verkrijgen over de specifieke celtypefunctie in koralen, moeten er methoden zijn voor de isolatie van specifieke populaties van levende koraalcellen. Dit is met succes gedaan in niet-klassische modelorganismen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorting (FACS) flow cytomemetrietechnologie18. FACS maakt gebruik van een combinatie van lasers afgestemd op verschillende golflengten om verschillende endogene cellulaire eigenschappen te meten op het niveau van één cel, zoals relatieve celgrootte, cel granulariteit en autofluorescentie. Bovendien kunnen de cellen worden gemarkeerd door fluorescerende stoffen om specifieke, gewenste eigenschappen18,19te meten .

Tot nu toe is de toepassing van stromingscytometrie op koraalcellen voornamelijk bedoeld geweest voor de analyse van symbiotische Symbiodiniaceae en andere bacteriële populaties door gebruik te maken van hun sterke, natuurlijke autofluorescentie20,21,22. FACS is ook gebruikt om de grootte van het koraalgenoom te schatten door fluorescerend DNA-markersignaal te gebruiken in vergelijking met referentiemodelorganismecellen23,24. De efficiënte toepassing van FACS biedt drie verschillende instrumenten die nuttig zijn voor celbiologiestudies: 1) morfologische en functionele beschrijving van enkele cellen; 2) identificatie, scheiding en isolatie van specifieke celpopulaties voor downstreamstudies; en 3) de analyse van functionele testen op het niveau van één cel.

De ontwikkeling en toepassing van verschillende exogene fluorescerende markers voor de studie van koraalcellen blijft bijna onontgonnen. Dergelijke markers kunnen bestaan uit gelabelde eiwitten, gelabelde substraten voor enzymen of fluorescerende reacties op andere verbindingen. Deze markeringen kunnen worden gebruikt om celtypen te identificeren die unieke eigenschappen hebben, zoals het markeren van cellen die verschillende hoeveelheden van een specifieke cellulaire compartimentfunctie produceren, zoals lysosomen. Een bijkomend voorbeeld is het gebruik van fluorescerend gelabelde kralen om cellen die bevoegd zijn voor fagocytose of het overspoelen van een gerichte ziekteverwekker25functioneel te identificeren. Populaties van cellen die actief zijn in immuniteitsreacties kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door FACS na het overspoelen van deze exogene toegepaste kralen. Terwijl traditionele histologische methoden bewaard weefsel en vele uren nodig hebben om het percentage cellen positief te benaderen voor bead engulfment, kan een op FACS gebaseerde functionele test voor pathogene engulfment relatief snel worden uitgevoerd op geïsoleerde levende cellen. Naast het bestuderen van celspecifieke reacties op stress, heeft deze technologie het potentieel om genspecifieke expressie te verduidelijken en de evolutionaire en ontwikkelingsgeschiedenis van celtypen te verlichten die volledig uniek zijn voor cnidarians, zoals calicoblasten en cnidocyten.

Onlangs hebben we een intensieve screening uitgevoerd van meer dan 30 cellulaire markers die resulteerden in het identificeren van 24 die in staat zijn om koraalcellen te labelen, waarvan er 16 nuttig zijn voor het onderscheiden van uniekepopulaties 18, waardoor ze clusters van differentiatie (CD) zijn. Hier beschrijven we het proces van koraalcelisolatie in Pocillopora damicornis van het verwijderen van cellen uit het calciumcarbonaatskelet tot de identificatie en isolatie van specifieke celpopulaties met FACS (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dissociatie van weefsels van koraalskelet via airbrush en compressor

LET OP: Voer stappen uit op ijs en bescherm handen met handschoenen.

  1. Monteer de airbrushkit door de luchtcompressor, slang en airbrush aan te sluiten(figuur 2). Stel de drukmeter in op 276−483 kPa.
    LET OP: De aanbevolen compressor en luchtslang die voor dit onderzoek werd gebruikt, was ingesteld op een maximale druk van 393 kPa. Gebruik buiten dit 276-483 kPa-bereik kan leiden tot onvoldoende celverwijdering uit het skelet of breuk van de celmembranen. Dit bereik kan per soort verschillen en kan een levensvatbaarheidstest vereisen. Een levensvatbaarheid test kan worden uitgevoerd met een subset van de cel drijfmest met een eenvoudige hemocytometer en een 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleurstof uitsluiting test, gevisualiseerd op een samengestelde microscoop.
  2. Bereid 100 mL van cel vlekken media in een autoclaved, steriele glascontainer door toevoeging van 33 mL 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zonder calcium en magnesium) aan een eindconcentratie van 3,3x, 2 mL foetaal kalfsserum (FCS; warmte geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 min) tot 2% van het totale volume en 2 mL van 1 M HEPES buffer tot een eindconcentratie van 20 mM. Sluit vervolgens af op 100 mL met steriel water.
    OPMERKING: De 3,3x PBS-concentratie werd gekozen om het zoutgehalte van zeewater na te bootsen, zoals aangetoond in Rosental et al.18. Deze concentratie moet worden aangepast voor soorten die in andere omgevingen worden aangetroffen om hun zoutgehalte na te bootsen.
  3. Breng 10 mL celvlekkende media over op een airbrushfles (gelabeld "F" in figuur 2)en bevestig het adapterdeksel voor de airbrushconnector.
    OPMERKING: Grotere fragmenten en soorten met dikkere weefsellagen kunnen meer media nodig hebben voor een adequate weefselverwijdering.
  4. Voor de vertakkende koraalsoorten die hier worden gedemonstreerd, gebruikt u een botsnijder om een koraalfragment van ongeveer 3−5 cm lang of 4 cm2 in het gebied te knippen of te snijden.
    OPMERKING: Het fragment moet vrij zijn van macroalgen en andere meercellige organismen, omdat deze niet stroomafwaarts uit het monster mogen worden verwijderd en het monster tijdens de FACS-analyse- en sorteerprocessen kunnen besmetten. Een fragment van 1 cm van P. damicornis geeft ongeveer 2−10 x 106 cellen na het filteren, vlekken en wassen.
  5. Plaats het koraalfragment in een plastic opvangzak en gebruik de airbrush om de celkleuringsmedia op het koraal te spuiten(figuur 2). Zet dit proces voort totdat het grootste deel van het skelet is blootgesteld. Haal het resterende skelet uit de opvangzak.

2. Dissociatie van cellen uit koraalweefsel

LET OP: Voer alle stappen op ijs uit en bescherm handen met handschoenen.

  1. Filtreer de celdrijfmest door een nylon celzeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 mL om een enkele celopening te verkrijgen.
    OPMERKING: Verschillende mazen van de celzeef kunnen geschikter zijn voor verschillende soorten. Echter, grotere maten kunnen resulteren in onvoldoende weefsel dissociatie als gevolg van de passage van puin en celklonen.
    1. Voor exemplaren met dikkere slijmlagen, gebruik maken van de gesteriliseerde zuiger van een 1 mL plastic spuit en zachtjes malen tegen het filter te breken klonten en helpen de cellen door de zeef. Spoel de zeef en zuiger met celvlekken in de centrifugebuis.
  2. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 4 °C bij 450 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant en zet de cellen opnieuw op in 1 mL celkleuringsmedia.

3. Celvlekken

LET OP: Voer alle stappen op ijs uit en bescherm handen met handschoenen. Vlekken in dit protocol zijn voor representatiedoeleinden. Alternatieve vlekken vereisen verschillende concentraties en incubatietijden.

  1. Breng 500 μL geresuspendeerde cellen over naar een 5 mL ronde bodembuis en zet apart als controlemonster. Voeg geen vlek toe aan dit aliquot.
  2. Voeg aan de resterende celsuspensie 0,42 μL van 12 mM DAPI-leefstof(Tabel van materialen),1 μL van 5 μM reactieve zuurstofsoorten (ROS) vlek(Tabel van materialen)toe en 0,1 μL van 0,2 μM lyssomnige vlek(Tabel van materialen). Pipette goed te mengen en uitbroeden op ijs voor 30 minuten in het donker om te voorkomen dat fotobleaching.
    OPMERKING: DAPI wordt in dit voorbeeld gebruikt om te werken als een DNA-vlek en levensvatbaarheid kleurstof voor de differentiële gating van dode cellen op de FACS machine. Dit veronderstelt dat DAPI stervende cellen doordringt toe te schrijven aan membraanintegriteit. De ROS-vlek straalt licht uit in het bereik van 520 nm (groen), terwijl de lysosomale markering licht uitzendt op ongeveer 668 nm (rood).
  3. Pellet 500 μL van de gekleurde cellen door centrifugatie bij 4 °C bij 450 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant en zet de pellet opnieuw op in 500 μL celkleuringsmedia. Ga over op een nieuwe 5 mL ronde bodembuis en bewaar op ijs.

4. FACS opstarten

LET OP: De stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer als gevolg van verschillen in de lasers en kanalen. Voor dit protocol werd een cytometer met 405, 488, 535 en 640 nm golflengtelasers gebruikt. Filters in dit protocol zijn bedoeld voor representatiedoeleinden. Alternatieve celvlekken vereisen mogelijk een andere set filters en lasers.

  1. Begin met het maken van een nieuwe projectsjabloon op de sorteerdersoftware en kies het laserpaneel. Voor de vertegenwoordigde combinatie van vlekken en natuurlijke fluorescentie, selecteert u alle vier de lasers (405, 488, 535 en 640 nm).
  2. Selecteer de juiste filters voor elke verwachte kleur die in het experiment wordt weergegeven.
    1. Gebruik een filter met een bandpass (BP) van 450/50 (425-475 nm bereik) zoals een DAPI, Hoeschst of Pacific Blue-filter om de DAPI-emissie en hulp bij de scheiding van levende en dode cellen op te sporen.
    2. Voor de detectie van licht dat door het groene ROS-signaal wordt uitgezonden, gebruikt u een filter met een BP van 530/30 (golflengtebereik van 515-545 nm), zoals een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of groen fluorescerend eiwit (GFP) filter. Dit filter meet de concentratie van ROS in elke cel.
    3. Voeg een extra filter toe met een BP van 670/30 (655−685 nm bereik) zoals een allophycocyanine (APC) filter voor de detectie van de lysosomale vlek emissie.
      OPMERKING: Het APC-kanaal maakt het mogelijk om fagocytische activiteit te meten. Dit kanaal detecteert ook de autofluorescentie gegenereerd door de koraal symbiotische algen uit de familie Symbiodiniaceae. Dit signaal kan worden gescheiden met behulp van een extra kanaal dat een langere golflengte dan de APC-filter heeft, echter.
    4. Neem een filter op met een BP van 780/60 (750-810 nm bereik), zoals de meest gebruikte fycoerythrin, cyaninefilter (APC-Cy7), die de emissie van verrode autofluorescentie van Symbiodiniaceae detecteert en helpt bij de isolatie van aposymbiotische cellen.

5. FACS gating setup

OPMERKING: Stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer en het acquisitieprogramma in combinatie met de cytometer.

  1. Maak op het experimentele projectscherm van de cytometriesoftware een spreidingsplot en selecteer forward scatter (FCS) als de statistiek voor de X-as en zijverstrooiing (SSC) voor de Y-as.
    OPMERKING: FCS correleert met de grootte van de cel en SSC correleert met granulariteit. Dit zal zorgen voor de verwijdering van de meeste puin, zoals de meeste kleiner zal zijn in omvang dan intacte cellen.
  2. Stel de assen in op logaritmische of biexponentiële schalen, omdat celgroottes en granulariteit kunnen variëren met verschillende ordes van grootte(figuur 3A), met name in koralen.

6. FACS-analyse en celisolatie

OPMERKING: Stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer en het gekoppelde acquisitieprogramma.

  1. Plaats het besturingselement (d.w.z. de niet-gekleurde celsubset) in de monsterkamer van de cytometer en start het leesproces. Wanneer de computer gegevens van elke cel of gebeurtenis begint te ontvangen, worden er stippen weergegeven op de spreidingsplot. Om alle puin links in de cytometer kamers van eerdere experimenten duidelijk, laat ongeveer 30 s te passeren voordat u begint met de analyse.
  2. Pas in het strooiperceel de fotomultiplierbuis (PMT) spanning aan om de punten te centreren.
    OPMERKING: De PMT-spanning wordt gebruikt om de signaalsterkte van fotonen die worden gemeten te versterken; als de PMT-spanning te zwak is, worden er minder cellen gelezen en als de PMT-spanning te sterk is, worden cellen gemeten in de buurt van de maximale waarde en zijn verschillende celtypen niet van elkaar te onderscheiden. Een adequate PMT-spanning zorgt ervoor dat onafhankelijk te onderscheiden gebeurtenissen het strooiperceel zullen vullen. Gebeurtenisscheiding is gemakkelijker te visualiseren door logaritmische of biexponentiële schalen te projecteren op FSC- en SSC-spreidingspercelen.
  3. Begin met het opnemen van de gebeurtenissen. Om het voorbeeld te behouden, pauzeert u de gegevensverwerving nadat ongeveer 15.000 gebeurtenissen zijn gelezen. In de meeste gevallen zal dit voldoende zijn om de totale celpopulatiepatronen te visualiseren. Nota meer gebeurtenissen als het analyseren en isoleren van kleine, gespecialiseerde celpopulaties.
  4. Maak op de eerste grafiek van FSC en SSC een selectie of poort van de cellen rond de 102-markering en hoger op de FSC X-as. Alles onder deze drempel is waarschijnlijk cellulaire puin. Teken rechthoekige poorten, dat is een regelmatige optie op flow cytometry software programma's en goed voor duidelijke, duidelijke cel populaties. Voor celpopulaties die een onregelmatigere vorm hebben op de spreidingspercelen, gebruikt u een veelhoekige gatingoptie.
    OPMERKING: Een minimale cutoff van 102 op de voorwaartse spreiding moet selecteren voor de kleinste koraalcellen, maar kan verontreiniging van puin mogelijk maken. Om dit te wijzigen, verhoog de ondergrens van de gating om conservatiever te zijn.
  5. Maak een nieuwe spreidingsplot die het DAPI-filter op de X-as en het APC-Cy7-filter op de Y-as uitdrukt. Selecteer hiervoor de poort voor intacte cellen die in stap 6.4 zijn gemaakt, klik met de rechtermuisknop en selecteer de optie om een nieuwe spreidingsplot te maken. Pas de assen aan op logaritmische of biexponentiële schalen.
    OPMERKING: De stappen die nodig zijn om een nieuw plot te maken, kunnen variëren met verschillende softwareprogramma's.
  6. Verwijder nu het controlemonster uit de cytometerkamer en vervang deze door de gekleurde cellen. Laat 30 s passeren voordat u begint met de analyse en het opnemen van de gegevens. Neem ongeveer 15.000 cellen op voordat ze worden onderbroken.
    OPMERKING: De verschillende populatie(s) aan de hogere kant van de APC-Cy7 schaal zijn die met hoge rode autofluorescentie van Symbiodiniaceae. Er is geen vlek nodig om deze populatieonderbrekingen te visualiseren, en ze kunnen ook worden bekeken op de controlemonsteropname(figuur 3C). Selecteer voor de koraal-only populaties, die lager op de Y-as, voor verdere differentiatie.
  7. Maak een nieuwe spreidingsplot van de aposymbiotische cellen om de ROS-concentraties (FITC-filter) en de cellen positief voor lysosomen (APC-filter) te visualiseren, opnieuw met behulp van logaritmische of biexponentiële schalen.
    OPMERKING: Als er meerdere verschillende celpopulaties zijn die aposymbiotisch zijn, kan elk een andere afbeelding van het gebied(figuur 3C,D)verder worden onderscheiden.
  8. Vergelijk de gekleurde monstergroep met de besturingselement, niet-bevlekte subset door de eerste opname van het besturingselementmonster te gebruiken of de controlegroep opnieuw in te brengen en opnieuw uit te voeren. Bek maak de gebeurtenissen die uniek zijn voor de gekleurde steekproefgroep.

7. FACS sortering en inzameling

OPMERKING: Stappen kunnen variëren afhankelijk van het merk en model van de cytometer en het acquisitieprogramma in combinatie met de cytometer.

  1. Plaats microcentrifugebuizen (met 250-500 μL celkweekmedia of lysisbuffer op basis van het aantal verzamelde cellen en de opslagmethode) in de cytometer-verzamelkamer.
    OPMERKING: De vertegenwoordigde stroomcytometer is in staat om vier verschillende populaties tegelijk te sorteren en de machine kan worden geconfigureerd om een verscheidenheid aan inzamelapparaten te bevatten, waaronder verschillende centrifugebuizen en 96 putplaten.
  2. Zodra de cytometer begint te lezen van het monster en een passende hoeveelheid tijd is verstreken om te spoelen puin, beginnen met het sorteren van de gewenste populaties en overal te verzamelen van 20.000 cellen tot enkele miljoenen.
    1. Pas voor meer dan 500.000 cellen het volume van celkweekmedia of lysisbuffer en het volume van het verzamelapparaat aan.
    2. Voor in vitro studies, bewaar cellen op ijs totdat geplaatst in een incubator of gesteriliseerde omgeving.
    3. Voor moleculaire studies, onmiddellijk beginnen met het DNA / RNA / eiwit isolatie proces of flash bevriezen en op te slaan op -80 °C tot extractie.
  3. Elke keer dat een nieuwe vlek, soort of sorteerder wordt gebruikt, voert u een zuiverheidscontrole uit op de populatie van belang door ten minste 20.000 cellen van belang te sorteren in 500 μL kleuringsmedia, vervolgens de gesorteerde cellen opnieuw te analyseren en te bevestigen dat de cellen worden gelezen binnen de poort die wordt gebruikt om in eerste instantie te sorteren (figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Over het algemeen is dit protocol nuttig omdat het de identificatie en verzameling van levende koraalcelpopulaties vergemakkelijkt die kunnen worden gebruikt voor functionele analyses. De workflow begon met de mechanische scheiding van koraalweefsels van het onderliggende calciumcarbonaatskelet(figuur 1). Dit is een van de belangrijkste eerste stappen, omdat onjuiste techniek resulteert in een hoge celsterfte en kan leiden tot grote hoeveelheden puin. Enzymat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd aangepast van Rosental et al.18 en ontwikkeld voor de identificatie en isolatie van P. damicornis cellen. De methodologie richt zich op het proces van filteren monsters om puin te verwijderen, niet-levensvatbare cellen, en Symbiodiniaceae gehoste cellen door het onderzoek van cel intrinsieke factoren, met inbegrip van relatieve celgrootte, relatieve cel granulariteit, cel autofluorescentie, en de aanwezigheid van intacte cellulaire membranen. Deze technieken kunnen worde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NTK wil de University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering erkennen voor de financiering van dit onderzoek. BR wil Alex en Ann Lauterbach bedanken voor de financiering van het Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Het werk van BR werd ondersteund door Israel Science Foundation (ISF) nummers: 1416/19 en 2841/19, en HFSP Research Grant, RGY0085/2019. We willen Zhanna Kozhekbaeva en Mike Connelly bedanken voor de technische bijstand. We willen ook de Universiteit van Miami, Miller School of Medicine's Flow Cytometry Shared Resource bedanken in het Sylvester Comprehensive Cancer Center voor toegang tot de FACS cytometer en aan Shannon Saigh voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Airbrush Kit & CompressorTCP GlobalABD KIT-H-SETPaasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose
BD FACSAria IIBD644832
Bone CuttersBulk Reef Supply205357Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell StrainerCorning35234040 um; BD Falcon; afzonderlijk verpakt; steriel; nylon
CellRox GreenLife TechnologiesC104442.5 mM in DMSO; Excitatie/Emissie: 485/520 nm
CollectiezakGrainger38UV35Reloc Zippit 6"L x 4"W Standaard Hersluitbare Poly Zak met Zip Seal Sluiting, Helder; 2 mil Dikte
DAPIInvitrogenD130610mg in H2O; Excitatie/Emissie: 358/461 nm
Fetal Calf SerumSigma-AldrichF2442-100MLHeat-inactivated bij 57 °C gedurende 30 minuten
HemacytometerSigma-AldrichZ359629Bright-Line Hemacytometer
HEPES BufferSigma-AldrichH0887
LysoTracker Deep RedLife TechnologiesL124921mM in DMSO; Absorptie/Emissie: 647/668 nm
MicrocentrifugebuizenVWR87003-2941.7 mL
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco70011-044pH 7.4; 10X
RondbodembuizenVWR3520635 mL Polypropyleen Ronde Bodembuis
SpuitBD3096281 mL BD Luer-Lok Spuit steriele, eenmalig gebruik polycarbonaat

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
  2. Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
  3. Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
  4. Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
  5. Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
  6. Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
  7. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
  8. Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
  9. Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
  10. Peters, E. C. Anatomy. Diseases of Coral. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).
  11. Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).
  12. Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
  13. Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992(2011).
  14. Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
  15. Chapman, D. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).
  16. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
  17. Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
  18. Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
  19. Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
  20. Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
  21. Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
  22. Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
  23. Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
  24. Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  25. Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescence Activated Cell SortingCoral Cell IsolationFlow Cytometry AnalysisSingle Cell SuspensionCell Population GatingCoral Tissue SeparationLive Coral CellsFunctional AssaysGene Expression StudiesCell Sorting Strategies

Gerelateerde artikelen