Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Summary

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Abstract

Cyanobacteria zijn een gevarieerde groep prokaryotische fotosynthetische organismen die genetisch gemodificeerd kunnen worden voor de hernieuwbare productie van nuttige industriële grondstoffen. Recente ontwikkelingen in de synthetische biologie hebben geleid tot de ontwikkeling van diverse kloon toolkits zoals cyanogate, een gestandaardiseerd modulair kloon systeem voor het bouwen van plasmide vectoren voor latere transformatie of echtelijke overdracht in cyanobacteriën. Hier schetsen we een gedetailleerde methode voor het assembleren van een zelf-replicerende vector (bijv. met een fluorescerende marker Expression cassette) en echtelijke overdracht van de vector in de cyanobacteriële stammen synechocystis SP. PCC 6803 of synechococcus elongatus utex 2973. Daarnaast beschrijven we hoe u de prestaties van een genetisch deel (bijv. een promotor) karakteriseren met behulp van een plaat lezer of Flowcytometrie.

Introduction

Cyanobacteriën zijn autotrofische bacteriën die kunnen worden gebruikt voor de biosynthese van een breed scala aan natuurlijke en heterologeuze hoge waarde metabolische producten^{1,2,3,4,5, 6}. Er moeten nog verschillende hindernissen worden overwonnen om hun commerciële levensvatbaarheid te vergroten, met name de relatief slechte opbrengsten in vergelijking met heterotrofische bio-platformen (bijv. Escherichia coli en gist)⁷. De recente uit....

Protocol

1. vector assemblage met behulp van de plant MoClo en CyanoGate toolkits

Opmerking: voordat u doorgaat met de vector assemblage, is het sterk aanbevolen dat gebruikers zich vertrouwd maken met de vector niveau structuren van de plant en cyanogate moclo systemen^12,15.

1. Bouw van onderdelen van niveau 0
   Opmerking: onderdelen van niveau 0 kunnen worden gesynthetiseerd als volledige vectoren of als lineaire sequenties voor assemblage met niveau 0 acceptoren (bijv. gblocks, IDT). Als alternatief kunnen sequenties worden versterkt vanuit een bronsjabloon (bijv. een vector of ge....

Results

Om de Golden Gate assembly workflow te demonstreren, werd een Expression cassette geassembleerd in de niveau 1 positie 1 (voorwaartse) acceptor vector (pICH47732) met de volgende niveau 0 onderdelen: de promotor van de C-phycocyanin operon P_cpc560 (PC 0,005), de programmeer volgorde voor eYFP (pC 0.008) en de dubbele Terminator T_Rrnb (PC 0.082)¹². Na de transformatie van de assemblage reactie werden succesvolle assemblages ge.......

Discussion

Golden Gate Assembly heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere vector assemblage methoden, met name in termen van schaalbaarheid^20,21. Niettemin, het opzetten van de Golden Gate systeem in een Lab vergt tijd om een vertrouwdheid met de verschillende onderdelen en acceptor vector bibliotheken en algemene assemblageprocessen te ontwikkelen. Een zorgvuldige planning is vaak nodig voor complexere assemblages of bij het parallel uitvoeren van een groot aan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Thermo Fisher Scientific	R0404	Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt	Sigma-Aldrich	A2383	Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)	Sigma-Aldrich	A1296-500g	Used in 8.3.
Agarose	Bioline	BIO-41026	Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	-	Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	Used in Table 2.
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	Used in Table 2.
Carbenicillin disodium	VWR International	A1491.0005	Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates	Sigma-Aldrich	CLS3527	Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104	DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader	BMG Labtech	-	Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Fisher Scientific	K0503	Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)	BioSpec Products	11079105	Used in 5.2.
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	10021083	Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	10356553	Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11815-024	Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)	MF-Millipore	HAWP02500	Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR	Greiner Bio-One	655096	Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit	New England Biolabs	T1020S	Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1030	DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs	Infors HT	-	Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21108	Used in 7.1.
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)	VWR International	K813	Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0491S	Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N0468S	Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)	Starstedt	72.692.210	Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	VWR International	J61820.06	Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	612U96	Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0011	Used in Table 2.
TissueLyser II	Qiagen	85300	Bead mill. Used in 5.2.