Aanwezig is een gedetailleerd protocol voor het gebruik van zebravis embryo's Tg (vtg1: mCherry) voor de detectie van oestrogene effecten. Het protocol heeft betrekking op de voortplanting van de vis en de behandeling van embryo's, en benadrukt de detectie, documentatie en de evaluatie van fluorescerende signalen veroorzaakt door hormoonontregelende verbindingen (EDC).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Met behulp van Tg (Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryo's om de oestrogene effecten van endocriene verstorende verbindingen te testen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn veel hormoonontregelende verbindingen (EDC) in het milieu, vooral oestrogene stoffen. De opsporing van deze stoffen is moeilijk vanwege hun chemische diversiteit; daarom worden steeds meer effectdetectiemethoden gebruikt, zoals oestrogene effectgevoelige biomonitor/bio-indicatororganismen. Deze biomonitoringorganismen omvatten verschillende vismodellen. Dit protocol heeft betrekking op het gebruik van zebravis Tg(vtg1: mCherry) transgene lijn als biomonitoringorganisme, met inbegrip van de voortplanting van vis en de behandeling van embryo's, met de nadruk op de detectie, documentatie en evaluatie van fluorescerende signalen veroorzaakt door EDC. Het doel van het werk is de demonstratie van het gebruik van de Tg(vtg1: mCherry) transgene lijnembryo's om oestrogene effecten op te sporen. Dit werk documenteert het gebruik van transgene zebravisembryo's Tg(vtg1: mCherry) voor de detectie van oestrogene effecten door het testen van twee oestrogene stoffen, α- en β-zearalenol. Het beschreven protocol is slechts een basis voor het ontwerpen van tests; de testmethode kan worden gevarieerd op basis van de testeindpunten en de monsters. Bovendien kan het worden gecombineerd met andere testmethoden, waardoor het toekomstige gebruik van de transgene lijn wordt vergemakkelijkt.
Inleiding
Er is een aanzienlijk aantal hormoonontregelende verbindingen (EDC) die tot de gevaarlijkste stoffen in ons milieu behoren. Dit zijn voornamelijk oestrogene verbindingen die water uit natuurlijke hulpbronnen vervuilen. De chemische diversiteit van de stoffen die tot de groep behoren, maakt het testen op hun aanwezigheid moeilijk, aangezien verschillende analysemethoden nodig zijn voor de detectie ervan. Op basis van hun chemische structuur is het zeer moeilijk om te bepalen of een stof daadwerkelijk in staat is om op te treden als een oestrogeen. Bovendien zijn deze stoffen nooit in zuivere vorm in het milieu aanwezig, dus de effecten ervan kunnen ook door andere verb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het dierprotocol werd goedgekeurd op grond van de Hongaarse wet op het welzijn van dieren en alle studies werden voltooid voordat de behandelde personen het vrije voederstadium zouden hebben bereikt.
1. Embryooogst en -behandeling
- Houd Tg(vtg1:mCherry) zebravissen op 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, geleidbaarheid tussen 525 ± 50 μS/m, zuurstofgehalte ≥80% verzadiging en 14 h licht en 10 h donkere cyclus.
- Vul de parentanks met systeemwater en zet de vis voor de paring de middag voor het oogsten van eieren.
- Plaats de mannelijke en vrouwelijke vissen in de tank en scheid ze met behulp van een scheidingswand.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het experiment in dit manuscript werden de effecten van twee oestrogene stoffen getest bij vijf concentraties die vijf dagen lang bij bevruchting begonnen op Tg(vtg1:mCherry) zebravisembryo's. We onderzochten of er fluorescerende signalen in de lever van vissen verschenen tegen het einde van de blootstellingstijd vanwege de stoffen en of er verschillen waren in de oestrogeenheid van de twee stoffen. De resultaten werden geëvalueerd op basis van de fluorescerende beelden en geïntegreerde dichtheidswaarden. In .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gebruik van biomonitoren/bio-indicatoren voor oestrogene effecten is verspreid in toxicologische studies. In vivo modellen spelen een uitstekende rol, omdat ze in tegenstelling tot in vitro tests niet alleen informatie geven over de respons van een cel of een receptor, maar ook het onderzoek van complexe processen in het organisme mogelijk maken. Verschillende transgene lijnen voor het bestuderen van oestrogene effecten zijn geproduceerd uit zebravissen, waarvan Tg(vtg1:mCherry) werd gebruikt voor deze studi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het National Research, Development and Innovation Office (NKFIH) van het Nationaal Fonds voor Onderzoek, Ontwikkeling en Innovatie (NKFIA); Subsidieovereenkomst: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 project medegefinancierd door de Europese Unie, en het thematische excellenceprogramma NKFIH-831-10/2019 van de Szent István University, toegekend door het Ministerie van Innovatie en Technologie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Publiek toegankelijk software, te downloaden van: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X gekalibreerd software | Leica Microsystems GmbH. | We gebruikten de software beschreven in de experimenten, maar elke fotografische software voldoet aan de tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscoop, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We gebruikten de apparatuur beschreven in de experimenten, maar elke fluorescerende stereomicroscoop is geschikt voor de tests | |
| Magnesium-sulfaat (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipet | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-schaal | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Kaliumchloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Natriumchloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methaansulfonaat (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
Referenties
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
