Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van geactiveerd bloedplaatjesrijk plasma voor het kweken van menselijke uit vet afgeleide stamcellen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60480

⸱

4 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kansai Medical University, 2Department of Plastic Surgery, Zhejiang Provincial People's Hospital

In dit artikel

Samenvatting

In dit rapport beschrijven we een double-spin-methode voor het bereiden van geactiveerd bloedplaatjesrijk plasma (PRP). Met behulp van autologe trombine werden menselijke vetstamcellen (hASC's) gekweekt. Geactiveerd PRP bleek de proliferatie van hASC's te bevorderen.

Samenvatting

Geactiveerd bloedplaatjesrijk plasma (PRP) bereid uit volbloed via centrifugatie vertoonde een proliferatiestimulerend effect in verschillende soorten gekweekte cellen, wat een mogelijk gebruik in de regeneratieve geneeskunde impliceert. Hier werd een double-spin-methode gebruikt om PRP uit volbloed te bereiden. PRP werd verder geactiveerd door autologe trombine. Het aantal bloedplaatjes werd gemeten in de geactiveerde PRP en het proliferatiestimulerende effect in menselijke vetstamcellen (hASC's) werd onderzocht. Het resulterende aantal bloedplaatjes was 11,5 keer hoger in PRP dan in volbloedplasma. De proliferatie van hASC's werd duidelijk versterkt door incubatie met 1% PRP. De beschreven methode kan worden gebruikt om PRP reproduceerbaar te bereiden met een hoge concentratie bloedplaatjes. PRP dat met deze methode wordt bereid, bevordert duidelijk de proliferatie van hASC's.

Inleiding

Geactiveerd bloedplaatjesrijk plasma (PRP) wordt bereid door centrifugatie van volbloed en blijkt bloedplaatjes te bevatten die ver boven de uitgangswaarde van niveau1 liggen. Autologe RPP wordt veel gebruikt bij chirurgische behandelingen, waaronder wondgenezing2, botbeschadiging3 en esthetische operaties 4,5. Na activering van bloedplaatjes in PRP geven de α-korrels die in bloedplaatjes aanwezig zijn verschillende groeifactoren af, zoals van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), epidermale groeifactor (EGF), insuline-achtige groeifactoren (IGF's), transformerende groeifactor bèta (TGF-β), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en andere 1,6,7. Deze groeifactoren spelen een belangrijke rol bij celproliferatie8, migratie9 en differentiatie9.

Tot op heden hebben verschillende onderzoeken het proliferatiestimulerende effect van PRP in verschillende soorten cellen gerapporteerd 10,11,12,13,14,15,16. Een van deze celtypen zijn menselijke van vet afgeleide stamcellen (hASC's); hASC's komen voor in menselijk vetweefsel en kunnen gemakkelijk in grote aantallen worden verzameld. Het regeneratieve effect van hASC's suggereert verder een potentieel gebruik in klinische toepassingen8. Onze eerdere studies meldden dat geactiveerd PRP, in vergelijking met niet-geactiveerd PRP, een duidelijk proliferatief effect had op hASC's en menselijke dermale fibroblasten (hDF's)8. Daarnaast hebben we gemeld dat PRP de proliferatie van hDF's bevordert via een ERK1/2-signaleringsroute17. Onlangs hebben we ook gemeld dat PRP de proliferatie van hASC's bevordert via de ERK1/2-, JNK- en Akt-signaleringsroutes18. In hASC's speelt PRP een belangrijke rol als supplement dat de proliferatie bevordert. Kennis over het effect van PRP op hASC's zal de ontwikkeling van grootschalige kweekmethoden helpen en verder onderzoek naar het mechanisme van proliferatie in hASC's mogelijk maken.

In dit rapport introduceren en beschrijven we een methode voor het bereiden van PRP uit volbloed met behulp van centrifugatie. Deze methode maakt gebruik van de dubbele spin-methode om gemakkelijk een stabiel monster PRP te bereiden. Om de biologische functie van PRP te beoordelen, hebben we het aantal geconcentreerde bloedplaatjes en de concentratie van verschillende proliferatiefactoren gemeten. We bevestigden ook het groeistimulerende effect door het geprepareerde PRP te gebruiken voor het kweken van hASC's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Ethics Review Board van de Kansai Medical University in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van 1975. Alle exemplaren werden verzameld en gebruikt met geïnformeerde toestemming van de donoren.

1. Voorbereiding

  1. Neem na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming bloed af van gezonde volwassen donoren. Hier werd bloed afgenomen van vier mannelijke bloeddonoren in de leeftijd van 28-38 jaar.
    1. Beveel donoren aan om 6 uur voor bloedafname 500 ml water te drinken.
      OPMERKING: De referentiebereiken voor hemoglobine (Hb), aantal rode bloedcellen (RBC) en bloedplaatjesconcentratie (PL) bij gezonde volwassenen worden beschreven door Vajpayee19. Om geschikt te zijn voor bloeddonatie, moet de bloedanalyse van de donor binnen dit bereik liggen.

2. Bloedafname

  1. Laat de bloeddonoren zitten tijdens de procedure.
  2. Draag handschoenen. Bevestig een tourniquet op de bovenarm van de donor terwijl de donor een vuist maakt.
  3. Zodra een geschikte ader is gevonden, steriliseert u de huid twee keer met 70% alcohol en brengt u de naald in.
  4. Gebruik een spuit van 21 G om bloed af te nemen. Maak de tourniquet niet los tijdens de bloedafname.
    1. Gebruik een bloedafnamebuisje van 8,5 ml om het bloed op te vangen. Observeer de toestand van het bloed in de buis en schakel over op een nieuwe buis zodra de bloedstroom vertraagt.
    2. Verzamel voldoende bloed om de PRP te maken. Verzamel vier buisjes anticoagulair bloed met een totaal volume van 34 ml. Keer de buisjes 10 keer om om het bloed te mengen met het antistollingsmiddel.
    3. Gebruik een bloedafnamebuisje van 10 ml (zie materiaaltabel) zonder antistollingsmiddel om bloed op te vangen voor het maken van de activator (zie stap 4). Verzamel 10 ml niet-antistollingsbloed

3. Double-spin-methode om PRP te maken

  1. Neem 40 μL anticoaguleerd volbloed voor het aantal bloedplaatjes. Gebruik gefilterde pipetpunten om de pipet te beschermen tegen bloedbesmetting.
  2. Centrifugeer het antistollingstollingsmiddel gedurende 7 minuten bij 450 x g en kamertemperatuur. Dit is de eerste draai om gelaagde bloedmonsters te verkrijgen. De bovenste laag is de plasmafractie, de middelste laag is de dunne buffy-boot en de onderste laag bestaat uit rode bloedcellen.
  3. Gebruik een stift om een lijn te maken op 2 mm onder de buffy coat.
  4. Gebruik een spuit van 20 ml met een lange canule om het plasma op te vangen tot aan de 2 mm-markering onder de buffy-laag. Het gele plasma met buffy coat bevat bloedplaatjes, leukocyten en enkele erytrocyten. Verzamel het plasma uit twee buisjes in een serumbloedafnamebuisje. Combineer de inhoud van 4 buisjes in 2 buisjes voor een totaal volume van 16 ml verzameld plasma.
  5. Centrifugeer het plasma met de buffy coat gedurende 5 minuten op 1.600 x g en kamertemperatuur. Dit is de tweede draaibeurt. Het supernatans van de gelaagde bloedmonsters is bloedplaatjesarm plasma (PPP).
  6. Gebruik een spuit van 20 ml met een lange canule om de PPP over te brengen naar een serumbloedafnamebuisje van 50 ml met 1 ml vloeistof als maatbeker. Bloedplaatjes die zich ophoopten in de trombocytenpellet in het resterende plasma van 1 ml werden gebruikt als PRP. Het totale volume van het verzamelde PRP was 2 ml.
  7. Vortex de PRP in elke buis en verzamel vervolgens in één buis (totaal 2 ml).
  8. Neem 400 μL van de PRP voor het aantal bloedplaatjes.
  9. Verdeel het basisvoorwaardenprogramma in verschillende buisjes van 1,5 ml, die ongeveer 400 μl in elk buisje bevatten. Er zijn in totaal vier buizen. Ongeveer 500 μL PRP per buis wordt aanbevolen.

4. Bereid de activator voor

  1. Laat de 10 ml bloed zonder antistollingsmiddel in een serumbloedafnamebuisje (stap 2.3.3) 30 minuten op kamertemperatuur staan.
  2. Centrifugeer het bloedmonster zonder antistollingsmiddel gedurende 8 minuten bij 2.015 x g en kamertemperatuur in een laboratoriumcentrifuge.
  3. Verzamel het bovenstaande als autologe trombine.
  4. Meng 0,5 M CaCl2 en autologe trombine in een verhouding van 1:1 (v/v) als activator. Zo werd bijvoorbeeld 500 μL CaCl2 gemengd met 500 μL autologe trombine. Maak een totaal volume van 1 ml van de activator.

5. PRP-activering

  1. Meng PRP en de activator in een verhouding van 10:1 (v/v). Meng 400 μl PRP met 40 μl van de activator in elke tube van 1,5 ml en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dit wordt geactiveerd PRP in gecoaguleerde vorm.

6. Opslag van PRP

  1. Centrifuge activeert PRP bij 9.000 x g gedurende 10 minuten in een laboratoriumcentrifuge van 4 °C.
  2. Verzamel het bovenstaande via een pipet in een spuit met het juiste volume.
  3. Filtreer het bovenstaande door een membraan van 0,22 μm.
  4. Bewaar de uiteindelijke PRP bij -80 °C tot gebruik.

7. Meting van bloedplaatjesconcentraties en groeifactorniveaus

  1. Tel het aantal bloedplaatjes in heel plasma en PRP met behulp van een geautomatiseerd hematologiesysteem (zie materiaaltabel).
  2. Analyseer concentraties van PDGF-BB-, IGF- en EGF-spiegels in heel plasma en geactiveerd PRP met behulp van in de handel verkrijgbare ELISA-kits (zie materiaaltabel).

8. Test op celproliferatie

  1. Isoleer hASC's met behulp van een eerder beschreven methode18.
    1. Zaai hASC's met een dichtheid van 1,0 x 104 cellen/putje in kweekplaten met 24 putjes en incubeer 's nachts bij 37 °C in DMEM met 10% FBS en antibiotica. Gebruik hASC's uit de passages 7-9 in experimenten.
  2. Vervang celmedia door serumvrije DMEM. Voeg na 6 uur basisvoorwaardenprogramma in de aangegeven concentraties toe en incubeer verder gedurende 48 uur bij 37 °C.
  3. Incubeer met WST-8-oplossing (zie materiaaltabel) gedurende 1 uur bij 37 °C. Afleesabsorptie bij 450 nm met een plaatlezer met meerdere putjes.
  4. Construeer een standaardcurve: Zaad hASC's met dichtheden van 0, 6.250, 12.500, 25.000, 50.000 en 100.000 cellen/putje in platen met 24 putjes in DMEM met 10% FBS gedurende 3 uur. Lees de extinctie af bij 450 nm na incubatie met WST-8-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C
    1. Teken de standaardcurve door het aantal cellen uit te zetten tegen de A450 nm.
  5. Schat het aantal hASC's van de extinctie op basis van de standaardcurve.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Verrijkte concentraties van bloedplaatjes en PDGF-BB in PRP
Concentraties van bloedplaatjes en PDGF-BB in PRP namen respectievelijk 11,5 en 25,9 keer toe, net zo hoog als die in heel plasma. De concentraties van EGF in PRP waren echter niet veranderd en IGF was slechts 70% van die van volledig plasma (tabel 1). De experimenten werden vier keer gerepliceerd met de dubbelspin-methode.

Verbeterde proliferatie van hASC'...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Na PRP-activering "activeren" verschillende groeifactoren, zoals PDGF, EGF, IGF, TGF-β en VEGF 1,6,7 cellen en weefsels van wonden en bevorderen ze wondgenezing20,21. In het geval van cosmetische reconstructiechirurgie is aangetoond dat geactiveerde cellen genezing induceren en de esthetiek verbeteren 22,23

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Niet van toepassing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20 mL Spuit, Terumo spuit met klepTerumo, Tokyo, Japan.SS-20LZP
50 mL Buis, Polypropyleen Conische BuisCorning, NY, USA.352070
Geautomatiseerd hematologiesysteemSysmex Corp., Tokyo, JapanXE-2100
Bloedopnamenaald, SafeTouch PSV set met luer-adapter, 21 G x 3/4”Nipro, Osaka, Japan.32-384
Bloedopnamebuis, ACD Opnamebuis, 8,5 mLBD Vacutainer, NJ, USA.364606
Bloedopnamebuis, Serum Opnamebuis/monovette, 10 mLBD Vacutainer, NJ, USA.366430
Calciumchloride, 1 mEq/ mL,Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.3215400A1061
Canule, BS vlakgeslepen naald, 18 G (1,2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokyo, Japan.BS-81007Niet voor verkoop
Celtellingskit-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JapanCK04
CentrifugeKokusan, Tokyo, Japan.H-19F
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Duitsland.5415R
EnSpire 2300 Multilabel ReaderPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
FiltereenheidMerck Millipore, Co. Cork, Ierland.SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA-kitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA-kitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA-kitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADBB00
Pipettip, ART 1000 Reach Barrier TipThermo Scientific, MA, USA.2079-05-HR
Pipet, Nichipet EXII 100-1000 μLNichiryo, Saitama, Japan.00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free onderzoekshandschoenenKimberly-Clark50707
Yamazen Alcohol voor DesinfectieYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.A7L07

Referenties

  1. Eppley, B. L., Woodell, J. E., Higgins, J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 114 (6), 1502-1508 (2004).
  2. Salcido, R. S. Autologous platelet-rich plasma in chronic wounds. Advances in Skin & Wound. 26 (6), 248(2013).
  3. Marx, R. E., et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 85 (6), 638-646 (1998).
  4. Bhanot, S., Alex, J. C. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plastic Surgery. 18 (1), 27-33 (2002).
  5. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 107 (1), 238(2001).
  6. Eppley, B. L., Pietrzak, W. S., Blanton, M. Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 147-159 (2006).
  7. Lubkowska, A., Dolegowska, B., Banfi, G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 26, 2 Suppl 1 3-22 (2012).
  8. Kakudo, N., et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 122 (5), 1352-1360 (2008).
  9. Kakudo, N., Morimoto, N., Kushida, S., Ogawa, T., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma releasate promotes angiogenesis in vitro and in vivo. Medical Molecular Morphology. 47 (2), 83-89 (2014).
  10. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O., Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound Repair and Regeneration. 10 (5), 336-340 (2002).
  11. Lucarelli, E., et al. Platelet-derived growth factors enhance proliferation of human stromal stem cells. Biomaterials. 24 (18), 3095-3100 (2003).
  12. Kilian, O., et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro. European Journal of Medical Research. 9 (7), 337-344 (2004).
  13. Kanno, T., Takahashi, T., Tsujisawa, T., Ariyoshi, W., Nishihara, T. Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (3), 362-369 (2005).
  14. Gruber, R., et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions. Platelets. 15 (1), 29-35 (2004).
  15. Koellensperger, E., von Heimburg, D., Markowicz, M., Pallua, N. Human serum from platelet-poor plasma for the culture of primary human preadipocytes. Stem Cells. 24 (5), 1218-1225 (2006).
  16. Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25 (5), 1270-1278 (2007).
  17. Hara, T., et al. Platelet-rich plasma stimulates human dermal fibroblast proliferation via a Ras-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Journal of Artificial Organs. 19 (4), 372-377 (2016).
  18. Lai, F., et al. Platelet-rich plasma enhances the proliferation of human adipose stem cells through multiple signaling pathways. Stem Cell Research and Therapy. 9 (1), 107(2018).
  19. Vajpayee, N., Graham, S. S., Bem, S. Basic examination of blood and bone marrow. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22, 509-535 (2011).
  20. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound. 24 (4), 176-181 (2011).
  21. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  22. Cervelli, V., et al. platelet rich lipotransfert: our experience and current state of art in the combined use of fat and PRP. BioMed Research International. 2013, 434191(2013).
  23. Gentile, P., et al. Platelet-Rich Plasma and Micrografts Enriched with Autologous Human Follicle Mesenchymal Stem Cells Improve Hair Re-Growth in Androgenetic Alopecia. Biomolecular Pathway Analysis and Clinical Evaluation. Biomedicines. 7 (2), (2019).
  24. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 3 (6), 406(2015).
  25. Gentile, P., Casella, D., Palma, E., Calabrese, C. Engineered Fat Graft Enhanced with Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells for Regenerative Medicine: Clinical, Histological and Instrumental Evaluation in Breast Reconstruction. Journal of Clinical Medicine. 8 (4), (2019).
  26. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and Potentiality of Human Adipose-Derived Stem Cells (hASCs) Obtained from Enzymatic Digestion of Fat Graft. Cells. 8 (3), (2019).
  27. Scioli, M. G., Bielli, A., Gentile, P., Cervelli, V., Orlandi, A. Combined treatment with platelet-rich plasma and insulin favours chondrogenic and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in three-dimensional collagen scaffolds. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (8), 2398-2410 (2017).
  28. Marx, R. E., Garg, A. K. Dental and craniofacial applications of platelet-rich plasma. , Quintessence Publishing Company. (2005).
  29. Kakudo, N., Kushida, S., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma: the importance of platelet separation and concentration. Plastic and Reconstructive Surgery. 123 (3), author reply 1136-1137 1135-1136 (2009).
  30. Kakudo, N., Kushida, S., Minakata, T., Suzuki, K., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma promotes epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Medical Molecular Morphology. 44 (4), 233-236 (2011).
  31. Kushida, S., et al. Platelet and growth factor concentrations in activated platelet-rich plasma: a comparison of seven commercial separation systems. Journal of Artificial Organs. 17 (2), 186-192 (2014).
  32. Morimoto, N., et al. Exploratory clinical trial of combination wound therapy with a gelatin sheet and platelet-rich plasma in patients with chronic skin ulcers: study protocol. British Medical Journal Open. 5 (5), 007733(2015).
  33. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N., Mori, Y., Kusumoto, K. Utilization of Platelet-Rich Plasma for a Fistula With Subcutaneous Cavity Following Septic Bursitis: A Case Report. Eplasty. 15, 31(2015).
  34. Eby, B. W. Platelet-rich plasma: harvesting with a single-spin centrifuge. Journal of Oral Implantology. 28 (6), 297-301 (2002).
  35. Castillo, T. N., Pouliot, M. A., Kim, H. J., Dragoo, J. L. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. The American Journal of Sports Medicine. 39 (2), 266-271 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Double Spin methodeautologe trombineactivatiemeting van het aantal bloedplaatjesproliferatie assaycentrifugatieprotocolcelkweektechniektoepassing in regeneratieve geneeskundestamcelproliferatie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.