Methodenartikel

Controle van de stroomsnelheden van 3D-actieve vloeistoffen op basis van microtubulus met behulp van temperatuur

DOI:

10.3791/60484

⸱

26 november 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om temperatuur te gebruiken om de stroomsnelheden van driedimensionale actieve vloeistoffen te regelen. Het voordeel van deze methode maakt het niet alleen mogelijk om stroomsnelheden in situ te reguleren, maar maakt ook dynamische controle mogelijk, zoals periodiek afstemmen van stroomsnelheden op en neer.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een methode voor het gebruik van temperatuur om de stroomsnelheden van kinesin-driven, microtubulusgebaseerde driedimensionale (3D) actieve vloeistoffen af te stemmen. Deze methode maakt het mogelijk om de snelheden in situ te tunen zonder de noodzaak om nieuwe monsters te vervaardigen om verschillende gewenste snelheden te bereiken. Bovendien maakt deze methode de dynamische controle van de snelheid mogelijk. Fietsen de temperatuur leidt de vloeistoffen te stromen snel en langzaam, periodiek. Deze bestuurbaarheid is gebaseerd op de Arrhenius-karakteristiek van de kinesin-microtubulusreactie, waarbij een gecontroleerd gemiddelde debietbereik van 4 – 8 μm/s wordt aangetoond. De gepresenteerde methode opent de deur naar het ontwerp van microfluïdische apparaten waarbij de stroomsnelheden in het kanaal lokaal instelbaar zijn zonder dat er een ventiel nodig is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actieve materie wordt onderscheiden van conventionele passieve materie vanwege zijn vermogen om chemische energie om te zetten in mechanisch werk. Een materiaal dat dergelijke capaciteiten bezit, kan bestaan uit levende of niet-levende wezens zoals bacteriën, insecten, colloïden, granen en cytoskelet filamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Deze materiële entiteiten communiceren met hun buren. Op grotere schaal organiseren ze zichzelf in turbulente-wervelingen (actieve turbulentie) of materiaalstromen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Een goed begrip van de zelforganisatie van de actieve materie heeft geleid tot verschillende toepassingen in moleculaire shuttles, optische apparaten en parallelle berekening21,22,23. Om toepassingen naar het volgende niveau te brengen, is controle buiten zelforganisatie vereist. Palacci et al. ontwikkelde bijvoorbeeld een colloïde met hematiet-omhulde die zelfrijdend was bij blootstelling aan handmatig gecontroleerd blauw licht, wat leidde tot het ontstaan van levende kristallen24. Morin et al. richtte de controle op rollende Quincke colloïden op met behulp van een afstembare externe elektrische veld, resulterend in colloïdale massaal in een race track-achtige kanaal25. Deze eerdere werken tonen de rol van lokale controle in toepassingen aan en geven de kennisbasis van de actieve materie door.

In dit artikel richten we ons op de bestuurbaarheid van kinesin-driven, microtubulus (MT)-gebaseerde 3D-actieve vloeistoffen. De vloeistoffen bestaan uit drie hoofdbestanddelen: MTs, kinesin moleculaire motoren, en depletanten. De depletie induceren een uitputting kracht om de MTs te bundelen, die later overbrugd worden door motor clusters. Deze motoren lopen langs de MTstoward het plus-uiteinde. Wanneer een paar overbrugd mtsis Antiparallel, lopen de corresponderende motoren in tegengestelde richtingen. Echter, de motoren zijn gebonden in een cluster en zijn niet in staat om uit elkaar te lopen, zodat ze coöperatief glijden paren van MTs (interfilament glijden, Figuur 1a). Deze schuif dynamiek accumuleren, waardoor bundels van MTsto zich uitstrekken tot hun knik instabiliteit punt en breken (extensile bundels, Figuur 1B)26. De gebroken bundels worden gegloeid door de depletie kracht, die zich vervolgens weer uitstrekt, en de dynamiek herhaling. Tijdens het proces van de herhalende dynamiek roeren de bundel bewegingen de nabijgelegen vloeistof, inducerende stromen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van doping met micron-schaal tracers (Figuur 1C). Sanchez et al. en Henkin et al. hebben de gemiddelde snelheden van tracers gekarakteriseerd, bevinding dat de snelheden afstelbaar waren door de concentraties van adenosinetrifosfaat (ATP), depletanten, motor clusters en MTs19,27te variëren. Echter, dergelijke tunability bestond alleen vóór de actieve vloeistof synthese. Na de synthese ging de toenability verloren en de vloeistoffen zelf organiseerden ze op hun eigen manier. Om actieve vloeistof activiteit na synthese te regelen, rapporteerde Ross.et al. een methode met behulp van de lichtgeactiveerde door dimerisatie van motor eiwitten, waardoor vloeistof activiteit in-en uitgeschakeld kan worden met behulp van licht28. Terwijl lichtsturing handig is in termen van het lokaal activeren van de vloeistoffen, vereist de methode het herontwerpen van de structuren van motor eiwitten, samen met het wijzigen van de optische paden in een microscoop. Hier bieden we een eenvoudig te gebruiken methode voor het lokaal beheersen van vloeistofstromen zonder Microscoop modificatie, terwijl de motorische structuur intact blijft.

Onze methode voor het lokaal afstemmen van de actieve vloeistofstroom is gebaseerd op de Arrhenius-wet omdat de kinesin-MT-reactie is gemeld te verhogen met temperatuur29,30,31,32. Onze eerdere studies toonden aan dat de temperatuurafhankelijkheid van de gemiddelde snelheid van een actieve vloeistofstroom de Arrhenius-vergelijking volgde: v = a exp (-EA/RT), waarbij a een pre-exponentiële factor is, R de gasconstante is, EA de activeringsenergie, en T de systeemtemperatuur33. Daarom is de vloeistof activiteit gevoelig voor de temperatuur omgeving en moet de systeemtemperatuur consistent zijn om de motorprestaties te stabiliseren, en bijgevolg de vloeistofstroom snelheid34. In dit artikel demonstreren we het gebruik van de temperatuurafhankelijkheid van de motor om de stroomsnelheden van actieve vloeistoffen continu af te stemmen door de systeemtemperatuur aan te passen. We demonstreren ook de bereiding van een actief vloeistofmonster, gevolgd door het monteren van het monster op een Microscoop-fase waarvan de temperatuur via computer software wordt geregeld. Het verhogen van de temperatuur van 16 °C tot 36 °C versnelt de gemiddelde stromingssnelheid van 4 tot 8 μm/s. Bovendien is de instelbaarheid omkeerbaar: herhaaldelijk verhogen en verlagen de temperatuur sequentieel versnelt en vertraagt de stroom. De Gedemonstreerde methode is toepasbaar op een breed scala van systemen waarbij de belangrijkste reacties gehoorzamen aan de Arrhenius wet, zoals de MT gliding assay29,30,31,32.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van MTs

Let op: in deze stap zuiveren we tubulinen van runderhersen weefsel. Runderhersenen kunnen een variant Creutzfeldt-Jakob-ziekte (vCJD)35veroorzaken. Daarom moeten het hersen afval en aanverwante oplossingen, flessen en pipetpunten worden opgevangen in een bioafvalzak en worden afgevoerd als biologisch gevaarlijk afval volgens de regels van de instelling.

  1. Reinig tubulinen van runderhersenen (gewijzigd van Castoldi et al.36).
    1. Vervoer ongeveer 1,5 kg verse runderhersenen van een plaatselijk slachthuis naar een koude kamer in de Universiteit. Bewaar tijdens het transport de hersenen in fosfaatbuffer (20 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,2) op ijs.
      Opmerking: om het uiteindelijke rendement van tubuline te maximaliseren, is de initiële hoeveelheid functionele tubuline in het verse hersenweefsel de sleutel. Frisser hersenen bevatten meer functionele tubulin. Om de meest verse hersenen uit het slachthuis te verkrijgen, raden we aan om de slager te vragen om de hersenen van de meest recent geslachte koeien te voorzien. Hersenen moeten niet ouder zijn dan 3 h bij het starten van de procedure, omdat het verkorten van de tijd tussen het slachten en de procedure start betere opbrengsten zal opleveren.
    2. Homogeniseren en verduidelijken de hersenen.
      1. Reinig de hersenen met behulp van scalpels te snijden bloedvaten en bindweefsel in kleinere stukken en verwijder ze uit de hersenen met de hand.
        Opmerking: de gereinigde hersenen moeten roze zijn.
      2. Dompel het gereinigde hersenweefsel onder in 1 L depolymerisatie buffer (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur, 1 mM CaCl2, pH 6,6) per kilogram hersenen.
      3. Homogeniseer de hersenen met een keuken blender.
      4. Centrifugeer de gehomogeniseerde hersen oplossing bij 10.000 x g en 4 °c gedurende 150 min.
    3. Polymerize MTs (eerste polymerisatie).
      1. Verzamel en meng het supernatant met gelijke hoeveelheden van de volgende oplossingen bij 37 °C: glycerol, hoge-molarity buizen buffer (HMPB: 1 M PIJPEN, 10 mM MgCl2, 20 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoehyl ether)-N, N, n ', N'-tetraazijnzuur [EGTA], pH 6,9)
      2. Voeg 1,5 mM ATP en 0,5 mM calciumguanosine trifosfaat (GTP) toe aan het mengsel.
      3. Incuberen het mengsel bij 37 °C gedurende 1 uur.
    4. Depolymerize MTs (eerste MT depolymerisatie).
      1. Pellet MT door centrifugeren bij 151.000 x g en 37 °c gedurende 30 minuten.
      2. Gooi supernatant weg en regeer elke MT pellet in 10 mL 4 °C DB.
      3. Incuberen op ijs gedurende 30 minuten.
      4. Roer het mengsel om de 5 minuten met een pipetpunt om de sedimentatie van de MT te voorkomen.
        Opmerking: het mengsel moet in 30 minuten helder worden, wat aangeeft dat de MT-depolymerisatie is voltooid.
    5. Polymerize MTs (tweede MT polymerisatie).
      1. De oplossing wordt verduidelijkt door centrifugeren bij 70.000 x g en 4 °c gedurende 30 minuten.
      2. Verzamel en meng het supernatant met gelijke volumes van 37 °C glycerol en HMPB.
      3. Voeg 1,5 mM ATP en 0,5 mM GTP toe aan het mengsel.
      4. Incuberen het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    6. Herhaal stap 1.1.4, ter vervanging van hmpb met Brinkley HERMONTAGE buffer (BRB) 80 (80 mm buizen, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8), gevolgd door de klaring van het geclearde mengsel door centrifugeren bij 79.000 x g en 4 °c gedurende 30 minuten.
    7. Vang het supernatant op. Meet de extinctie van 280 nm met een spectrometer. Bepaal de tubuline-concentratie met de wet bier-Lambert (extinctiecoëfficiënt van tubuline: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Bewaar het eiwit bij-80 °C.
  2. Recycle tubulins (gewijzigd van Castoldi et al.36).
    Opmerking: om de tubuline zuiverheid te verbeteren, wordt de gezuiverde tubuline gepolymeriseerd en opnieuw gedepolymeriseerd.
    1. Polymeriseren de MTs door de gezuiverde tubuline (stap 1.1.7) te mengen met 500 μM dithiotreïtol (DTT) en 20 μM GTP, gevolgd door 30 minuten incubatie bij 37 °c.
    2. Pellet de MTs.
      1. Plaats 1 mL glycerol kussen (80 mM buizen, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 6,8) in de bodem van een centrifugebuis.
      2. Leg de gepolymeriseerde MTs bovenop het kussen.
      3. Centrifugeer bij 172.000 x g voor 90 min bij 37 °c.
    3. Depolymerize de MTs.
      1. Verwijder de supernatant en het kussen.
      2. Respendeer elke MT pellet in 150 μL van 4 °C MT buffer (M2B: 80 mM buizen, 2 mM MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8).
      3. Inincuberen van het mengsel op ijs gedurende 30 min.
      4. Roer het mengsel elke 5 minuten met een pipetpunt. Het mengsel moet duidelijk worden.
    4. Het mengsel te verduidelijken door centrifugeren bij 172.000 x g en 4 °c gedurende 30 min.
    5. Vang het supernatant op. Meet de eiwitconcentratie. Bewaren bij-80 °C.
  3. Label de tubuline met fluorescerende kleurstof39.
    1. Polymerize de MTs. Meng de gezuiverde tubuline (stap 1.1.7) met 500 μM DTT en 16,7 μM GTP, en inbroed het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    2. Pellet de MTs.
      1. Plaats 1 mL 37 °C hoog-pH-kussen (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 8,6) in een centrifugebuis.
      2. Leg de gepolymeriseerde MTs op het kussen.
      3. Centrifugeer bij 327.000 x g voor 50 min bij 37 °c.
    3. Label tubulin.
      1. Respendeer elke MT-pellet met 700 μL van 37 °C etiketterings buffer (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 40% v/v glycerol, pH 8,6).
      2. Meng de suspensie met een 10 – 20 molaire overmaat van Far-Red fluorescerende kleurstof gefunctionaliseerd met een succinimidyl Ester.
      3. Inbroed het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker, zodat de MTs kan reageren met de ester van de fluorescerende kleurstof.
      4. Stop de etiketterings reactie door de ester van de suspenderen kleurstof met 50 mM K-glutamaat te verzaderen, inbroed gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    4. Pellet het gelabelde MTs: Herhaal stap 1.3.2, vervanging van het hoge pH-kussen met laag-pH kussen (80 mM buizen, 2 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 6,8).
    5. Depolymerize MTs.
      1. Gooi het supernatant en het kussen weg.
      2. Respendeer de pellet in 700 μL van 4 °C M2B.
      3. Inincuberen van de suspensie op ijs.
      4. Roer elke 5 minuten met een pipetpunt tot de oplossing helder is.
    6. Verhelderend de oplossing door centrifugeren bij 184.000 x g en 4 °c gedurende 35 min.
    7. Verbeter de zuiverheid van de gelabelde tubuline-oplossing door stap 1.2.1 – 1.2.4 te herhalen.
    8. Meet de concentratie van eiwitten en fluorescerende kleurstof. Gebruik deze metingen om te bepalen van de tubuline-concentratie en de fracties van gelabelde tubuline, gedefinieerd als de verhouding van de concentraties van fluorescerende kleurstof aan tubuline.
    9. Bewaar de gelabelde tubuline-oplossing bij-80 °C.
  4. Polymeriseren de MTs (overgenomen van Sanchez et al.19):
    1. Meng de gerecycleerde tubuline (stap 1.2.5) met gelabelde tubuline (stap 1.3.9) in een verhouding die een 3% met het label tubuline fractie oplevert.
    2. Meng het mengsel van 8 mg/mL tubuline met 1 mM DTT en 0,6 mM Guanosine-5 ' [(α, β)-methyleno] trifosfaat (GMPCPP), gevolgd door 30 minuten incubatie bij 37 °C.
    3. Na de incubatie, anneal de MTs bij kamertemperatuur in het donker voor 6 h.
    4. Aliquot en bewaren bij-80 °C.

2. synthetiseren kinesin clusters

Opmerking: bacteriën bestaan alomtegenwoordig en kunnen in de media groeien en het bereidingsproces besmetten. Om besmetting te voorkomen, moeten acties met betrekking tot de celculturen (bijv. pipetteren) in de buurt van een vlam worden uitgevoerd. Gereedschappen zoals kolven, pipetten, pipetpunten, media en platen moeten voor gebruik worden geautoclaveerd.

  1. Express kinesin motoren in Escherichia coli40.
    1. Transformeer de cellen.
      1. Pipetteer 1 μL van de K401-BCCP-H6 plasmide in 10 μL van de bevoegde cellen.
      2. Incuberen op ijs gedurende 5 min.
      3. Hitteschok bij 42,5 °C voor 45 s.
      4. Inbroed de cellen op ijs voor 2 min om herstel toe te staan.
      5. Meng de cellen met 300 μL antibioticum vrij 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L gistextract, 16 g/L Tryptone).
      6. Inincuberen de cellen bij 37 °C gedurende 1 uur.
        Opmerking: tenzij gespecificeerd, is het bewaken van de celgroei niet vereist tijdens de incubatie.
    2. Inoculeren plaat media.
      1. Verdeel de celkweek op een 2XYT plaat (10 g/L NaCl, 5 g/L gistextract, 10 g/L Tryptone, 15 g/L agar, 100 μg/mL ampicilyl, 25 μg/mL chlooramfenicol).
      2. Incuberen de plaat ondersteboven op 37 °C 's nachts.
    3. Inoculeren vloeibare media.
      1. Oogst vanaf de nacht plaat één geïsoleerde kolonie met een pipetpunt.
      2. Werp de punt in een kolf met 50 mL 2XYT.
      3. Inincuberen en schudden van de kweekmedia bij 37 °C en 200 rpm voor 12 – 16 uur.
    4. Vouw de cellen uit.
      1. Meng 2,5 mL celkweek in 500 mL 2XYT.
      2. Inincuberen en schudden van de 500 mL cultuur bij 37 °C en 250 rpm voor 3 – 6 uur.
    5. Eiwit expressie induceren.
      1. Bewaak tijdens de incubatie de celgroei door meting van de extinctie bij 600 nm, waarbij 2XYT als referentie wordt gebruikt. Meet de extinctie elke 60 min, totdat het OD600 = 0,3 bereikt. Meet vervolgens elke 30 minuten de extinctie tot 0,5 – 0,6 bereikt.
      2. Laat de cellen groeien tot de extinctie OD600 = 0,5 – 0,6 bereikt.
      3. Voeg 24 μg/mL Biotine en 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan de celkweek.
        Opmerking: IPTG wordt gebruikt voor het opwekken van de eiwit expressie van de kinesin-motoren, die zijn gelabeld met biotine-carboxyldrager proteïne (BCCP) en zes histidines (H6). De H6 tag wordt gebruikt in het zuiveringsproces (stap 2,2), terwijl BCCP bindt aan de toegevoegde Biotine moleculen tot biotinylaat de uitgesproken kinesin motoren.
      4. Inincuberen en schudden van de celkweek bij 20 °C en 250 rpm gedurende 12 – 20 uur.
    6. Oogst de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. Gooi het supernatant weg. Bewaar de celpellets bij-80 °C.
  2. Reinig het kinesin motor eiwit (gewijzigd van Spriestersbach et al.41):
    1. Onderbreek de celpellet (stap 2.1.6) met een gelijk volume lysisbuffer (50 mM buizen, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 10 mm 2-mercaptoethanol (βme), 20 mm imidazol, pH 7,2), gevolgd door toevoeging van één tablet proteaseremmer, 2 mg fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) en 2 mg lysozym.
    2. Lyseer de cellen door Flash in vloeibare stikstof (LN) 3x te bevriezen en het celmengsel te ontdooien.
      Opmerking: na Lysing moet het mengsel visceus worden.
    3. Het gelyseerd-celmengsel wordt verduidelijkt door centrifugeren bij 230.000 x g en 4 °c gedurende 30 minuten.
    4. Verzamel het supernatant en stroom het door een zwaartekracht kolom, gevolgd door het wassen van de kolom met 10 mL lysisbuffer.
      Opmerking: eiwitten met een H6-tag, zoals kinesin K401-BCCP-H6, moeten in de kolom blijven staan.
    5. Elueren het gelabelde eiwit met 5 mL elutie buffer (50 mM buizen, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 500 mm imidazol, pH 7,2). Verzamel de doorstroom opeenvolgend in fracties van 1 mL. Om de eiwit bevattende fracties te bepalen, Meng 3 μL van elke fractie met 100 μL Trifenylmethaan kleurstof. De eiwit-bevattende fracties moeten blauw worden. Combineer deze fracties en Verdun met 5x met lysisbuffer.
    6. Concentreer de eiwit oplossing.
      1. Laad de oplossing in een centrifugale filter buis.
      2. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
      3. Schud de buis zachtjes en centrifugeer opnieuw totdat het oplossings volume < 3 mL is.
    7. Meet de eiwitconcentratie met een spectrometer (extinctiecoëfficiënt: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Verdun het eiwit tot 1 mg/mL bij toevoeging van 35% w/v sucrose.
    8. Bewaren bij-80 °C.
  3. Meet de kinesin concentraties met een elektroforese gel (gemodificeerd van Taylor et al.44).
    Opmerking: om de kinesin-concentratie te meten met een elektroforese-gel, is tubuline een ideale concentratie ladder vanwege de hoge zuiverheid en de meetbare concentratie via een spectrometer (Figuur 2a)36.
    1. Bereid tubuline monsters met concentraties van 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 en 1,25 mg/mL. Meng 15 μL van elk tubuline monster en kinesin monster (stap 2.2.8) afzonderlijk met 5 μL monster buffer (200 mm tris-HCl, 8% natriumdodecylsulfaat (SDS), 400 mm DTT, 0,2% broomfenolblauw, 40% glycerol, pH 6,8) en inbroed bij 90 °c gedurende 3 minuten.
    2. Bereid de elektroforese.
      1. Vergrendel een elektroforese gel in de gelbox.
      2. Vul de doos met lopende buffer (50 mM MOPS, 50 mM tris Base, 0,1% SDS, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), pH 7,7).
        Opmerking: Zorg ervoor dat het bufferniveau zich boven de bovenste opening van de gel bevindt.
    3. Laad 10 μL eiwit standaard ladder, tubuline monsters en kinesin monster in afzonderlijke putjes en breng 200 V aan over de gel gedurende 45 min.
    4. Gel kleuring.
      1. Incuberen en rocken de gel met gekookte (ongeveer 95 °C) vlek oplossing A (0,5 g/L Trifenylmethaan kleurstof, 10% v/v azijnzuur, 25% isopropanol) gedurende 5 minuten en spoel vervolgens de gel af met gedeïoniseerd (DI) water.
      2. Herhaal met vlek oplossingen B (0,05 g/L Trifenylmethaan kleurstof, 10% v/v azijnzuur, 10% isopropanol), C (0,02 g/L Trifenylmethaan kleurstof, 10% v/v azijnzuur), en D (10% v/v azijnzuur), opeenvolgend. Inbroed en rock de gel 's nachts in DI water.
    5. Scan de gel. Zet de gel-afbeelding om in een grijswaardenafbeelding, gevolgd door een zwart-wit inversie en contrastverbetering om heldere eiwit bands in de zwarte achtergrond te onthullen.
    6. Meet de helderheid van elke band door de pixelwaarden op te vatten. Pas de lineaire pasvorm c = aB + btoe, waarbij b de helderheid is van een tubuline-band, C de corresponderende concentratie is en a en b passende parameters zijn. Bepaal de concentratie van kinesin Ck met behulp van de helderheid van de kinesin band Bk om de lineaire vergelijking te berekenen: Ck = aBk + B.
  4. Cluster de kinesin-motoren.
    1. Meng 1,5 μM kinesin (stap 2.2.8) met 120 μM DTT en 120 nM streptavidin. Incuberen op ijs gedurende 30 minuten.
    2. Bewaren bij-80 °C.

3. Maak glaasjes en dekstroken met Polyacrylamide coating (gewijzigd van Lau et al.45)

  1. Laad nieuwe glaasjes en glazen dekstroken in de bijbehorende containers. Dompel de dia's en dekglaasjes in 1% v/v wasmiddel in DI water en kook vervolgens het water in een magnetron.
  2. Soniceren de dia's en dekstroken gedurende 5 minuten en spoel vervolgens af met DI-water om detergens te verwijderen.
  3. Submerge en sonificeren de dia's en dekstroken in ethanol gedurende 5 min. spoelen met di water.
  4. Submerge en sonificeren de dia's en dekstroken in 100 mm kaliumhydroxide (Koh) gedurende 5 min. spoelen met di water.
  5. Inbroed de glijbanen en dekglaasjes in een silaanoplossing (1% azijnzuur en 0,5% 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat in ethanol) gedurende 15 minuten en spoel vervolgens af met DI water.
  6. Inbroed de glijbanen en dekglaasjes in de acrylamideoplossing (2% w/w acrylamide, 0,7 mg/mL ammonium persulfaat en 0,0035% v/v tetramethylethyleendiamine in DI water) gedurende ≥ 3 uur.
  7. Bewaar de glijbanen en dekglaasjes in de acrylamide oplossing.

4. Maak kinesin-driven, op MT gebaseerde actieve vloeistoffen

  1. Bereid actieve vloeistoffen (gewijzigd van Sanchez et al.19).
    Opmerking: de volgende stappen tonen het proces van het voorbereiden van 100 μL van een actieve vloeistof met voorbeeld voorraden. Het uiteindelijke volume is schaalbaar en de concentraties van de voorbeeld voorraden kunnen worden aangepast, zolang de uiteindelijke concentratie van elk onderdeel wordt gehandhaafd.
    1. Meng 16,7 μL van 8 mg/mL MTs (stap 1.4.4) met 6,7 μL 1,8 μM kinesin motor clusters (stap 2.4.2) en 1,1 μL 500 mM DTT in hoogzout M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bundel MTs door toevoeging van 11,4 μL van 7% w/w polyethyleenglycol (PEG).
    3. Activeer kinesin motoren door 2,8 μL van 50 mM ATP toe te voegen.
    4. Houd de ATP-concentraties bij door toevoeging van 2,8 μl voorraad pyruvaatkinase/lactaat dehydrogenase (PK/LDH) en 13,3 μL van 200 mm fosfenol pyruvaat (PEP).
    5. Verminder het fotobleekeffect door toevoeging van 10 μL 20 mM Trolox, 1,1 μL van 3,5 mg/mL catalase, 1,1 μL van 20 mg/mL glucose oxidase, en 1,1 μL van 300 mg/mL glucose.
    6. Houd de beweging van de vloeistof bij door 1,6 μL 0,025% v/v Tracer deeltjes toe te voegen.
    7. Voeg een hoog zout M2B toe om een totaal volume van 100 μL te bereiken.
      Opmerking: de Meng orders in stappen 4.1.1 – 4.1.6 zijn uitwisselbaar. Echter, zodra ATP, MTs, en de motoren worden gemengd, de motoren beginnen te consumeren ATP terwijl intensivering langs de MTs. Het monster wordt geactiveerd met een eindige levensduur als gevolg van de beperkte brandstoffen (ATP en PEP), zodat het experiment onmiddellijk moet worden gestart. De laatste actieve vloeistof dient 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin-motor clusters te bevatten, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glucose oxidase, 3,3 mg/mL glucose, en 0,0004% v/v colloïde in High-Salt M2B.
  2. Bereid een monster in een stroom kanaal (gewijzigd van Chandrakar et al.46):
    1. Spoel een glasplaat met Polyacrylamide coating en dekslip (stap 3,7) af met DI-water. Droog de glazen met lucht onder druk. Plaats op een schone, vlakke ondergrond.
    2. Snijd twee strips van wax films met een breedte van 3 mm en dezelfde lengte als de glazen dekglaasje (20 mm). Plaats de stroken tussen de dia en de afdekplaat als kanaal spacers.
    3. Hecht het glas aan de wax film door het glas-wascomplex op een 80 °C hete plaat te plaatsen om de wax te smelten. Druk tijdens het smelten zachtjes op de afdekplaat met een pipetpunt om de wax film gelijkmatig op de glazen oppervlakken te plakken. Koel het glazen complex na hechting af op kamertemperatuur.
    4. Laad de actieve vloeistoffen (stap 4,1) naar het stroom kanaal. Sluit het kanaal af met UV-lijm.

5. controle van de monstertemperatuur

  1. Bouw een temperatuurregeling Setup (aangepast van ontwerpen in lowensohn et al. en Wu et al.47,48,49).
    1. Maak een aluminium koelblok.
      1. Frees een aluminium plaat met afmetingen van ongeveer 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Boor een binnenkanaal door de plaat (Figuur 3A) en installeer slang fittingen aan de uiteinden van het kanaal.
      3. Haak elke fitting op een waterbuis.
      4. Sluit een buis aan op een aquarium pomp in een waterreservoir en strek de andere buis uit naar het reservoir.
        Opmerking: de pomp zal reservoir water door de interne aluminium kanalen circuleren om de blok temperatuur bij ongeveer kamertemperatuur te houden.
    2. Draad een thermo-elektrische koeler (TEC) en een thermosensor op een temperatuurregelaar. Sluit de controller aan op een computer met behulp van een USB-poort (afbeelding 3B).
    3. Draad de temperatuurregelaar op een gelijkstroomvoeding. Schakel de controller in door de voeding aan te sluiten op een stopcontact.
    4. Voer de initiële set-up van de TEC uit volgens de handleiding van de controller fabrikant. Test de TEC-uitgang. Het wordt aanbevolen om de temperatuurregelaar te besturen via door de fabrikant geleverde software, waardoor sensorgegevens kunnen worden opgenomen en eenvoudigere manipulatie van de temperatuurregelaar mogelijk is.
    5. Identificeer de verwarmings-en koelings zijden van de TEC.
    6. Bevestig de koel zijde van de TEC op het koelblok (stap 5.1.1) met behulp van thermische pasta.
    7. Bevestig een saffier schijf aan de verwarming zijde van de TEC met behulp van thermische pasta.
    8. De installatie is voltooid. Het saffier oppervlak en de thermosensor kunnen contact opnemen met een monster om het monster af te koelen en te verwarmen op basis van de temperatuur en de beoogde temperatuur.
      Opmerking: het is aanbevolen dat het TEC-en Cooling-blok een uitgelijnd centraal gat hebben voor de beeldvorming van de monsters met behulp van helder-veld microscopie (Figuur 3C).
  2. Gebruik de instelling voor temperatuurregeling om de monstertemperatuur33te regelen.
    1. Koppel het voorbeeld aan de installatie.
      1. Plaats het actieve vloeistofmonster (stap 4.2.4) op het saffier oppervlak met de schuif zijde die contact heeft met het oppervlak.
      2. Bevestig de glazen glijbaan met papier tape.
      3. Bevestig de thermosensor met koperen tape aan het afdek oppervlak.
    2. Monteer de Setup op een Microscoop-fase met de afdek zijde naar de doelstellingen gericht. Bijvoorbeeld, op een omgekeerde Microscoop, de dekslip zijde moet naar beneden gericht. Beveilig de installatie met papier tape en de Microscoop naald klemmen indien van toepassing.
      Opmerking: de gepresenteerde temperatuur fase moet werken met gemeenschappelijke microscopen die ofwel omgekeerd of rechtop zijn. Om ervoor te zorgen dat de temperatuur fase tijdens het experiment niet wordt verplaatst, is het het beste om de temperatuur fase in de microscoop met tape te beveiligen.
    3. Controle van de monstertemperatuur.
      1. Zet de temperatuurregelaar en de vistank pomp aan.
      2. Volg de handleiding van de fabrikant om de gewenste temperatuur in te stellen en temperatuurregeling in te schakelen. De controller past de verwarmings-of koel kracht aan op basis van de beoogde temperatuur en de monstertemperatuur, zoals beoordeeld door de thermosensor.
    4. Neem sample temperaturen op.
      1. Volg de handleiding van de fabrikant om temperatuur gegevens van thermosensor tijdens het experiment op te nemen.
        Opmerking: de monstertemperatuur moet nu door de controller worden gecontroleerd en door de computer worden opgenomen (Figuur 3D).

6. karakteriseren de actieve vloeistof activiteit (gewijzigd van methoden door Henkin et al. en Wu et al.20,27)

Opmerking: de vorige secties worden gebruikt om actieve vloeistofmonsters (secties 1 – 4) voor te bereiden en de temperatuur te regelen (paragraaf 5). Om het gebruik van temperatuur te demonstreren om de actieve vloeistof activiteit te controleren, het vloeistof gedrag te observeren, hun activiteiten te analyseren en hun reactie op temperatuur te karakteriseren.

  1. Tracers bewaken.
    1. Beeld het monster met een constante interval Δt met behulp van groene fluorescerende proteïne (GFP) fluorescentie om de beweging van de Tracer deeltjes vast te leggen.
      Opmerking: Δt moet worden gekozen om de Tracer beweging te kunnen traceren. Grote Δt -waarden, zoals 100 s, resulteren in het verliezen van de Tracer trajecten, terwijl korte δt -waarden, zoals 0,1 s, verhinderen dat het traceer algoritme de Tracer beweging tussen frames detecteert. Een werkende Δt moet toestaan dat de Tracer verplaatsing tussen frames binnen ~ 9 pixels is. Voor beeldvormings tractoren die met een 4x objectief op 10 μm/s bewegen, wordt de Δt aanbevolen om 1 – 5 s te zijn.
    2. Sla de afbeeldingen op als TIFF-bestanden, geef de bestanden een naam op basis van het framenummer en sla ze op in een aparte map. Deze processen zijn nodig om ervoor te zorgen dat de verworven afbeeldingen correct worden geanalyseerd met het meegeleverde MATLAB-script (stap 6.2.2).
  2. Rups tracers die de tracking software adopteren die is ontwikkeld door Ouellette et al.50,51):
    1. Download de tracking software van het Environmental complexiteits laboratorium, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Zorg ervoor dat elk MATLAB-bestand zich in dezelfde map bevindt.
    2. Tracers traceren met een aangepast MATLAB-script: particle_tracking. m. Het script leest Tracer beelden (stap 6,1) en traceert Tracer beweging met behulp van de software van Ouellette et al.50,51. Het voert twee bestanden uit: 1) background. TIF, vertegenwoordigt de achtergrond van de afbeelding en 2) tracking. mat, met de deeltjes trajecten en snelheden in elk frame (Figuur 4A).
  3. Analyseer de Tracer-gemiddelde snelheden met behulp van een aangepast MATLAB-script: Analysis. m. Het script leest het traceringsbestand (tracking. mat) en voert de gemiddelde snelheid van tracers versus tijd uit, samen met een tijdgemiddelde gemiddelde snelheid met gespecificeerde gemiddeldenvensters (Figuur 4B)33.
  4. Noteer het tijdgemiddelde gemiddelde toerental.
  5. Meet de tijdgemiddelde gemiddelde snelheid door het experiment te herhalen (stap 4, 5,2 en 6.1 – 6.4) bij 10 – 40 °C. Gebruik de vastgelegde gemiddelde snelheden om de gemiddelde snelheid en temperatuur te tekenen (Figuur 4C)33.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het voorbereiden van de kinesin-driven, op MT gebaseerde actieve vloeistoffen vereist zowel kinesin als MTs. De MTs werden gepolymeriseerd van gelabelde tubulinen (stappen 1,3 en 1,4) die werden gezuiverd van runderhersenen (stap 1,1, Figuur 2A), gevolgd door recycling om de zuiverheid te verbeteren (stap 1,2, Figuur 2B). De kinesin-motor eiwitten werden uitgedrukt in en gezuiverd uit E. coli (stappen 2,1 en 2,2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beheersen van actieve materie in situ opent de deur naar gerichte zelforganisatie van actieve materie4,5,24,28,54. In dit artikel presenteren we een protocol voor het gebruik van temperatuur om kinesin-driven, op Mt gebaseerde actieve vloeistoffen in situ te controleren, gebaseerd op de Arrhenius-karakteristiek van het systeem29

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmide K401-BCCP-H6 was een geschenk van Dr. Zvonimir Dogic. Dit onderzoek werd gesteund door Dr. kun-ta Wu's start-up Fund in het Worcester Polytechnic Institute. We danken Dr. Zvonimir Dogic voor de protocollen om tubuline te zuiveren en te labelen en actieve vloeistoffen te synthetiseren. We zijn Dr. Marc Ridilla dankbaar voor zijn expertise in eiwit expressie en zuivering. We danken Dr. William Benjamin Roger voor het assisteren bij het opbouwen van de temperatuurgestuurde stage. Wij erkennen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) voor het gebruik van de biologische materialen faciliteit (BMF). We erkennen de Royal Society of Chemistry voor het aanpassen van de cijfers van bate et al. on Soft Matter33.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire windowEdmund Optics43-637Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551R.S. HUGHES054007-27551Copper tape
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrateSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitSigma-AldrichUFC801024Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampicillin
Antivibration TableNikon63-7590S
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
Bucket-plastic white - 2 gallonBon84-715Water bucket
Calcium ChlorideSigma-Aldrich746495CaCl2
Catalase from bovine liverSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Cooling blockN/AN/ACustom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Triphenylmethane dye
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 Heat Sink CompoundDow1446622Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-AldrichE3889EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast ExtractFisher ScientificBP1422Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µmPolysciences18861Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlycerolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home TheaterAmazonB07428NBCWCopper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
High performance blender machineAIMORESAS-UP1250Blender
His GraviTrapGE Healthcare11003399Gravity Column
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99%Pharmco by Greenfield Global231000099Isopropanol
JA-10 rotorBeckman Coulter369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrateSigma-AldrichG1501K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg whiteSigma-AldrichL6876
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670MgCl2•6H2O
MES sodium saltSigma-AldrichM50572-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPSSigma-AldrichM12543-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022TE TechnologyMP-3022Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002(2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102(2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114(2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375(2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470(2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688(2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1(2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246(2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564(2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486(2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601(2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037(2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102(2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142(2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102(2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333(1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006(2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304(2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microtubule Based Active FluidsKinesin Driven Flow ControlTemperature Tuning MethodFlow Speed RegulationActive Fluid PreparationFluorescent Microscopy ImagingTracer Particle TrackingTemperature Control SetupMicrofluidic Device DesignArrhenius Characteristic Analysis

Gerelateerde artikelen