Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Summary

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Abstract

Intracellulaire bacteriën scheiden virulentie factoren die Effector eiwitten worden genoemd in de gastheer cytosol die handelen om gastheer eiwitten en/of hun geassocieerde biologische trajecten te verdraaien ten voordele van de bacterie. Identificatie van vermoedelijke bacteriële Effector eiwitten is meer beheersbaar geworden als gevolg van vooruitgang in bacteriële genoom volgordebepaling en de opkomst van algoritmen die toelaten in silico identificatie van genen coderen van secretie kandidaten en/of eukaryotic-achtige Domeinen. De identificatie van deze belangrijke virulentie factoren is echter slechts een eerste stap. Het doel is natuurlijk om de moleculaire functie van Effector eiwitten te bepalen en te verhelderen hoe ze omgaan met de gastheer. In de afgelopen jaren hebben technieken zoals het gist-twee-hybride scherm en grootschalige immunoprecipitaties in combinatie met massaspectrometrie geholpen bij de identificatie van eiwit-eiwit interacties. Hoewel identificatie van een host binding partner de cruciale eerste stap is om de moleculaire functie van een bacterieel Effector eiwit te verhelderend, wordt soms vastgesteld dat het gastheer eiwit meerdere biologische functies heeft (bijv. actin, clathrin, tubuline) of het bacteriële eiwit kan niet fysiek binden gastheer eiwitten, het ontnemen van de onderzoeker van cruciale informatie over de precieze gastheer traject wordt gemanipuleerd. Een gemodificeerd gist toxiciteits scherm in combinatie met een suppressor scherm is aangepast om gastheer trajecten te identificeren die worden beïnvloed door bacteriële Effector eiwitten. Het toxiciteits scherm is afhankelijk van een toxisch effect in gist veroorzaakt door de Effector proteïne interfereren met de gastheer biologische trajecten, die vaak manifesteert als een groei fout. De uitdrukking van een gist genomische bibliotheek wordt gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit onderdrukken en zo eiwitten identificeren in het traject dat het Effector eiwit target. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor zowel de toxiciteits-als de suppressor-schermen. Deze technieken kunnen worden uitgevoerd in elk lab dat geschikt is voor moleculair klonen en teelt van gist en Escherichia coli.

Introduction

Het eerste rapport van procedures vergelijkbaar met die hier gepresenteerd gekenmerkt de Legionella pneumophila type IV Effector Sidd, een deAMPylase dat wijzigt Rab1¹. Er werden vergelijkbare technieken gebruikt voor de karakterisering van verschillende L. pneumophila Effectors^1,2,3. De assay werd aangepast om een Coxiella burnetii type IV Effector proteïne⁴te karakteriseren, en onlangs werd het nut van deze techniek uitgebreid voor de karakterisering van Chlamydia trachomatis inclusie membra....

Protocol

1. bereiding van de media en reagentia

Opmerking: platen moeten vóór de dag van de test worden bereid en zijn goed voor 1 maand. Media en reagentia kunnen op elk moment worden gemaakt en zijn goed voor 1 maand.

1. Bereid 1 L van de glucoseoplossing (10% w/v) door 100 g van D-(+)-glucose op te lossen in 800 mL gedistilleerd water in een bekerglas van 1, 000 mL. Stel het volume in op 1 L met gedestilleerd water. Filtreer door een 0,2 μm steriel filter in een steriele 1 L media opslag fles.
2. Bereid 1 L van de galactose oplossing (10% m/v) door het oplossen van 100 g D-(+)-galactose in 800 mL gedistilleerd water in een 1 L beker....

Results

Voordat de werkelijke gist suppressor scherm kan worden uitgevoerd, de Effector eiwit van belang moet worden getest op toxiciteit in gist. Dit wordt bereikt door het uiten van het eiwit van belangstelling voor gist onder de controle van een galactose-inducible promotor. Groei van glucose (niet-inducerende voorwaarden) moet eerst worden vergeleken om ervoor te zorgen toxiciteit is specifiek te wijten aan de uitdrukking van het eiwit van belang en is niet een algemeen defect. Zoals weergegeven in Figuu.......

Discussion

Dit protocol schetst stapsgewijze procedures voor het identificeren van de gastheer biologische trajecten die zijn gericht door bacteriële Effector eiwitten met behulp van een gemodificeerde gist toxiciteit en suppressor scherm. De gebruikte gist stam, S. cerevisiae W303, is auxotrofische voor zowel uracil als leucine. Uracil auxotrophy van de stam wordt gebruikt om gist te selecteren die het eiwit van belangstelling draagt op de pYesNTA-kan vector, terwijl Leucine auxotrophy wordt gebruikt om te selecteren voor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR purification kit	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet plasmid miniprep kit	Thermo	K0503
Glucose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Herring Sperm DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Lithium acetate dihydrate	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530
Poly(ethylene glycol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
Tryptophan	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Yeast miniprep kit	Zymo	D2001
Yeast nitrogen base without amino acids	MilliporeSigma	Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1501-20G	without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1771-20G	without uracil, leucine, tryptophan