Method Article

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intracellulaire bacteriën scheiden virulentie factoren die Effector eiwitten worden genoemd in de gastheer cytosol die handelen om gastheer eiwitten en/of hun geassocieerde biologische trajecten te verdraaien ten voordele van de bacterie. Identificatie van vermoedelijke bacteriële Effector eiwitten is meer beheersbaar geworden als gevolg van vooruitgang in bacteriële genoom volgordebepaling en de opkomst van algoritmen die toelaten in silico identificatie van genen coderen van secretie kandidaten en/of eukaryotic-achtige Domeinen. De identificatie van deze belangrijke virulentie factoren is echter slechts een eerste stap. Het doel is natuurlijk om de moleculaire functie van Effector eiwitten te bepalen en te verhelderen hoe ze omgaan met de gastheer. In de afgelopen jaren hebben technieken zoals het gist-twee-hybride scherm en grootschalige immunoprecipitaties in combinatie met massaspectrometrie geholpen bij de identificatie van eiwit-eiwit interacties. Hoewel identificatie van een host binding partner de cruciale eerste stap is om de moleculaire functie van een bacterieel Effector eiwit te verhelderend, wordt soms vastgesteld dat het gastheer eiwit meerdere biologische functies heeft (bijv. actin, clathrin, tubuline) of het bacteriële eiwit kan niet fysiek binden gastheer eiwitten, het ontnemen van de onderzoeker van cruciale informatie over de precieze gastheer traject wordt gemanipuleerd. Een gemodificeerd gist toxiciteits scherm in combinatie met een suppressor scherm is aangepast om gastheer trajecten te identificeren die worden beïnvloed door bacteriële Effector eiwitten. Het toxiciteits scherm is afhankelijk van een toxisch effect in gist veroorzaakt door de Effector proteïne interfereren met de gastheer biologische trajecten, die vaak manifesteert als een groei fout. De uitdrukking van een gist genomische bibliotheek wordt gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit onderdrukken en zo eiwitten identificeren in het traject dat het Effector eiwit target. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor zowel de toxiciteits-als de suppressor-schermen. Deze technieken kunnen worden uitgevoerd in elk lab dat geschikt is voor moleculair klonen en teelt van gist en Escherichia coli.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het eerste rapport van procedures vergelijkbaar met die hier gepresenteerd gekenmerkt de Legionella pneumophila type IV Effector Sidd, een deAMPylase dat wijzigt Rab11. Er werden vergelijkbare technieken gebruikt voor de karakterisering van verschillende L. pneumophila Effectors1,2,3. De assay werd aangepast om een Coxiella burnetii type IV Effector proteïne4te karakteriseren, en onlangs werd het nut van deze techniek uitgebreid voor de karakterisering van Chlamydia trachomatis inclusie membraan eiwitten5 .

Dit protocol kan worden opgesplitst in twee belangrijke delen: 1) het gist toxiciteits scherm, waarin de bacteriële Effector proteïne van belangstelling wordt uitgedrukt in gist en klonen worden gescreend op een toxisch fenotype zoals blijkt uit een groei fout, en 2) het gist suppressor-scherm , waarin het toxische fenotype wordt onderdrukt door uitdrukking van een gist genomische bibliotheek in de toxische stam. Zo is het toxiciteits scherm een scherm voor toxische fenotypes dat zich manifesteert als groei fouten wanneer de bacteriële Effector van belang wordt overexpressie. Giftige klonen, succesvol getransformeerd met en uitdrukken van de bacteriële Effector, worden geselecteerd en opgeslagen voor de volgende stap. De tweede belangrijke stap is het overdrukken van een gedeeltelijk verteerde gist genomische bibliotheek in de giftige gist kloon. Plasmiden maken van de gist genomische Library voorgesteld voor het gebruik in dit protocol dragen 5 − 20 KB inserts, meestal overeenkomend met 3 − 13 gist open reading frames (ORF) van een gemiddelde gengrootte van ~ 1,5 KB over alle plasmiden, die het hele gist genoom bedekt ongeveer 10x. Dit deel van de test wordt het suppressor scherm genoemd, omdat het doel is om de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit te onderdrukken. Potentiële suppressor plasmiden zijn geïsoleerd van gist, Sequenced, en het onderdrukken van Orf's geïdentificeerd. De ratio die aan het onderdrukker scherm ten grondslag ligt, is dat de Effector proteïne bindt, samenwerkt met, en/of overweldt van componenten van het ontvangende pad dat het target, en dat het verstrekken van die gastheer eiwitten terug in overmaat het toxische effect op het traject kan redden en dus, de groei fout. Zo, geïdentificeerde Orf's die toxiciteit onderdrukken vaak vertegenwoordigen meerdere deelnemers van een host-traject. Orthogonale experimenten worden vervolgens uitgevoerd om te controleren of de bacteriële Effector inderdaad met het betrokken traject samenwerkt. Dit is vooral nodig als een bindende partner zoals clathrin of actine is geïdentificeerd, omdat deze eiwitten betrokken zijn bij een veelheid van hostprocessen. Verdere experimenten kunnen dan de fysiologische functie van het Effector eiwit verheldoen tijdens infectie. De toxiciteits-en suppressor schermen zijn ook krachtige hulpmiddelen voor het ontcijferen van de fysiologische functie van bacteriële Effector eiwitten die niet fysiek gastheer eiwitten binden met affiniteiten die voldoende zijn om te detecteren door immunoprecipitatie of die interageren met de host in enzymatische hit-and-run interacties die mogelijk niet worden gedetecteerd door een gist-twee hybride scherm.

Hoewel het suppressor-scherm een krachtige methode kan zijn om potentiële fysiologische interacties tussen bacteriële Effector eiwitten en hosttrajecten te onthullen, moet het bacteriële Effector eiwit een groei fout in gist induceren, anders gebruikt het in de het onderdrukker scherm zal weinig gebruikt worden. Bovendien moet het toxische fenotype resulteren in ten minste een 2 − 3 log10 -tekort in groei of het zal moeilijk zijn om suppressors te identificeren. Als een laboratorium is opgezet voor celkweek, screening Effector eiwitten voor toxiciteit in gemeenschappelijke cellijnen zoals HeLa kan vaak inzicht geven of het de moeite waard om door te gaan met de gist toxiciteit scherm. Ectopische uitdrukking van het Effector-eiwit in HeLa-cellen leidt soms tot toxiciteit die zeer sterk correleert met de toxiciteit in de gist stam die voor deze schermen wordt gebruikt4. Waarneembare kenmerken van stress in HeLa-cellen zijn verlies van stress vezels, celloslating van de plaat en nucleaire condensatie die apoptosis aangeeft. Elke visuele indicatie van stress in HeLa-cellen maakt het eiwit van belang een goede kandidaat voor het induceren van een groei fout in gist, die veel sneller repliceert en dus beter reageert op perturbatie van essentiële trajecten.

Opgemerkt moet worden dat het onderdrukker scherm niet altijd host binding partners identificeert als onderdrukkers, maar het kan nog steeds cruciale componenten van de beoogde host-traject (en) impliceren, wat een holistisch beeld oplevert van de biologische processen die worden gekaapt door de bacteriële Effector eiwitten. Op het oppervlak, dit lijkt contra-intuïtief, omdat het verstrekken van de bindende partner van de Effector eiwit in overmaat zou worden verwacht dat de groei defect te redden. Bij inspanningen om trajecten te identificeren die zijn getarget door de C. trachomatis Effector Protein CT229 (cpos), die bindt aan ten minste 10 verschillende Rab GTPases tijdens infectie5, onderdrukte geen van de bindende partners van Rab de toxiciteit van CT229. Er werden echter talrijke onderdrukkers geïdentificeerd die betrokken waren bij de handel met clathrin-Coated blaasje (CCV), wat leidde tot verder werk dat aantoont dat CT229 in het bijzonder Rab-afhankelijke CCV-mensenhandel ondermijnt. Evenzo, bij het onderzoeken van de C. burnetii Effector Protein Cbu0041 (CIRA) verschillende Rho gtpases die de gist groei defect gered werden geïdentificeerd, en het werd later gevonden dat CIRA fungeert als een GTPase activeren eiwit (Gap) voor rhoa4.

Het nut van de gist suppressor scherm voor verhelderende gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten kan niet worden overschat, en andere onderzoekers proberen te karakteriseren intracellulaire bacteriële Effector eiwitten kunnen sterk profiteren van deze technieken. Deze assays zijn van waarde als immunoprecipitaties en/of gist-twee hybride schermen hebben nagelaten een bindende partner te vinden en kunnen verheldoen welke trajecten zijn gericht op het bacteriële Effector eiwit. Hier, gedetailleerde protocollen voor de toxiciteit en suppressor schermen om gastheer biologische trajecten doelwit van intracellulaire bacteriële Effector eiwitten identificeren, evenals enkele van de gemeenschappelijke obstakels ervaren bij het gebruik van deze testen en hun bijbehorende oplossingen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van de media en reagentia

Opmerking: platen moeten vóór de dag van de test worden bereid en zijn goed voor 1 maand. Media en reagentia kunnen op elk moment worden gemaakt en zijn goed voor 1 maand.

  1. Bereid 1 L van de glucoseoplossing (10% w/v) door 100 g van D-(+)-glucose op te lossen in 800 mL gedistilleerd water in een bekerglas van 1, 000 mL. Stel het volume in op 1 L met gedestilleerd water. Filtreer door een 0,2 μm steriel filter in een steriele 1 L media opslag fles.
  2. Bereid 1 L van de galactose oplossing (10% m/v) door het oplossen van 100 g D-(+)-galactose in 800 mL gedistilleerd water in een 1 L bekerglas. Stel het volume in op 1 mL met gedestilleerd water en filtreer door een steriel 0,2 μm-filter in een steriele fles van 1.000 mL voor media opslag.
  3. Bereid 1 L gistextract pepton dextrose (ypd) agar door het oplossen van 10 g gistextract, 20 g pepton, 20 g glucose en 20 g agar in 1.000 ml gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in 56 °C waterbad tot gekoeld. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  4. Bereid 1 L YPD- bouillon voor door 10 g gistextract, 20 g peptone en 20 g glucose in 1.000 ml gedistilleerd water op te lossen. Autoclaaf gedurende 20 min.
  5. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil (Ura-) glucose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren, 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, en 15 g agar in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe. Meng goed door zachtjes te zwengelen of op roer plaat te plaatsen. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  6. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil (Ura-) galactose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren, 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, en 15 g agar in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met behulp van een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,2 bereide galactose oplossing toe. Meng goed door zachtjes te draaien of op de roer plaat te plaatsen. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  7. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil (Ura-) glucose Bouillon. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren en 1,9 g van dropout supplement zonder uracil in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 ml van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe.
  8. Bereid de synthetische dropout (SD) uracil(Ura-)Leucine (Leu-) glucose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van de gist stikstof basis zonder aminozuren; 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, Leucine, en tryptofaan; 15 g agar; en 0,076 g tryptofaan in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  9. Bereid synthetische dropout (SD) uracil(Ura-) Leucine (Leu-) galactose agar. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren; 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, Leucine, en tryptofaan; 15 g agar; en 0,076 g tryptofaan in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel in een waterbad van 56 °C tot de temperatuur ~ 50 − 60 °C is. Voeg met behulp van een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,2 bereide galactose oplossing toe. Meng goed door zachtjes te draaien of op een roer plaat te plaatsen. Giet in 100 mm platen met ~ 20 mL media per plaat.
  10. Bereid synthetische dropout (SD) uracil(Ura-) Leucine (Leu-) glucose Bouillon. Voor 1 L, los 6,7 g van gist stikstof basis zonder aminozuren; 1,9 g van dropout supplement zonder uracil, Leucine, tryptofaan; en 0,076 g tryptofaan in 800 mL gedistilleerd water. Autoclaaf gedurende 20 min en koel in een waterbad van 56 − 60 °C tot de temperatuur ~ 50 °C is. Voeg met een serologische Pipet van 50 mL of een steriele gegradueerde cilinder 200 mL van de in stap 1,1 bereide glucoseoplossing toe.
  11. Bereid polyethyleenglycol (PEG) oplossing. Voeg 50% w/v polyethyleenglycol 3350 toe in gedistilleerd water. Steriliseren door autoclaven.
  12. Bereid 1 M Lithium acetaat (LiAc) door het oplossen van 10,2 g lithium acetaat dehydraat in 200 mL gedistilleerd water. Steriliseren door autoclaven.
  13. Bereid haring sperma DNA. Verdun 10 mg/mL haring sperma DNA naar 2 mg/mL met gedestilleerd water. Verwarm bij 100 °C gedurende 5 min en plaats onmiddellijk 5 min op het ijs.

2. klonen van het gen van belang in de gist toxiciteit plasmide pYesNTA-kan

Opmerking: op dit moment zijn er verschillende gist toxiciteits vectoren beschikbaar, zowel commercieel als academisch. Het gist suppressor-scherm kan worden gebruikt in combinatie met veel van deze vectoren, op voorwaarde dat de plasmide die de Effector-proteïne van belang uitdrukt, een andere dropout-selectie dan uracil en een andere antibioticum marker dan blaRgebruikt. Dit werk gebruikte een gemodificeerde pyesnta Vector4,die een kanamycine weerstands cassette bevat voor een eenvoudigere screening op mogelijke suppressors. Het kloon schema moet het mogelijk maken het Effector-eiwit in beeld te hebben met de promotor van de gal en zijn tag. De Chlamydia trachomatis inclusie membraan proteïne CT229 werd gebruikt als een bewijs van principe voor deze testen.

  1. Gebruik PCR om CT229 te versterken uit C. trachomatis genomische DNA volgens de instructies van de fabrikant met behulp van CT229 + 1 KPN F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) en CT229 Xhoi R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGATGCC) primers. Gebruik de volgende PCR-voorwaarden: (1) 98 °C gedurende 30 sec.; (2) 98 °C gedurende 10 s, 55 °C gedurende 30 sec., 72 °C gedurende 2 min; (3) Herhaal stap 2 voor een totaal van 25x; (4) 72 °C gedurende 10 min; en (5) 4 °C vasthouden.
  2. Analyseer 5 μL van het PCR-product op een 1% agarose-gel (Figuur 1).
  3. Reinig de resterende 45 μL DNA met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Verteren de 50 μL gezuiverde PCR-wisselplaat en pYesNTA-kan (Figuur 2) gedurende 1 uur bij 37 °c in een waterbad met KpnI-HF en xhoi-HF.
    Opmerking: voor pYesNTA-kan, Digest 5 μg plasmide met 5 μL KpnI-HF, 5 μl XhoI-HF, en 6 μL buffer in een totaal volume van 60 μL. Verteren voor de wisselplaat het gehele 50 μL gezuiverde PCR-product met 2 μL KpnI-HF, 2 μL XhoI-HF en 6 μL buffer.
  5. Voer de hele plasmide Digest uit op een 1% agarose gel. Voer de zuivering van het verteerde plasmide uit met behulp van een gel-extractie Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Reinig de verteerde PCR-wisselplaat met behulp van een PCR-reinigingsset volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Kloon de insert in pYesNTA-kan met 2 μL pYesNTA-kan (stap 2,5), 2 μL DNA-ligase buffer, 1 μL T4 ligase en 15 μL wisselplaat (stap 2,6). Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  8. Voeg de volledige kloon reactie toe aan 50 μL E. coli competente cellen en voer de transformatie reactie uit.
  9. Plaat de volledige transformatie reactie op een LB-plaat met 100 μg/mL carbenicilinin.
  10. Inoculeren 10 mL van de LB met 100 μg/mL carbenicileen met drie individuele kolonies. Incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 150 rpm.
  11. Isoleer het plasmide met een plasmide miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  12. Sequentie van de geïsoleerde plasmiden met behulp van genspecifieke primers (stap 2,1).

3. test het eiwit van belang voor toxiciteit in gist

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 op ypd agar (stap 1,3) om geïsoleerde kolonies te verkrijgen. Incuberen bij 30 °C gedurende 24 uur.
  2. Inoculeren 10 mL YPD Bouillon (stap 1,4) met één kolonie uit de agar plaat (stap 3,1). Incuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm 's nachts.
  3. Voeg 0,5 mL van de overnachtings cultuur toe aan 10 mL YPD Bouillon (stap 1,4) en inincuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm gedurende 4 uur.
    1. Pellet de 10 mL cultuur bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
    2. Regeer de pellet in 1 mL steriel water, breng over naar de microcentrifuge buis en pellet bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    3. Respendeer de pellet in 1 mL van 1 mM Lithium acetaat (LiAc) en pellet bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    4. Herhaal de LiAc Wash 2x.
    5. Verwijder de wassing. Respendeer de pellet in 2,4 mL 50% PEG 3350. Voeg 360 μl van 1M LiAc, 500 μL van 2 mg/ml haring sperma DNA en 400 μl steriel water toe.
      Opmerking: dit is voldoende voor 20 transformaties.
    6. Voeg 180 μL van de transformatie combinatie van stap 3.3.5 toe aan een micro centrifugebuis met 5 μL pYesNTA-kan CT229 plasmide DNA (100 − 500 ng) uit stap 2,12.
    7. Inbroed in een waterbad van 30 °C gedurende 30 minuten.
    8. Inincuberen in een waterbad van 42 °C gedurende 30 minuten.
    9. Pellet bij 3.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    10. Verwijder de transformatie combinatie met de pipet. Respendeer de pellet in 100 μL steriel water. Plaat de transformatie op SD Ura- agar met glucose (stap 1,5).
    11. Incuberen de platen bij 30 °C gedurende 48 uur.
  4. Inoculeren 5 mL SD Ura- bouillon met glucose (stap 1,7) met een enkele kolonie van de plaat. Inincuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm. Omvatten gist getransformeerd met de vector alleen als een negatieve controle.
    1. Voeg 180 μL steriel water toe aan 5 putjes van een 96 putplaat (a2 − A6).
    2. Vortex de nachtelijke cultuur om te mengen.
    3. Voeg 180 μL gist toe aan de eerste put (a1). 1:10 (zes monsters in totaal inclusief onverdund) verdunnen.
    4. Spot met een multikanaalspipet 5 μL van elke verdunning op SD Ura- glucose (stap 1,5) en Ura-galactose (stap 1,6) agar- platen. Incuberen bij 30 °C gedurende 48 uur.
  5. Beoordeling van de toxiciteit door vergelijking van de groei van de gist die de Effector eiwit van belang geteeld op de galactose-bevattende media aan de groei van gist alleen uitdrukken van de vector.
  6. Bevestig de uitdrukking van de his-tag Fusion-proteïne door Western blotting.

4. Transformeer giftige gist met de gist genomische Library

  1. Inoculeren 100 mL SD Ura- glucose Bouillon (stap 1,7) met 1 ml van de kolf uit stap 3,4. Incuberen 16 − 24 uur bij 30 °C met schudden bij 150 rpm. Plaats 900 mL SD Ura- glucose Bouillon bij 30 °c 's nachts om de media vooraf te verwarmen.
  2. Voeg de hele 100 mL van de nachtelijke kweek toe aan de voorverwarmde kolf van 1 L. Inbroed voor 4 − 5 uur bij 30 °C met schudden bij 150 rpm.
    1. Pellet de cultuur bij 6.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
    2. Gooi het supernatant weg. Rebreng de pellet in 250 mL steriel water. Pellet de cultuur bij 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    3. Gooi het supernatant weg. Respendeer de pellet in 250 mL LiAc van 1 mM. Pellet de cultuur bij 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    4. Verwijder LiAc en rebreng de pellet in 9,6 mL 50% PEG 3350. Voeg 1,44 mL van 1M LiAc, 2 mL van 2 mg/mL haring sperma DNA, 50 μg van de pYep13 genomische Library (ATCC 37323). Stel het volume in op 15 mL met steriel water. Meng zachtjes door inversie.
    5. Inbroed in een waterbad van 30 °C gedurende 30 minuten.
    6. Voeg 750 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe om de efficiëntie van de transformatie te verbeteren. Inincuberen in een waterbad van 42 °C gedurende 30 min. Meng elke 10 min door zachte omversie.
    7. Pellet de gist op 3.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
    8. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 10 mL steriel water. Pellet bij 3.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
    9. Rebreng de pellet in 8 mL steriel water.
    10. Om de transformatie-efficiëntie te bepalen, Verdun 1:10 en plaat 100 μL van elke verdunning op SD Ura- Leu- glucose agar (stap 1,8).
    11. Plaat 200 μL van het monster op SD Ura- Leu- galactose agar (stap 1,9) platen. Gebruik 50 platen in totaal.
    12. Incuberen bij 30 °C gedurende 48 − 96 uur of totdat er kolonies verschijnen.
      Opmerking: kolonies worden over het algemeen op glucose agar-platen op 48 − 72 uur en galactose-agar-platen weergegeven bij 72 − 96 uur.
  3. Patch kolonies (mogelijke Rescues) op SD Ura- Leu- galactose agar (stap 1,9) om uit te breiden en voorraad te maken. Incuberen bij 30 °C gedurende 24 − 48u.
  4. Inoculeren 5 mL SD Ura- Leu- glucose Bouillon (stap 1,10) met behulp van het deel van de pleister. Inincuberen bij 26 °C met schudden bij 150 rpm.
    1. Voeg 180 μL steriel water toe aan 5 putjes van een 96 putplaat (a2 − A6).
    2. Vortex de nachtelijke cultuur om te mengen.
    3. Voeg 180 μL gist toe aan de eerste put (a1). 1:10 (zes monsters in totaal inclusief onverdund) verdunnen.
    4. Spot met een multikanaalspipet 5 μL van elke verdunning op SD Ura- GLUCOSE en SD Ura-galactose agar- platen. Giftige Effector alleen als een controle opnemen.
    5. Incuberen bij 30 °C gedurende 48 uur.
  5. Vergelijk de groei van de gist die de toxische Effector alleen uitdrukt op gist die de mogelijke suppressors bevat. Ga alleen verder met potentiële suppressors die verminderde toxiciteit hebben in vergelijking met de gist die de Effector alleen uitdrukt.

5. Identificeer en bevestig suppressors

  1. Inoculeren 5 mL SD Ura- Leu- glucose Bouillon (stap 1,10) met 100 μL gist uit stap 4,4 en incuberen 's nachts bij 30 °c met schudden bij 150 rpm.
    1. Pellet de gist op 3.000 x g gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet.
    2. Isoleer het plasmide met een gist plasmide miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Transformeer de geïsoleerde plasmide in de E. coli competente cellen en plaat de hele transformatie op lb agar met 100 μg/ml carbenicileen. Incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur.
  3. Inoculeren 10 mL LB Bouillon bevattende 100 μg/mL carbenicileen, met drie kolonies van de plaat en incuberen bij 37 °C 's nachts met schudden bij 150 rpm.
    1. Pelletculturen bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Isoleer plasmide met een miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Hertransformeer de giftige gist met de geïsoleerde plasmiden uit stap 5.3.1 volgens de stappen in deel 3 van het protocol.
    1. Inoculeren 5 mL SD Ura- Leu- glucose bouillon met een kolonie van de transformatie plaat. Inincuberen bij 30 °C met schudden bij 150 rpm.
    2. Plaats op Ura- Leu- glucose en galactose agar om de onderdrukking van toxiciteit te bevestigen.
  5. Volgorde met behulp van pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) en pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) primers om te identificeren van gist-Orf's.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voordat de werkelijke gist suppressor scherm kan worden uitgevoerd, de Effector eiwit van belang moet worden getest op toxiciteit in gist. Dit wordt bereikt door het uiten van het eiwit van belangstelling voor gist onder de controle van een galactose-inducible promotor. Groei van glucose (niet-inducerende voorwaarden) moet eerst worden vergeleken om ervoor te zorgen toxiciteit is specifiek te wijten aan de uitdrukking van het eiwit van belang en is niet een algemeen defect. Zoals weergegeven in Figuu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst stapsgewijze procedures voor het identificeren van de gastheer biologische trajecten die zijn gericht door bacteriële Effector eiwitten met behulp van een gemodificeerde gist toxiciteit en suppressor scherm. De gebruikte gist stam, S. cerevisiae W303, is auxotrofische voor zowel uracil als leucine. Uracil auxotrophy van de stam wordt gebruikt om gist te selecteren die het eiwit van belangstelling draagt op de pYesNTA-kan vector, terwijl Leucine auxotrophy wordt gebruikt om te selecteren voor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Shelby Andersen, Abby McCullough en Laurel Woods voor hun hulp bij deze technieken. Deze studie werd gefinancierd door opstart fondsen van het departement van de Universiteit van Iowa van microbiologie en immunologie aan Mary M. Weber.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher ScientificBP2641500
GalactoseMilliporeSigmaG0750-1KG
GeneJet Gel extraction kitThermoFisher ScientificK0691
GeneJet PCR purification kitThermoFisher ScientificK0701
GeneJet plasmid miniprep kitThermoK0503
GlucoseMilliporeSigmaG8270-1KG
Herring Sperm DNAPromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Lithium acetate dihydrateMilliporeSigmaL6883-250G
PeptoneFisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(ethylene glycol) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S
TryptophanMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S
Yeast extractFisher ScientificBP1422-500
Yeast miniprep kitZymoD2001
Yeast nitrogen base without amino acidsMilliporeSigmaY0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium SupplementsMilliporeSigmaY1501-20Gzonder uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium SupplementsMilliporeSigmaY1771-20Gzonder uracil, leucine, tryptofaan

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles