Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Summary

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Abstract

Elektronatting is het effect waarmee de contacthoek van een druppel die aan een oppervlaktelading wordt blootgesteld, wordt gewijzigd. Elektrowetting-on-diëletrische (EWOD) maakt gebruik van de diëlektrische eigenschappen van dunne isolatorfilms om de ladingsdichtheid te verbeteren en zo het elektrowetting-effect te stimuleren. De aanwezigheid van lasten resulteert in een elektrisch geïnduceerde verspreiding van de druppel die doelbewuste manipulatie over een hydrofoob oppervlak mogelijk maakt. Hier demonstreren we ewod-gebaseerd protocol voor monsterverwerking en detectie van vier categorieën antigenen, met behulp van een geautomatiseerd platform voor oppervlaktebediening, via twee varianten van een Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methoden. De ELISA wordt uitgevoerd op magnetische kralen met geïmmobiliseerde primaire antilichamen die kunnen worden geselecteerd om een specifiek antigeen te richten. Een antilichaam dat aan HRP wordt geconjugeerd bindt aan het antigeen en wordt gemengd met H₂O₂/Luminol voor kwantificering van de gevangen ziekteverwekkers. Testvoltooiingstijden van tussen 6 en 10 min werden bereikt, terwijl minuscule volumes reagentia werden gebruikt.

Introduction

De voorgestelde methode heeft tot doel de geautomatiseerde monstervoorbereiding voor ELISA te vergemakkelijken met kwantitatieve detectie van antigenen met behulp van ewod-gebaseerde benadering met digitale microfluidica (DMF) en magnetophoretische scheiding. Voor meerdere biologische toepassingen is aangetoond dat DMF in combinatie met magnetophorese een interessant alternatief is voor vloeistofbehandelingstoepassingen¹. Meer in het bijzonder is de opsporing van ziekteverwekkers een impliciet aspect in veel sectoren, variërend van gezondheidszorg² tot landbouw en milieu^3,4 tot nationale veiligheid⁵. Een detectietechnologie die in staat is de bedreigingen van ziekteverwekkers aan te pakken, moet beschikken over een hoge doorvoer (bijvoorbeeld korte testtijd), efficiëntie (lage detectielimiet – LoD – en hoge gevoeligheid) en specificiteit (voor het type doelpathogene ziekteverwekker) om functioneel te zijn⁶.

Voorheen is EWOD-gebaseerde DMF met succes geïmplementeerd voor Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), detectie van een antibioticaresistente ziekteverwekker (Methicilline-resistente Staphylococcus aureaus of MRSA), M.pneumonia en C.albicans met behulp van een low-budget, print-circuit-board chip en magnetophorese⁷. De techniek werd ook toegepast voor de detectie van deoxyribonucleic zuur (DNA) mutaties door middel van pyrosequencing en chemiluminescente detectie⁸. EWOD-gebaseerde platforms breiden hun functionaliteit ook uit naar immunoassay-toepassingen, waardoor gelijktijdig monsterherstel en -detectie mogelijk zijn, allemaal binnen één geïntegreerd platform. Zo werd een enkel EWOD-chipontwerp met succes gedemonstreerd met een DMF-platform voor point-of-care-testen voor beide op kraalgebaseerde immunoassays van cardiale troponine I uit een bloedmonster en als apart experiment RT-PCR voor MRSA-detectie². Die chip maakt gebruik van olie-vuller, die verdamping van de druppels voorkomt en vergemakkelijkt de betrouwbare geautomatiseerde manipulatie van nanoliter volumes. Veelzijdige biotoepassingen werden onderzocht met de implementatie van soortgelijke DMF-benaderingen voor kwantitatieve homogene en heterogene immunoassays^9,10 inclusief het ontwerp van experimenten (DoE) studies voor testparameteroptimalisatie¹¹.

Ondanks de duidelijke verdiensten voor het verwerken van intensivering als gevolg van minuscule werkvolumes, kan een met olie gevulde DMF-platform een uitdaging zijn en vereist een zekere mate van expertise om te werken. Oliegevulde systemen, omdat ze een gesloten onderdeel nodig hebben, zijn niet ideaal voor bepaalde toepassing in het veld waar systeemtransportbaarheid belangrijk is. Bovendien zou een op olie gebaseerd systeem zeer moeilijk, zo niet onmogelijk te gebruiken zijn voor sommige specifieke toepassingen die gebruik maken van de verzameling van droog materiaal op een oppervlak zoals voorgesteld door Zhao en Cho¹², Jönsson-Niedziółka et al.¹³, en Foat et al.¹⁴. Olievrije systemen zijn daarentegen eenvoudig te integreren en hebben het voordeel dat ze een eenvoudige chip-to-chip monstervertaling bieden. Om deze redenen werd de voorgestelde methode ontwikkeld om een immunoassay op basis van EWOD op DMF te verstrekken die geen olie nodig zou hebben, waardoor de werking van het apparaat effectief werd vereenvoudigd.

In deze bijdrage rapporteren we over het gebruik van een op maat gemaakt, vrijstaand, volledig geautomatiseerd DMF-platform voor immunoassays, en werken we het protocol voor de snelle detectie van biomoleculen uit, namelijk: eiwitten, vegetatieve bacteriën, bacteriële sporen en virussen. Combinatie van EWOD-chip met magnetische deeltjes voor geautomatiseerde monstervoorbereiding en immunoneerslag is al aangetoond met een extra off-line MS-meting¹⁵. Onlangs, in-field diagnostische tegen mazelen en rodehond IgG is aangetoond in afgelegen Noordwesten Kenia's bevolking door de Wheeler groep¹⁶. Zowel Wheeler's als ons systeem, die transporteerbaar, op zichzelf staand, volledig geautomatiseerd met meegeleverde on-chip, real-time chemiluminescentmetingen behoren misschien wel tot de meest geavanceerde DMF biodetectiesystemen die beschikbaar zijn.

De twee systemen zijn ontworpen met zeer verschillende toepassingen in het achterhoofd. Wheeler's systeem richt zich op biomarker om biomedische diagnostiek bij patiënten mogelijk te maken, terwijl ons biodetectiesysteem is gebouwd rond de defensie-eis voor directe detectie van ziekteverwekkers die eerder uit de lucht werden bemonsterd. De overeenkomst tussen de twee is het onderliggende principe van druppelactuatie, dat het brede scala van levensbeïnvloedende sectoren aantoont die de op ewod-gebaseerde technologie kan beïnvloeden. Namelijk, de DMF-gebaseerde detectie platform en bijbehorende EWOD systeem zou kunnen vinden belangrijke implicatie in de gezondheid (biomedische diagnostiek); militaire en civiele bescherming (dreigingsdetectie); Agri-tech (gewasmonitoring) en arbeidsveiligheid (gecontroleerde milieubewaking)

De prestaties van ons DMF-platform worden beoordeeld aan de hand van volledig geautomatiseerde detectie van menselijke serumalbumine (HSA, een bolvormig eiwit), Escherichia coli (E. coli, een vegetatieve bacterie), Bacillus atrophaeus (BG, een bacteriële spore) en MS2 (een bacteriofaagvirus). Wat nog belangrijker is, is de voorgestelde Methode DMF uiterst veelzijdig in de betekenis dat de vangstantilichamen zouden kunnen worden geruild om de opsporing van andere antigenen te richten verschillend van vier die in dit artikel worden overwogen. Afgezien van de antilichaam-gebaseerde sensing volledig, de DMF platform zou kunnen bouwen aan een potentiële toepassing op basis van aptamer biosensing, waar de magnetische kralen voeren specifieke aptamers voor het vastleggen en / of detectie van nucleotiden. Het ontwerp en de realisatie van de verschillende componenten die het geïntegreerde, volledig op zichzelf staande DMF-platform vormen, inclusief de hoogspanningsgolfgenerator en aandrijfelektronica wordt elders bekendgemaakt⁶.

Protocol

1. Inleidende stappen die nodig zijn voor de test

OPMERKING (BELANGRIJK): Alle voorbereidende stappen moeten in een steriele omgeving worden uitgevoerd om besmettingen te voorkomen. Natriumazide mag niet worden gebruikt voor opslag, omdat het de activiteit van het mierikswortelperoxidase (HRP)-enzym zou remmen.

1. Bereid loopbuffer (100 mM HEPES, pH 7.5), met behulp van de (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfoonzuur, en voeg Tween 80 toe aan een concentratie van 0,01% (v/v).
2. Immobiliseer de primaire antilichamen (vangantilichamen) op het oppervlak van de door de NHS geactiveerde magnetische microbeads door het door de leverancier verstrekte protocol te volgen. Kortom, het Magnetic IP/Co-IP Kit(Table of Materials)protocol omvat de volgende stappen.
   1. Aliquot 0,2 mL kralen (2 mg) in een plastic buis en verwijder de supernatant.
   2. Was de kralen door 1 mL ijskoud 1 mM HCl toe te voegen.
   3. Bind het geselecteerde antilichaam (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyklonale, Rbanti-E.coli MRE 162 polyklonale of Geitenanti-MS2 polyklonale), 40 μg/mL in 67 mM Borate Buffer, covalently aan de kralen voor 1 uur met schudden bij 37 °C. Tabel 1 bevat de lijst van alle antilichamen die met het huidige protocol worden gebruikt en de antigenpathogenen⁶.
   4. Was de ongebonden antilichamen twee keer met 0,8 mL Elution Buffer.
   5. Blus de reactie met 1 mL Quenching Buffer gedurende 1 uur.
   6. Was de kralen één keer met Modified Borate Buffer en één keer met IP Lysis/Wash Buffer.
   7. Zet de kralen opnieuw op in 0,5 mL IP Lysis/Wasbuffer en bewaar op 4 °C tot het nodig is voor gebruik.
      OPMERKING: Voor de beste resultaten wordt een verse partij microbeads gekoppeld aan de antilichamen de dag voor de EWOD-isolatie en ELISA on-chip. De microbeads die aan het primaire antilichaam zijn gekoppeld, kunnen echter tot één maand bij 4 °C worden opgeslagen. Als er agglomeratie optreedt, tikt u op het flesje om het neerslag te breken en de kralen in de oplossing opnieuw op te schorten.
   8. Blokkeer de microbeads 's nachts met het gekoppelde antilichaam, met behulp van de eindconcentratie 4 mg/mL voor de microbeads, in een Blocker Casein (1% w/v) in 100 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: De blokkeringsstap wordt altijd uitgevoerd de dag voor de biodetectietestrun.
   9. Scheid de kralen van de Blocker Casein met behulp van een magneet en verwijder de supernatant.
   10. Resuspend in 1 mL loopbuffer en meng gedurende 1 min.
   11. Scheid de kralen met behulp van de magneet en verwijder de supernatant.
   12. Herhaal de bovenstaande waszetten (1.2.10 en 1.2.11) tweemaal.
       OPMERKING: Drie wasstappen zijn voldoende om de hechting van de kralen aan het oppervlak te verminderen en het vrije verkeer van de druppel te vergemakkelijken.
   13. Resuspend de kralen in de loopbuffer bij een concentratie van 2,5 mg/mL. Deze oplossing van microbeads is klaar voor gebruik met de EWOD chip.
3. Bereid een oplossing van de neutravidin geconjugeerde mierikswortel peroxidase (HRP) en de secundaire biotinylated antilichaam tot een definitieve concentratie voor elk van 1 μg/mL in Running Buffer (gebruikt voor BG detectie⁶).
   OPMERKING: Om de antigenen(tabel 1) te targeten, zijn verschillende concentraties van secundair biotinylated antilichaam, variërend van 0,5 tot 4,0 μg/mL, met succes getest.
4. Meng gelijke volumes van de Luminol met waterstofperoxide oplossing net voor het uitvoeren van de test
   OPMERKING: Luminol wordt gebruikt om het aantal bindende gebeurtenissen te kwantificeren op basis van het HRP-enzym dat covalently gebonden is aan het secundaire antilichaam dat zich richt op het antigeen (bijvoorbeeld ziekteverwekker). Echter, verschillende rapportage molecuul en strategieën kunnen worden gebruikt voor detectie¹⁷ in plaats van de chemiluminescence en Luminol.

2. Productie en oppervlaktebehandeling van de EWOD-chipcomponenten

OPMERKING: De EWOD-chip bestaat uit een actuatieplaat met gedessineerde chroomelektroden om de schijnbare contacthoek van een druppel en een afdekplaat af te wisselen om de hoogte van druppels te definiëren.

1. Teken het ontwerp van de elektroden en connectoren in 2D met behulp van standaard CAD-software. Vermeld ook het afvalopvangplatform met afmetingen van 5 x 5 mm² om de gebruikte oplosmiddelen op te slaan (figuur 1).
   OPMERKING: Om de druppels te manipuleren gebruiken we 47 elektroden, elk met afmetingen van 1,7 x 1,7 mm^2. Deze elektrodegrootte biedt plaats aan druppelvolumes variërend van 1,5 μL tot 3 μL (voor een gat van 500 μm). Uit ervaring is bij het werken met een gat van 500 μm 1,5 μL de minimale druppelgrootte die kan worden bediend. Het komt ruwweg overeen met de druppel (geprojecteerde) contour wordt omschreven aan de vierkante pad. Er is echter geen theoretische limiet in andere grootte dan veroorzaakt door de weerstand (wrijving) van het lichaam van vloeistof. Niettemin wordt aanbevolen dat het volume niet meer dan 3 μL bedraagt voor betrouwbare bediening met behulp van een gat van 500 μm. De elektroden worden aangepakt door 48-kanaals elektronica.
   OPMERKING: De ontwerpafmetingen en -afmetingen van de pads kunnen variëren afhankelijk van de beoogde volumes en de laboratoriumunitoperaties (LuOs) die het protocol omvatten.
2. Stuur de ontwerptekening naar een maskerproductieservice voor het afdrukken van het chroommasker op een glazen substraat. De dikte van de chroomlaag is 100 nm.
   OPMERKING: De chroomlaag op het fotomasker dat wordt gebruikt als substraat voor de EWOD-chip is per definitie ondoorzichtig. Het ontwerp van elk van onze elektroden omvat een rasterlay-out om semi-transparantie te garanderen.
3. Snijd de plaat op maat van 56 x 56 mm² met een precisie CNC Dicing/Cutting Saw.
4. Plak plak plak plak tape over de elektrische contacten om ze te isoleren tijdens de twee coating stappen.
5. Bedek de plaat chroomglasplaat met een diëlektrische laag door 6 μm Paryleen-C op het oppervlak te deponeren. Het Gorham-proces¹⁸ wordt gebruikt met 7,4 g DPX-C in een Paryleen depositiesysteem (Tabel met materialen).
6. Spin-coat amorfe fluorpolymeren (Tabel van materialen) met behulp van een spin-coater bij 1500 rpm voor 30 s op de top van de plaat en bak het op 140 ° C voor 30 min.
   LET OP: Dit maakt het oppervlak hydrofoob. Men kan valideren of de coating met succes is afgezet door een druppel water op het oppervlak te plaatsen. De contacthoek tussen de druppel en de plaat moet zich in het gebied van 110º bevinden.
7. Verwijder de plakband van de elektrische contacten.
8. Spin-coat amorfe fluorpolymeren (Tabel van materialen) met behulp van een spin-coater bij 1500 rpm voor 30 s op de top van de 4-in silicium wafer en bak het op 140 ° C voor 30 min.
   OPMERKING: Het is belangrijk dat zowel de oppervlakken van de actuatie als de afdekplaten hydrofoob zijn om een soepele beweging van de afzonderlijke druppels tijdens de test te vergemakkelijken.

3. Laden, monteren en bediening van de EWOD-chip op het DMF-platform

OPMERKING: De EWOD-chip werkt met behulp van parallelplaatconfiguratie met een precies gedefinieerde opening 0,5 mm tussen de aanzetplaat en de geleidende, geaarde afdekplaat. Deze sandwich assemblage wordt beschreven in het huidige gedeelte.

1. Haal het deksel van het DMF-platform⁶ en leg het op de bank.
   OPMERKING: Een donkere Kooikamer van Faraday is nodig om strooilicht en elektromagnetische interferentie tijdens de detectie te voorkomen. Er is geen vergrendeling op het deksel, vandaar dat het platform ons in staat stelt om de beweging van druppels te observeren.
2. Plaats een schone aanzetplaat op het draaiende stadium, chroom naar boven gericht. De plaat moet worden uitgelijnd met de linkerbovenhoek van de verzonken fase (figuur 2A).
3. Klem de aanzetplaat van boven met behulp van het paneel met de 47 contactpennen. Dit zet de plaat op zijn plaats en vergemakkelijkt uitlijning met de contactpennen.
4. Leg de 0,5 mm shim en de 2 mm polymethylmethacrylaat (PMMA) separator op het draaiende stadium, om een gecontroleerde kloof tussen de aanlegging en de afdekplaten te bieden.
   OPMERKING: Optioneel kan het afvoerende papier op het afvalverwijderingsstootkussen worden geplaatst alvorens de druppeltjes vóór de volgende stap te aliquoting. Naarmate de test vordert, wordt het afval direct opgenomen in het papier dat aan het einde van de test kan worden verwijderd.
5. Laad de druppels op de voorgestelde laadblokken(figuur 1).
   1. Aliquot vier 2,5-μL druppels uit de running buffer op de B-, A-, R-, E-denoted pads, een druppel op elk pad.
   2. Aliquot 2,5 μL luminol:H₂O₂ (1:1, v/v) oplossing op het D-denoted pad.
   3. Aliquot 2,5 μL Neutravidin geconjugeerd aan HRP (1 μg/mL) op het F-denoted pad.
   4. Aliquot 2,5 μL biotinylated secundair einerlichaam (1 μg/mL) op het G-denoted pad.
   5. Aliquot 2,5 μL microbeads met geconjugeerd primair antilichaam (2,5 mg/mL) gaat naar I-denoted pad.
   6. Aliquot 2,5 μL van het onbekende monster op c-aangeduide pad.
      OPMERKING: Het voorgestelde laadpatroon is slechts één voorbeeld van een experimentele lay-out, maar het laadpatroon kan worden gewijzigd om aan de behoeften van de gebruikers te voldoen, zolang deze wijzigingen overeenkomen met de volgorde die in de software is gedefinieerd (Aanvullend bestand 1).
6. Plaats de afdekplaat op het oppervlak van het tuig, naast de ronde uitsparing gebied, en schuif het lateraal in de uitsparing en op de top van de actuatieplaat (figuur 2B).
7. Leg de permanente magneet op de afdekplaat en zet deze vast door de twee vergrendelingen(figuur 2C)te schuiven.
8. Draai het werkgebied met 180° en controleer visueel of de geladen druppels nog op hun plaats zijn(figuur 1C).
   OPMERKING: Men moet in staat zijn om de positie en de vorm van druppels oog bol door de transparante fase en de achterkant van de actuatie plaat(figuur 2D). De test is klaar om te draaien als ronde druppels kunnen worden gezien op de top van de lading elektrode pads. In het geval, een druppel wordt verplaatst kan men de magneet en de dekplaat te verwijderen, dan herstellen van de verplaatste druppel met een schone pipet en zet het opnieuw op het laadpad.
9. Controleer of de laadpositie voor elke druppel overeenkomt met de geprogrammeerde actuatievolgorde in de software (zie Aanvullende file 1 voor meer informatie over de software).
   OPMERKING: Om de positie van de druppels visueel te kunnen controleren, moet de fotodetector worden gedemonteerd(figuur 2D).
10. Plaats de fotodetector gescreend "kan" in de sleuf van de roterende fase.
    OPMERKING: Het fotodetectiesysteem draait rond een fotodiode, dat een groot verzamelgebied heeft (10 x 10 mm²) om de lichtcollectie te maximaliseren zonder extra optiek, plus een trans-impedantieversterker om ruis te minimaliseren⁶. Het systeem is echter uiterst gevoelig en kan minieme signalen verzamelen. Om het geluidsniveau te verminderen, werden een aantal op elektronica gebaseerde strategieën geïmplementeerd (bijvoorbeeld het fotodetectiesysteem werd beschermd door het in een Kooi van Faraday te plaatsen, een metalen behuizing die bekend staat als een gescreende "kan").
11. Sluit de kabel aan op de fotodetector gescreend "kan".
    LET OP: Zodra de EWOD-chip is uitgelijnd met de fotodetector, is het DMF-platform volledig geassembleerd en is het nu klaar om te werken.
12. Plaats het deksel over het DMF-platform en start de programmareeks met behulp van de software-interface ontwikkeld aan de Universiteit van Hertfordshire.
    OPMERKING: Extra software wordt gebruikt voor het lezen en registreren van de luminescentie van de druppel als functie van de tijd in een CSV-bestand (zie Aanvullend bestand 2).
    1. Zorg ervoor dat de geprogrammeerde reeks (zie Aanvullende File 1)op de interface promptberichten verschijnen om de operator te informeren dat "De luminoldruppel klaar is om de geëxtraheerde magnetische kralen te verzamelen" of "De detectiedruppel is klaar om naar de detectieplaats te worden verplaatst." In beide gevallen is een bevestiging van de operator vereist om door te gaan met de volgorde.

4. Werken in visuele modus (optioneel voor optimalisatie van protocollen)

OPMERKING: Indien gewenst, om elke druppelgebaseerde bewerking te visualiseren, kan de test worden uitgevoerd door stappen 3.10-3.12 over te slaan en te vervangen door de volgende bewerkingen.

1. Start de programmareeks met behulp van de software-interface.
   OPMERKING: De druppelbeweging kan worden waargenomen tijdens het werken in de visuele modus, wat handig is tijdens protocoloptimalisatie. Ten eerste, om de reproduceerbaarheid van de magnetische scheiding operatie te controleren. Bijvoorbeeld, als de hoeveelheid kralen gebruikt is te laag, de magnetische scheiding zal niet optreden, vice versa, als de hoeveelheid kralen te hoog is, kan de druppel worden geïmmobiliseerd door de kraal pellet. Ten tweede, om de betrouwbaarheid van een nieuwe test vast te stellen als sommige druppel formulering kan leiden tot actuatie stoornis die kan worden gedetecteerd door observatie.
2. Monteer de fotodetector gescreend "kan" in de spleet van de roterende fase, wanneer gevraagd.
3. Sluit de kabel aan op de gescreende fotodetector "kan", door de pinnen in het stopcontact in te steken.
4. Plaats het deksel over het DMF-platform en hervat de test.
   OPMERKING: Gebruik de aanvullende software voor het lezen en vastleggen van de luminescentie van de druppel als functie van de tijd in een CSV-bestand (zie Aanvullend bestand 2)

5. Het verwijderen van vloeibaar afval en het reinigen van de chip

LET OP: Zorg ervoor dat de apparatuur is uitgeschakeld en losgekoppeld van stroombronnen (computer, hoofd) voorafgaand aan het schoonmaken. Draag handschoenen, een lab jas en bril beschermend glas (PPE) bij het verwijderen van biologische monsters van de chip!

1. Open het DMF-platformdeksel en draai het podium 180° om toegang te krijgen tot de elektroden en de gebruikte oplosmiddelen op de aanhefplaat.
2. Los de magneetbehuizing los, verwijder de magneet uit het draaiende stadium en plaats deze op de bank.
3. Verwijder de dekplaat, siliciumwafer, uit de spleet met een pincet, spoel het af met DI-water, droog het met perslucht en plaats deze in een petrischaaltje, waar de wafer kan worden opgeslagen en hergebruikt.
4. Gebruik een micropipet om het vloeibare afval van het pad te verplaatsen zonder het oppervlak aan te raken.
5. Maak het oppervlak schoon door de vloeistof van de aanbakplaat af te voeren met absorberend papier (filtermateriaal).
   OPMERKING: Het intact houden van het oppervlak verhoogt de levensduur van de aanzetplaat, waardoor meerdere toepassingen mogelijk zijn.
6. Maak de aanzetplaat schoon door het oppervlak van de elektroden voorzichtig te vegen met een schone DI waterdruppel met behulp van een schone pipet. Verwijder vervolgens de druppel met rietpapier (filtermateriaal).
   LET OP: Gooi de weefsels, papieren, pipetten tips en handschoenen die zijn besmet met biologisch materiaal in de bio-afval bak.
7. Gebruik de actuatieplaat voor een andere test of verwijder deze van het DMF-platform voor opslag of recycling.

Results

Actuatie spanning impact werd onderzocht om te verduidelijken wat de optimale omstandigheden waren om de testen uit te voeren. Een druppel uit de buffer werd aangedreven bij verschillende actuatiespanningen en de beweging werd geregistreerd. De bevindingen toonden aan (figuur 3) een correlatie bestond tussen de wortel gemiddelde vierkante actuatie spanning (V_rms) en de gemiddelde snelheid. Echter, de levensduur van een actuatie plaat werd verminderd wanneer hoge waarden voor V_rms werden gebruikt. Op basis van deze resultaten werd 105 V_rms gekozen als standaard actuatiespanning, 120 V_rms bleek het beste te werken voor de H₂O₂/Luminol druppel en 165 V_rms werd geïmplementeerd voor de extractie LUO. Deze spanningen werden opgenomen in de geautomatiseerde programmeringsvolgorde (Aanvullend Bestand 1).

Twee immunoassays (figuur 4) werden met succes getest met behulp van de EWOD-chip met het DMF-platform voor vier verschillende ziekteverwekkers (Tabel 1). De EWOD-chip vergemakkelijkte de opeenvolgende beweging van de druppels van de laadblokken naar het menggebied en uiteindelijk naar het afval. Er waren twee basisLU's die werden herhaald in het protocol om ELISA te voltooien. De eerste was de extractie LUO; hier kort beschreven, de druppel met de zwevende kralen werd gereden naar de scheidingsplaats in het midden van de mengzone, de magneet werd automatisch geactiveerd om de chip te benaderen en de magnetische kralen te bundelen in een pellet (Figuur 5). Vervolgens werd de druppel verplaatst naar het afvalpad, waardoor de kralen op de actuatieplaat, waardoor de extractie LUO. Mengen was de volgende belangrijke LUO die plaatsvond op de EWOD-chip. Het analytmonster met een onbekende concentratie van ziekteverwekkers werd door elektroplassen op de kralen gebracht. Vervolgens werden de kralen opnieuw opgehangen door het verplaatsen van de druppel met de samengeklonterde kralen over het menggebied (10 pads in totaal). Deze twee LuOs waren essentieel omdat ze een geminiaturiseerde, snelle en reproduceerbare monsterverwerking faciliteerden met opeenvolgende detectie van de ziekteverwekkers in 6 tot 10 min. Figuur 6 toont de volledige opeenvolging van LuOs uit een immunoassay die met de EWOD-chip wordt bereikt.

Om aan de gewenste automatiseringsniveaus te voldoen, kunnen variaties in het protocol worden geïntroduceerd. Zo werden de kralen gescheiden van de antigeen uitgeputdruppel, die vervolgens werd overgebracht naar het afvalpad, het herhalen van de basisextractie LUO. In dit stadium kan het protocol vertakken, afhankelijk van of het detectie-antilichaam al aan de HP was vervoegd, waarbij in totaal in totaal acht LuOs werden gebruikt voor de detectie van de verschillende antigenen (figuur 7A-C). In deze gevallen werd de druppel met het detectieantilichaam naar de kralen gebracht en vervolgens gemengd door actuatie. Als alternatief kan het binden van het detectieantilichaam aan de Conjugaat Neutravidin-HRP achtereenvolgens ter plaatse op de EWOD-chip worden uitgevoerd, zoals werd aangetoond voor de kwantificering van E. coli (figuur 7D). Beide protocollen, de acht- en tienstaps ELISA(figuur 4),leverden reproduceerbare detectie van antigenen op.

Incubatietijden en conjugaatconcentraties waren gevarieerd om experimenteel de optimale omstandigheden voor de test te vinden (figuur 7A). Vastgesteld werd dat de incubatietijd van 160 s en conjugaatconcentratie van 2 μg/mL de beste signaal-ruisverhouding bereikten met een toename van de signaalsterkte van 36% en vrijwel geen verandering in het achtergrondgeluidsniveau. Alle cijfers en gegevens die in de sectie representatieve resultaten werden gebruikt, werden gewijzigd van een eerder werk⁶.

Primaire / Capture antilichaam	Detectie antilichaam	Antigeen
Anti-Human Serum Albumin [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)	Mierikswortel Peroxidase (HRP) gelabeld anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438)	Human Serum Albumin (HSA, Abcam)
Rb anti-BG polyklonale	Biotinylated Rb anti-BG polyklonale	B. globigii (BG) sporen
Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonale	Biotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE polyklonale	E. coli MRE 162
Geit anti-MS2 polyklonale	Biotinylated Rb anti-MS2 polyklonale	MS2 bacteriofaagvirus

Tabel 1: Antigenen en antilichamen die met dit protocol zijn getest. Vier soorten pathogene antigenen werden gebruikt om de mogelijkheden van de EWOD-chip met het DMF-platform aan te tonen.

Figuur 1: Ontwerp van de EWOD-plaat. (a) Schematische notatie van de EWOD actuatieplaat met connectoren (vierkanten, Top) die (lijnen) zijn gekoppeld aan de elektroden (vierkanten, Bodem). Elk pad krijgt een nummer toegewezen en kan worden geadresseerd vanuit de softwarecode (Aanvullend bestand 1). De laadelektrodepads worden gemarkeerd door pijlen en aangeduid met een hoofdletter boven of onder elk pad. Een belangrijk kenmerk voor het DMF-platform is de mengzone bestaande uit tien pads (nr. 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Als visuele gids is de mengzone gemarkeerd met een rode rechthoek. b) Micrograaf van het microgrid-ontwerp van de pads. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Componenten en belangrijke fasen voor de digitale microfluidic system (DMF) assemblage. (A) Bevestig de EWOD-aanzetplaat, plaats de shim op het draaiende stadium en laad de druppels. B) Plaats de afdekplaat. (C) Monteer de magneetkast, maak de vergrendelingen vast en draai het podium 180°. (D) De automatische magneet wijst naar beneden. Inspecteer de positie en vorm van de druppels, controleer of de printplaat (PCB) pinnen zijn uitgelijnd met de contacten op de EWOD-chip, sluit de fotodetector aan en plaats deze in de fotodetectorsleuf. Na het aansluiten van de besturingselektronica op een computer, is het systeem klaar om de test uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Herhaaldelijk gebruik van de aanlokplaten en de impact op de aanloktijdsspanning. De gemiddelde snelheid van een druppel uit de lopende buffer wordt uitgezet als functie van de aanzetspanning (blauwe cirkels) en de standaardafwijking van drie onafhankelijke metingen (N = 3). Hier duidt het aantal testen per plaat (grijze staven) op het verbeterde verval van het oppervlak bij hogere spanningen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Diagram van de immunoassays getest met EWOD. Elke cirkel in dit diagram vertegenwoordigt een volume van 2,5 μL geladen op de EWOD-chip. Het eerste protocol (aan de linkerkant) toont acht LuOs met behulp van voorgemengde antilichaam-HRP conjugaat; het tweede protocol omvat tien LuOs, waarbij het biotinylated detectieantilichaam, de kraalextractie en de opeenvolgende binding van Neutravidin-HRP-vervoeging afzonderlijk worden toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Magnetische kraalextractie. Dit proces wordt opgesplitst in (a-c) het bedienen van de druppel met de zwevende magnetische kralen naar de magnetische scheidingsplaats in het midden van de mengzone (pad nr. 33), d, e) de magneet beweegt zich in positie met de kralen, (f, g, h) kralen worden op hun plaats gehouden door de magnetische kracht, terwijl de druppel wordt weggevoerd door EWOD naar het afvalpad (pad nr. 41). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Volledige immunoassay-sequentie met Behulp van EWOD, met de reagentia, het laden van monsters en de werking van laboratoriumeenheden. Elke rij bevat een reeks voorbeeldafbeeldingen van de karakteristieke bewerkingen op een druppel. De bewerkingen zijn onderverdeeld in kolommen. Mengen wordt niet uitgevoerd voor de kralen in suspensie, gepresenteerd door een zwarte gebroken lijn. Druppelrichtingen worden aangegeven door blauwe pijlen, de kralen worden in een van de afbeeldingen gemarkeerd met een oranje pijl. Het grijze vak (rechterbenedenhoek) scheidt de twee afbeeldingen die beweging en positie in het detectiegebied weergeven, de gebroken lijncirkel markeert het detectiegebied. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Kalibratiecurven van immunoassays uitgevoerd op EWOD-chip met het DMF-platform. Zoals eerder gemeld⁶ worden de uitgangsspanningen (mV) versus concentraties weergegeven voor: (A) Human serum albumine, die wordt gebruikt om het effect van de conjugaatantilichaamconcentratie [C] en de incubatietijd te bestuderen, t_inc, gemeten vanaf het mengen van de kralen met bekende analyt tot de extractie LUO, (B) B. atrophaeus (BG) sporen die de reproduceerbaarheid van de immunoassay, (C) MS2 bacteriofaagimmunoassay, en (D) tien-LuOs protocolresultaten voor E. coli. Afkortingen: kolonievormende eenheden (cfu), plaquevormende eenheden (pfu), aantal onafhankelijke experimenten (N), laboratoriumeenheidsoperatie (LUO). Figuur gewijzigd ten opzichte van vorige publicatie⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende file 1: Volledige volgorde om het DMF-platform voor geautomatiseerde ELISA-test uit te voeren met Neutravidin-HRP als vervoeging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: De GUI voor de chemiluminescence meting en een voorbeeld van een meting met de software worden getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het EWOD immunoassay protocol is flexibel en kan een aantal laboratoriumunitoperaties omvatten (bijvoorbeeld afvangantigeen, mengen, incubatie, kraalextractie, wassen) afhankelijk van het type reagens, stabiliteits- en gebruiksvereisten gedefinieerd door het testprotocol. Als bewijs van principes worden in het huidige artikel twee immunoassayprotocollen beschouwd als het tonen van de implementatie van acht of tien LuOs (figuur 4) met de beschreven EWOD-chip. Een dergelijke miniaturisatie verdient uit de microliter, discrete volumes reagentia/analyt die de werkzaamheid van de ELISA verhogen door zowel het verbruik van reagentia te verminderen, de tijd die nodig is per operatie, in wezen de totale experimentele tijd (6 tot 10 min). Bovendien wordt de test geautomatiseerd met getimede manipulatie van de druppels die variaties vermindert en de precisie van de immunoassay^{verbetert 17}. In het huidige formaat, het experiment omvat handmatige behandeling van druppels aan het begin van elke test, dat is een punt voor verdere discussie in de volgende sectie.

Een kritieke stap in de huidige DMF-methode is het uitdelen van de druppels op het oppervlak van de EWOD-chip. Typisch, een micropipette met een wegwerptip wordt gebruikt om het exacte volume te meten en te laden. Het kan echter een uitdaging worden om de druppel op het hydrofobe oppervlak van de actuatieplaat te immobiliseren vanwege interacties tussen de druppel en het geladen oppervlak van de wegwerppunt. Als gevolg hiervan kan de druppel omhoog schieten na het buitenoppervlak van de punt in plaats van op de plaat te blijven. Om dit te voorkomen, moet de micropipet in een rechte positie worden gehouden, loodrecht op het spaanoppervlak, zonder het aan te raken, dan kan de druppel op het laadpad worden uitgedeeld door het in contact te brengen met het oppervlak. Mocht de druppel vasthouden aan de pipet tip, terug te keren naar de voorraad oplossing, de tip te wisselen en een verse druppel te storten. Bij de verdere ontwikkeling van het huidige proof-of-concept systeem kan worden overwogen om automatisch druppelen te leveren.

Een andere kritieke stap, alvorens de test uit te voeren, is het sluiten van het deksel van de parallelle plaatassemblage. Zoals eerder in het protocol vermeld, moet het deksel bovenop de aanweidheidsplaat worden geschoven. Het hydrofobe oppervlak van het deksel voorkomt de vervorming en verplaatsing van de druppels die op de aanzetplaat zitten. Om de soepele beweging van de druppel te garanderen, is het ten zeerste aan te raden om ongerepte actuatieplaat, correcte belasting van de druppels en spaanassemblage te gebruiken. Herbruikbaarheid van de aanzetplaten is mogelijk; het aantal cycli is echter afhankelijk van de aanloktijdsspanningen (figuur 3) en de analyte/reagent depositie op het oppervlak, ook wel biofouling. Het gepresenteerde platform maakte gebruik van chroomgeprinte EWOD-chip, die betrouwbaar kon worden hergebruikt voor opeenvolgende metingen tot vier keer bij bedrijfsspanning van 120 V en tussentijdse plaatreiniging na elk experiment. Platen werden gerecycled, om de kosten per experiment te verlagen, door het ontsmetten (borstelen van het oppervlak met onverdund reinigingsmiddel voor grondig spoelen) de biofouled amorfe fluorpolymeren(Tabel van materialen)coating en spin-coating een verse op de top van de plaat. Voor het recyclen van actuatieplaat's is echter handmatige behandeling, kostbare reagentia (amorfe fluorpolymeren(Tabel met materialen))en gespecialiseerde apparatuur (spin-coater) vereist. Alternatieve EWOD-chips worden met succes onderzocht met kostenefficiënte substraten zoals papier^19,acetaatfolies of printplaten (PCB's)^20,21. Dergelijke wegwerpverbruiksartikelen kunnen een betrouwbaar en betaalbaar gebruik van het DMF-platform vergemakkelijken en kunnen middelen bieden om het biofoulingprobleem te omzeilen.

Biofouling is de belangrijkste beperking van EWOD voor biologische toepassingen^22,23. Eerdere studies over DMF hebben twee mechanismen geïdentificeerd die bijdragen aan biofouling, namelijk passieve adsorptie als gevolg van hydrofobe interacties, en een elektrostatisch gedreven adsorptie die zich manifesteert wanneer een elektrisch veld wordt toegepast²⁴. De bevindingen in het huidige artikel komen overeen met deze theorie omdat het werd gedocumenteerd de actuatieplaatherbruikbaarheid vermindert bij hoge actuatiespanningen. Een mogelijke verklaring is dat eiwitten adsorberen gemakkelijk op fluorpolymeer-gecoate (Teflon-achtige) oppervlakken en ze aggregaat sneller op vervuild in vergelijking met ongerepte oppervlakken²⁴. Als gevolg hiervan zijn eiwitgerelateerde tests op DMF moeilijk te kwantificeren en kunnen ze verlies van analyt, kruisbesmetting en verminderde precisie^{ervaren 17}. Het worst-case scenario is wanneer een kritische hoeveelheid eiwit adsorbs waardoor het apparaat nutteloos. Om de biofouling tot een minimum te beperken, zijn verschillende benaderingen onderzocht, van het minimaliseren van de verblijfstijd van de druppel op de chip, via coatings²³, tot additieven (d.w.z. oppervlakteactieve stoffen of pluronzuur) in de met biomateriaal beladen druppels^6,22. Vandaar dat een belangrijk aspect van de immunoassay-test op EWOD is om anti-biofouling strategieën te kiezen die compatibel zijn met het specifieke protocol bij de hand.

Het geautomatiseerde DMF-platform is ontworpen om een enkele sandwich ELISA-test per run uit te voeren terwijl het gebruik van microlitervolumes voor zowel reagentia als analyte. Wanneer het nodig is, conventionele sandwich ELISA kits bestaan op basis van voorgecoate 96-well of 384-well platen die in combinatie met hulplaboratoriumapparatuur resulteren in een hogere doorvoer per run; gebaseerd op reagentia prijs alleen, de geschatte kosten per assay / goed is 6,04 USD (580 USD/96) en 0,33 USD (2 × 580 USD/384) respectievelijk. Dit maakt de conventionele ELISA-methoden ideaal voor een groot aantal monsters die doorgaans worden verwerkt door opgeleid technisch personeel in gecentraliseerde laboratoriumfaciliteiten. Op afgelegen locaties bleek echter uit de gedetailleerde kostenanalyse van ELISA voor milieumonitoring dat toen de kapitaalkosten (d.w.z. de bedrijfskosten van het laboratorium, terugkerende kosten, monstervervoer, leveringen en personeel) waren opgenomen, de werkelijke prijs per ELISA 60 USD bedroeg, waarvan 34 USD voor leveringen per monster²⁵. In tegenstelling, de voorgestelde DMF-platform is draagbaar, vereist minimale training te bedienen en met pre-coated kralen kan monster-to-answer analyse in enkele minuten. Daarom kan de gepresenteerde technologie worden ingezet op punt-van-behoefte locaties en aanvulling analyses anders beschikbaar in gecentraliseerde laboratoria.

In de sectie representatieve resultaten werd het geautomatiseerde DMF immunoassay-platform gebruikt voor directe detectie van ziekteverwekkers voor verdedigingstoepassing. Andere mogelijke toepassingen voor het DMF-platform omvatten, maar zijn niet beperkt tot biodiagnostische, continue monitoring en geautomatiseerde bemonstering. Mogelijk kan de DMF gevolgen hebben voor diverse sectoren, van point-of-care voor gepersonaliseerde gezondheidszorg, evenals gecontroleerde milieumonitoring voor de bescherming van patiënten van ziekenhuisinfectie in de lucht, tot gewasmonitoringsysteem voor landbouw en voedselproductie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Anti-Human Serum Albumin [15C7]	Abcam	ab10241
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) spores	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Blocker Casein	Thermo Scientific	TFS 37582
CNC Dicing/Cutting Saw	MTI Corp, USA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japan	CTL-809M	Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.
E. coli MRE 162	Dstl, UK	N/a
Goat anti-MS2 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Hamamatsu photodiode	Hamamatsu, Japan	S9270
Hidrochloric acid (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Mask manufacturing service	Compugraphics, Scotland, UK	N/a
MS2 virus	Dstl, UK	N/a
Parylene-C, DPX-C	Specialty Coating System, USA	CAS No.: 28804-46-8
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit	Thermo Scientific	88828	Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C.
Rb anti-BG polyclonal	Dstl, UK	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal	Dstl, UK	N/a
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS	Abcam	ab201876
SCS Parylene Deposition System	Specialty Coating System, USA	2010
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜSS MicroTec AG, Germany
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Scientific	37075	It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.