Hier gepresenteerd is een protocol voor whole-mount in situ RNA hybridisatie analyse in zebravis en buisvorming test in patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen om de rol van endoglin in vasculaire vorming te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vasculaire ontwikkeling wordt bepaald door de sequentiële expressie van specifieke genen, die kan worden bestudeerd door het uitvoeren van in situ hybridisatietesten bij zebravissen tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Om de rol van endoglin(eng) in de vorming van bloedvaten tijdens de ontwikkeling van erfelijke hemorragische telangiectasia (HHT) te onderzoeken, worden morfoino-gemedieerde gerichte knockdown van eng in zebravissen gebruikt om de temporele expressie en bijbehorende functies te bestuderen. Hier wordt whole-mount in situ RNA hybridisatie (WISH) gebruikt voor de analyse van eng en zijn downstream genen in zebravis embryo's. Ook worden buisvormingstesten uitgevoerd in HHT-geïnduceerde pluripotente stamcelgedifferentieerde endotheelcellen eng (iPSC-ECs; met engmutaties). Een specifiek signaalversterkend systeem met behulp van de hele hoeveelheid In Situ Hybridization – WISH biedt een hogere resolutie en lagere achtergrondresultaten in vergelijking met traditionele methoden. Om een beter signaal te verkrijgen, wordt de post-fixatietijd aangepast tot 30 min na de hybridisatie van de sonde. Omdat fluorescentievlekken niet gevoelig zijn in zebravisembryo's, wordt deze hier vervangen door diaminobezidine (DAB) vlekken. In dit protocol worden HHT-door patiënten afgeleide iPSC-lijnen die een engmutatie bevatten, gedifferentieerd in endotheelcellen. Na het coaten van een plaat met keldermembraanmatrix voor 30 min bij 37 °C, worden iPSC-IC's als monolaag in putten gezaaid en 3 uur lang op 37 °C gehouden. Vervolgens worden de buislengte en het aantal takken berekend aan de hand van microscopische afbeeldingen. Met dit verbeterde WISH-protocol wordt dus aangetoond dat verminderde eng-expressie de enotheliale voorlopervorming in zebravisembryo's beïnvloedt. Dit wordt verder bevestigd door buisvormingstesten met behulp van iPSC-ECs afkomstig van een patiënt met HHT. Deze testen bevestigen de rol voor eng in de vroege vasculaire ontwikkeling.
Inleiding
Een enkele mutatie op eng (CD105) is gemeld bij patiënten met HHT. De mutatie leidt tot een grotere proliferatie van de EG en tot een verminderde doorstroom gemedieerde EG-verlenging1,2. Het is ook eerder gemeld dat ENG-deficiëntie de expressie van endotheelmarkeringen vermindert (d.w.z. kdrl, cdh5, hey2) bij zebravis3. Endoglin, voornamelijk uitgedrukt in endotheelcellen, is een transmembrane glycoproteïne en functioneert als een co-receptor voor het transformeren van groeifactor β (TGF-β) familieleden. Het stuurt BMP9 binding op het celoppe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Research Ethics Committee van de Zhejiang University school of medicine.
1. Whole-mount in situ hybridisatie
- De lijnhouderij en de reproductie van zebravissen
- Voer en verhoog alle volwassen zebravissen bij 26-28 °C in een recirculerend aquacultuursysteem met 14 uur licht/10 uur donkere cyclus voor elke dag. Gebruik AB (wild-type) zebravis lijnen voor de volgende procedures.
- Leg een laag steentjes in de bodem van de kweekdoos als schuilplaats voor eieren. Groep ouderlijke vis in de verhouding van 2:1 (d.w.z. twee vrouwtjes en een mannetje) in elke doos. Laat ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hele mount in situ hybridisatie is gebaseerd op een principe vergelijkbaar met fluorescentie resonantie energieoverdracht. Het is ontworpen om zowel de gevoeligheid en specificiteit in zebravissen ISH te verbeteren als doelspecifieke signalen te versterken zonder het achtergrondsignaal te beïnvloeden.
In 24 hpf zebrafish embryo's, endoglin is sterk uitgedrukt in de achterste kardinaal ader (PCV), intersegmentale bloedva.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol paste een verbeterd whole-mount in situ RNA analyseplatform toe voor zebravissen en buisvormingstesten op iPSC-ECs afkomstig van een HHT-patiënt. De traditionele ISH-methode vereist een langere experimentele cyclus met extra experimentele stappen. Het protocol heeft een aantal belangrijke verbeteringen, het gebruik van onafhankelijke dubbele Z-sondes en iPSC's afkomstig van een patiënt met HHT die respectievelijk werden toegepast in WISH-tests en buisvorming. Deze verfijningen zijn cruciaal voor het verbeter.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China-stamcel- en translationeel onderzoek [subsidienummer 2016YFA0102300 (aan Jun Yang)];de Nature Science Foundation of China [subsidienummer 81870051, 81670054 (aan Jun Yang)]; het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [subsidienummer 2016-I2M-4-003 (aan Jun Yang)]; de PUMC Youth Found en de Fundamental Research Funds voor de Central Universities [subsidienummer 2017310013 (aan Fang Zhou)].
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Celcultuur |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signaalversterking |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signaalversterking |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signaalversterking |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signaalversterking |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-vrij water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Celcultuur |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Gefokte embryo's |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Gefokte cellen |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Weefsel verteren |
| Sodium Citraat | Sigma | 6132-04-3 | SSCT-oplossing: Wasbuffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Groeifactor |
Referenties
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
