Coronaire voorlopercellen en oplosbare biomarkers in cardiovasculaire prognose na coronaire angioplastie

Samenvatting

Ontwikkeling van grote bijwerkingen cardiovasculaire voorvallen, die van invloed zijn cardiovasculaire prognose na coronaire angioplastie, worden beïnvloed door de omvang van coronaire schade en vasculaire reparatie. Het gebruik van nieuwe coronaire cellulaire en oplosbare biomarkers, reactief op vasculaire schade en reparatie, zijn nuttig om de ontwikkeling van MacEs en prognose te voorspellen.

Samenvatting

Grote bijwerkingen (MACEs) hebben een negatieve invloed op de cardiovasculaire prognose van patiënten die coronaire angioplastie ondergaan als gevolg van coronaire ischemische letsel. De omvang van coronaire schade en de mechanismen van vasculaire reparatie zijn factoren die van invloed zijn op de toekomstige ontwikkeling van MACE's. Intrinsieke vasculaire kenmerken zoals de plaque kenmerken en coronaire slagader complexiteit hebben aangetoond prognostische informatie voor MACEs. Het gebruik van intracoronaire circulerende biomarkers is echter als een handige methode voor de vroege identificatie en prognose van MACE's geposteerd, omdat ze beter aansluiten bij dynamische mechanismen waarbij coronaire schade en herstel betrokken zijn. Bepaling van coronaire circulerende biomarkers tijdens angioplastie, zoals het aantal subpopulaties van mononucleaire voorlopercellen (Mp's) en de concentratie van oplosbare moleculen die ontstekingen, celhechting en reparatie reflecteren, beoordeling van toekomstige ontwikkelingen en de prognose van MACE's 6 maanden na coronaire angioplastie. Deze methode wordt benadrukt door zijn translationele aard en betere prestaties dan perifere bloed circulerende biomarkers met betrekking tot de voorspelling van MACE's en het effect ervan op de cardiovasculaire prognose, die kan worden toegepast voor risicogelaagdheid van patiënten met coronaire hartziekte die angioplastie ondergaat.

Inleiding

Coronaire angioplastie en stenting vormen een bergingsprocedure voor patiënten met coronaire hartziekten (CAD). Echter, grote bijwerkingen cardiovasculaire voorvallen (MacEs), met inbegrip van cardiovasculaire dood, hartinfarct, coronaire restenose, en episodes van angina of decompenseren hartfalen, kan maanden na coronaire interventie optreden, waardoor ongeplande bezoeken aan het ziekenhuis. Maces komen wereldwijd vaak voor en hun morbisterfte is hoog¹.

Coronaire ischemische schade veroorzaakt vroege vasculaire respons en herstellende mechanismen waarbij mobilisatie van MpCs als gevolg van hun differentiatie vermogen en / of angio-herstellend potentieel, evenals de productie van oplosbare moleculen zoals intercellulaire hechting moleculen (ICAMs), matrix metalloproteinases (MMP's), en reactieve zuurstofsoorten, als gevolg van celverkleving, weefsel remodelleren, en oxidatieve stress. Hoewel intrinsieke vasculaire kenmerken zoals plaquekenmerken en coronaire hartcomplexiteit zijn gebruikt om MACEs te voorspellen, hebben sommige studies gesuggereerd dat biomarkers met betrekking tot de mechanismen van letsel en herstel die zich voordoen in het coronaire endotheel zeer nuttig kunnen zijn voor de vroege identificatie en prognose van cardiovasculaire voorvallen bij patiënten met CAD die aan coronaire angioplastie^2,3,4,5worden voorgelegd.

Voortdurende interesse in het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan CAD letsel en reparatie heeft onderzoekers gemotiveerd om intracoronaire circulerende biomarkers te bestuderen, omdat coronaire bemonstering nauwer vasculaire schade weerspiegelt en^{herstel 6}. Echter, karakterisering van coronaire biomarkers in menselijke studies is schaars^7,8,9. Daarom was het doel van deze studie om een methode te beschrijven om de hoeveelheid coronaire circulerende MpCs en oplosbare moleculen te bepalen, als gevolg van zowel vasculairletsel als herstel, en om aan te tonen of deze biomarkers geassocieerd zijn met MACEs en de klinische prognose van CAD-patiënten die coronaire angioplastie ondergingen. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van vasculaire, circulerende MpCs en oplosbare moleculen verkregen door bemonsteringslocaties die het dichtst bij de schade aan het vat staan. Het kan ook nuttig zijn voor klinische studies voor onderste ledematen ischemie, beroerte, vasculitis, veneuze trombose, en andere verwondingen waarbij vasculaire letsel en reparatie.

Protocol

Dit protocol voldoet aan de institutionele richtlijnen van de Human Research Ethics Committee.

1. Coronaire angiografie, echografie en bloedafname

1. Vraag basisklinische en demografische informatie aan voor coronaire interventie. Verzamel de gegevens van het individu: leeftijd, geslacht, huidige rookstatus, body mass index (BMI), hoge bloeddruk, dyslipidemie, diabetes mellitus, medicijnen en de indicatie voor de huidige coronaire angiografie.
2. Voer coronaire angiografie uit door middel van hartkatheterisatie met behulp van een radiale benadering. Deze procedure moet worden uitgevoerd onder een fluoroscopiegids in de hemodynamicaruimte door deskundige cardiologen.
   OPMERKING: Identificeer waardevolle schepen. Voor deze studie werden waardevolle vaten gedefinieerd als slagaders met secties groter dan 1,5 mm en lumenstenose van meer dan 50%.
3. Advance de intravasculaire ultrasone katheter naar de regio van belang en beelden opnemen. Gebruik de juiste software om het kleinste armatuurgebied te lokaliseren en te meten.
4. Gebruik een coronaire katheter om 10 mL bloed te verzamelen van de dichtstbijzijnde locatie naar de plaque.
5. Na de ontreing van de patiënt, schema periodieke medische evaluaties follow-up studie eindpunten. Als telefonisch contact niet mogelijk is of een arts bezoek wordt uitgesteld voor langer dan 2 maanden, vraag een geautoriseerde persoon (eerder ontworpen) om de studie eindpunten te verifiëren.
   OPMERKING: Overweeg een van de volgende een MACE: 1) cardiovasculaire dood, 2) nieuwe hartinfarct, 3) instabiele angina gevraagd een ongepland medisch bezoek binnen 24 uur, 4) stent restenosis zoals aangetoond door coronaire angiografie, 5) afleveringen van degecompenseerd hartfalen die klinische aandacht vereist.

2. Bepaling van circulerende RPC's(figuur 2)

1. Verwerk het bloed binnen 1 uur van de collectie. Breng 6 mL van het verzamelde bloed over naar een conische buis van 15 mL en verdun 1:1 (v/v) met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH = 7,4.
2. Voeg 2 mL dichtheidgradiënt toe aan drie reageerbuizen. Breng voorzichtig drie gelijke volume aliquots verdund bloed in elke reageerbuis met de dichtheid gradiënt medium.
   OPMERKING: Het totale volume van de dichtheid gradiënt medium en verdund bloed mag niet meer dan driekwart van de testbuis maximale capaciteit.
3. Centrifuge bij 1.800 x g, 4 °C gedurende 30 min. Breng de band op de interface tussen de lagen over in een nieuwe buis. Voeg 2 mL PBS en centrifuge toe bij 1.800 x g,4 °C gedurende 6 min. De pellet zal de MpCs bevatten.
4. Was de pellet meerdere keren. Aanzuigen uit de vorige oplossing en voorzichtig opnieuw opteschorten van de cel pellet in verse PBS. Voor latere wasbeurten centrifugeeren bij 1.800 x g, 4 °C gedurende 2 minuten. Herhaal het proces 6x.
5. Resuspend de celpellet in 1 mL PBS. Meng 20 μL van de celvering met 0,4% trypanblauw, verdund 1:1 (v/v). Breng een druppel aan op een hemocytometer en tel de onbevlekte cellen onder een lichtmicroscoop.
6. Ga over tot de bepaling van de MpC's. Label 5 mL flow cytometrie buizen en aliquot uit 1 x 10⁶ cellen per buis. Bereid de overeenkomstige isotype-matched controle antilichamen. Centrifugeer bij 1.800 x g,4 °C gedurende 6 min en gooi de supernatant weg.
7. Voeg het primaire antilichaam toe verdund in 100 μL van een antilichaamincubatioplossing bestaande uit 1x PBS (pH = 7.4), 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) en 0,05% runderserumalbumine (BSA). Resuspend voor 10 s en incuberen gedurende 20 min bij 4 °C, licht beschermd. Het protocol kan in deze stap worden onderbroken door de lymfocyten in 4% paraformaldehyde in PBS vast te stellen en monsters tot 24 uur bij 4 °C op te slaan.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van de primaire antilichamen die in het huidige protocol worden gebruikt, waren CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Centrifugeer bij 1.800 x g,4 °C gedurende 2 min en gooi de supernatant weg. Resuspend in 500 μL of 1x PBS (pH = 7.4), 2 mM EDTA.
9. Voer flow cytometrie-analyse uit. Gebruik isotype-matched controle antilichamen om de achtergrond vlekken in te stellen. Selecteer vervolgens lymfocyten verspreid op het FSC/SSC-perceel, in een poging om resterende granulocyten, cellulair puin en andere deeltjes uit te sluiten, die zich meestal in de onderste, linker-verspreid in het perceel bevinden. Een dergelijke verdeling wordt beschouwd als 100%.
10. Gebruik een poort met een hoog aantal cellen met veelvoorkomend immunofenotype CD45⁺ en CD34⁺. Gebruik voor dubbele positieve immunophenotypes een poort die eerder CD45⁺, CD34⁺identificeerde, met de toevoeging van KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺, of CD184⁺. Identificeer de MPC-subpopulaties aan de smaken van hun specifieke celoppervlakmarkeringen. Rapporteren als het percentage gated gebeurtenissen.
11. Identificeer de belangrijkste subpopulaties van MpC's. In deze studie waren de belangrijkste immunophenotypes CD45⁺CD34⁺CD133⁺, CD45⁺CD34⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺, en CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184.
    OPMERKING: De gebruikte celoppervlaktemarkers waren CD45 (lymfocyten), CD34 (endotheel- en/of vaatcellen), KDR (VEGFR-2, membraanmarker van endotheelcellen), CD133 (endotheelvoorlopercellen) en CD184 (hematopoietische stamcellen en endotheelcellen).

3. Bepaling van in het plasma oplosbare biomarkers

1. Gebruik een enzymgebonden immunosorbent test (ELISA) om de concentratie van SICAM-1 en MMP-9(figuur 3, bovenste rij) te bepalen.
   1. Centrifugeer de bloedmonsters op 3.000 x g,kamertemperatuur gedurende 5 min en verzamel het plasma.
   2. Label de normen, monsterbuizen en regelbuizen. Equilibrate de voorgecoate putten in de testplaat door het wassen van 2x met de wasbuffer in de ELISA kit.
   3. Breng de normen, monsters en controles over naar de putten. Verzegel en incubeer bij 37 °C gedurende 90 min.
      LET OP: Laat de putten niet volledig drogen.
   4. Gooi de inhoud weg en voeg het biotinedetectie-antilichaam toe. Verzegel en incubeer bij 37 °C gedurende 60 min.
   5. Gooi de inhoud weg en was 3x. Sluit de plaque af en bebroed achtereenvolgens met streptavidine werkoplossing gevolgd door tetramethylbenzidinesubstraat bij 37 °C gedurende 30 min, licht beschermd. Was 3x tussen incubatie. Wanneer de kleur zich ontwikkelt, voeg de stopoplossing toe en lees de optische dichtheidsabsorptie in een microplate ELISA-lezer.
2. Gebruik een immuno-magnetische multiplexing test om de concentratie van tumor necrose factor alpha (TNFα) en interleukine 1 bèta (IL-1β) (Figuur 3, onderste rij) te bepalen.
   1. Label de normen, monsterbuizen en regelbuizen.
   2. Vortex de magnetische kralen flesjes voor 30 s. Breng de kraal suspensie naar de juiste grootte buizen, en vervolgens naar de putten in de multiplexing testplaat. Periodieke vortexing voorkomt neerslag van de kralen.
   3. Plaats de handbediende magneetplaatwasser stevig in. Wacht 2 min tot de kralen zich ophopen op de bodem van elke put en snel omkeren zowel de hand-held magnetische plaat wasmachine en plaat assemblage, over een gootsteen of afvalcontainer. Vergeet niet om de hand-held magnetische plaat wasmachine te gebruiken om de kralen in de putten te behouden.
   4. Voeg 150 μL wasbuffer toe in elke put en wacht 30 s om de kralen op de bodem te laten ophopen. Gooi de inhoud weg zoals in stap 3.2.3. Voeg vervolgens 25 μL universele testbuffer toe (in de kit), gevolgd door 25 μL aan voorbereide normen, monsters en bedieningselementen.
   5. Sluit de plaat af en incubeer gedurende ten minste 60 min bij kamertemperatuur, licht beschermd, met constant schudden bij 500 tpm. U ook 's nachts uitbroeden bij 4 °C, licht beschermd, met constant schudden bij 500 tpm indien mogelijk.
   6. Was 2x door 150 μL wasbuffer toe te voegen en wacht 30 s. Gooi de inhoud weg door de handbediende magnetische plaatwasser in te voegen. Wacht 2 min en omkeren over een gootsteen of afvalcontainer.
   7. Incubeer achtereenvolgens met 25 μL detectieantilichaammengsel, gevolgd door 25 μL streptavidin-PE-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 min, verzegeld en lichtbeschermd, met constant schudden bij 500 tpm. Was 2x tussen incubatie, zoals beschreven in stap 3.2.6.
   8. Verkrijg de metingen. Voeg 120 μL afleesbuffer toe. Sluit de plaat af en incubeer 5 min bij kamertemperatuur, licht beschermd, met constant schudden bij 500 tpm. Voer de lezing uit op een multiplexing-testlezer. Pas de leesparameters aan op basis van elke analyt.

Resultaten

Coronaire, veneuze sinus, en perifere bloed werden verzameld van 52 patiënten die coronaire angiografie onderging (Figuur 1) en toonde een hoge prevalentie van hypertensie en dyslipidemie. Bij de klinische follow-up werd 11 (21,1%) Maces traden op 6 maanden na coronaire angiografie: overlijden (n = 1), angina die ziekenhuisbezoek vereist (n = 6), hartinfarct (n = 2) en/of bewijs van hartfalen (n = 4).

Discussie

Bloedafname van de aangetaste kransslagader kan moeilijk zijn. Soms is de kransslagader nauwelijks toegankelijk. In dit geval kan bemonstering van de veneuze sinus een alternatief zijn. We hebben validatietests uitgevoerd waarbij circulerende biomarkers in kransslagader vergeleken met veneuze sinus, zonder significante verschillen. Echter, de prestaties van circulerende biomarkers werd alleen gevalideerd voor coronaire bemonstering. Daarom moet de prestaties van biomarkers verkregen uit de veneuze sinus nog worden onderz...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) als buffermiddel, stabilisator, standaard en voor blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant kalibratiekralen worden geleverd in waterige oplossing met 0,05% natriumazid. 3,5 ml voor maximaal 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antilichaam geconjugeerd aan R-Phycoerythrine in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoklonaal, Isotype recombinant humaan IgG1, geconjugeerd
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antilichaam geconjugeerd aan R-Phycoerythrine in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	Het monoklonale antilichaam AC136 detecteert een klasse III epitoop van de CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoklonaal CD45 Antilichaam, humaan geconjugeerd
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15 ml conische centrifugeerbuisjes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL polystyreen buisje met ronde bodem. 12x75 stijl. Steriel.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Zware metalen, (als Pb) <10ppm, Fe <0,01%, As <1ppm, Onoplosbare stoffen <0,005%
Improved Neubauer	Zonder merk	Zonder catalogusnummer	Hemocytometer voor celtelling. (bereik 0,1000mm, 0,0025mm2)
K2 EDTA Bloedopvangbuisjes	BD Vacutainer	#367863	Lila kunststof vacutainerbuisje (K2E) 10,8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Steriele en gecontroleerd op aanwezigheid van endotoxinen. Dichtheid: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixatie van biologische monsters, (poeder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	De overdrachtpipet is een hulpmiddel dat nauwkeurige vloeistofverschuiving vergemakkelijkt.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Hittebestendige testbuisjes. MAAT/DEKSEL 13 x 100 mm