Gram-negatieve bacteriën produceren twee ruimtelijk gescheiden membranen. Het buitenste membraan wordt van het binnenste membraan verdeeld door een periplasma en een peptidoglycanlaag. Het vermogen om de dubbele tweelagen van deze microben te isoleren is van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van hun fysiologie en pathogenese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze methode werkt door het verdelen van de envelop van Gram-negatieve bacteriën in totaal, binnenste, en buitenste membraan (OM) fracties en eindigt met tests om de zuiverheid van de tweelagen te beoordelen. Het OM heeft een verhoogde totale dichtheid in vergelijking met het binnenste membraan, grotendeels te wijten aan de aanwezigheid van lipooligosachariden (LOS) en lipopolysachariden (LPS) in de buitenste bijsluiter. LOS en LPS moleculen zijn amphipathic glycolipids die een vergelijkbare structuur hebben, die bestaat uit een lipide-A disaccharolipide en core-oligosaccharide substituent. Echter, alleen LPS moleculen zijn versierd met een derde subeenheid bekend als de O-polysaccharide, of O-antigeen. Het type en de hoeveelheid aanwezige glycolipiden zullen de OM-dichtheid van een organisme beïnvloeden. Daarom hebben we getest of de membranen van bacteriën met een gevarieerd glycolgehalte op dezelfde manier kunnen worden geïsoleerd met behulp van onze techniek. Voor de LPS-producerende organismen, Salmonella enterica serovar Typhimurium en Escherichia coli, werden de membranen gemakkelijk geïsoleerd en had de LPS O-antigeenmoiety geen invloed op tweelaagse scheidingen. Acinetobacter baumannii produceert LOS moleculen, die een vergelijkbare massa hebben als O-antigeen deficiënte LPS moleculen; de membranen van deze microben konden echter aanvankelijk niet worden gescheiden. We redeneerden dat de OM van A. baumannii minder dicht was dan die van Enterobacteriaceae, dus de sacharosegradiënt werd aangepast en de membranen werden geïsoleerd. De techniek kan dus worden aangepast en aangepast voor gebruik met andere organismen.
Inleiding
Gram-negatieve bacteriën produceren twee membranen die worden gescheiden door een periplasmische ruimte en een peptidoglycan celwand1. Het binnenste membraan (IM) omhult de cytosol en is een symmetrische tweelaag van fosfolipiden. Peptidoglycan beschermt tegen turgordruk en voorziet de bacterie van een celvorm en is bevestigd aan het buitenste membraan (OM) door lipoproteïnen2,3. Het OM omringt het periplasma en is overwegend asymmetrisch. De binnenste bijsluiter bestaat uit fosfolipiden en de buitenste bijsluiter bestaat uit glycolipiden bekend als lipooligosachariden (LOS) of lipopoly....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemene reagentia en mediavoorbereiding voor membraanextractie
- Bacteriële groei media: Bereid en steriliseren 1 L bouillon media in een grondig gereinigden en autoclaved 2 L kolf.
- Algemene resuspension buffer (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Los 6,05 g Tris base op in 30 mL van H2O. Pas de pH aan op 7,5 met 5 M HCl. Pas het eindvolume aan tot 50 mL met ultrazuivere H2O.
- Hoofdvoorraad van divalent kationchelatieoplossing (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Voeg 18,6 g dinatriumethyleentetraacetaat·2H2O tot 80 mL van H2O toe. Roer krachtig en pas de pH aan 8,0 aan met NaOH. Pas het eindvolume aan op 10....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze techniek biedt een effectief middel om de OEM's en OEM's te isoleren voor gramnegatieve bacteriën. Een overzicht van de gehele procedure wordt geïllustreerd (figuur 1). In het algemeen zal de normalisatie van culturen tot een OD600 van 0,6-0,8 in 1 L van de media, of het oogsten tussen 6,0 en 8,0 x 1011 bacteriële cellen ervoor zorgen dat de juiste hoeveelheid membraanmateriaal wordt verzameld voor latere scheiding.
Bij het lyseren van d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methode zal onderzoekers blijven helpen bij het begrijpen van de rol van de celenvelop in bacteriële fysiologie en pathogenese. Na de sequentiële ultracentrifugatiestappen kan een gezuiverd totaal-, binnen- en OM-fractie worden verkregen. Deze membranen kunnen afzonderlijk worden getest om hypothesen te testen met betrekking tot membraaneiwitlokalisatie en -functie, transport en handel over het periplasma en de samenstelling van de individuele tweelagen onder verschillende omgevingsomstandigheden. Biologische studie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door P20GM10344 en R01AI139248 toegekend aan Z. D. Dalebroux.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 - IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma - Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
Referenties
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414(2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
