Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

4.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60523

⸱

27 juni 2020

 ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2School of Life Science, University of Science and Technology of China, 3State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Samenvatting

T Folliculaire Helper (Tfh) cellen zijn een onafhankelijke CD4+ T cel subset gespecialiseerd in het bieden van hulp voor germinaal centrum (GC) ontwikkeling en het genereren van high-affinity antilichamen. Bij influenzavirusinfectie worden robuuste Tfh- en GC B-celresponsen geïnduceerd om effectieve virusuitroeiing te vergemakkelijken, wat een gekwalificeerd muismodel voor Tfh-geassocieerde studie oplevert. In dit artikel beschreven we protocollen bij de detectie van basis Tfh-geassocieerde immuunrespons tijdens influenzavirusinfectie bij muizen. Deze protocollen omvatten: intranasale inenting van het influenzavirus; flowcytometriekleuring en analyse van polyklonale en antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B-cellen en plasmacellen; immunofluorescentiedetectie van GCs; enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) van influenzavirusspecifiek antilichaam in serum. Deze tests kwantificeren in feite de differentiatie en functie van Tfh-cellen bij influenzavirusinfectie, waardoor hulp wordt geboden voor studies naar het ophelderen van differentiatiemechanisme en manipulatiestrategie.

Inleiding

In het afgelopen decennium zijn talrijke studies gericht op de nieuw geïdentificeerde CD4+ T-celsubset, Tfh-celsubset, voor zijn essentiële rollen in de ontwikkeling van het kiemcentrum (GC) B. B-cellymfoom 6 (Bcl6), dat voornamelijk wordt beschouwd als een genrepressor, is de afstammingsbepalende factor van Tfh-cellen voor het bewijs dat ectopische expressie van Bcl6 voldoende is om Tfh-differentiatie aan te drijven, terwijl een tekort aan Bcl6 resulteert in verdwenen Tfh-differentiatie1,2,3. In tegenstelling tot andere CD4+ T helper subsets die hun effectorfunctie uitvoeren door migratie naar de plaatsen van ontsteking, bieden Tfh-cellen de B-cel vooral hulp in de B-cel folliculaire zone van milt en lymfeklier. Co-stimulatory moleculen ICOS en CD40L, spelen een belangrijke rol in de interactie tussen Tfh en GC B cellen. Tijdens Tfh-differentiatie verzendt ICOS de nodige signalen van cognate B-cellen en fungeert het ook als een receptor die migratiesignalen ontvangt van omstander B-cellen voor B-celzonelokalisatie4,5. CD40L is een bemiddelaar van signalen van Tfh-cellen voor de proliferatie en overleving van B-cellen6. Een andere factor die dezelfde rol speelt als CD40L is de cytokine IL21, die voornamelijk wordt uitgescheiden door Tfh-cellen. IL21 reguleert rechtstreeks de ontwikkeling en productie van GC B-cellen van antilichamen met een hoge affiniteit, maar de rol ervan in Tfh-differentiatie is nog steeds controversieel7,8. PD-1 en CXCR5, die nu het meest worden gebruikt bij het identificeren van Tfh-cellen in flowcytometrie-analyse, spelen ook een belangrijke rol in de differentiatie en functie van deze subset. CXCR5 is de receptor van B-cel folliculaire chemokine en bemiddelt de lokalisatie van Tfh-cellen in B-celzakjes9. PD-1 is nu geïdentificeerd om niet alleen de folliculaire geleidingsfunctie te hebben, maar ook kritieke signalen over te brengen tijdens het proces van GC B-cellen affiniteitsrijping10. Op basis van deze bevindingen zou het evalueren van de expressie van deze moleculen in feite de rijping en functie van Tfh-cellen kunnen weerspiegelen.

GC is een geïnduceerde voorbijgaande microanatomische structuur in secundaire lymfoïde organen en sterk afhankelijk van Tfh-cellen, waardoor het een perfecte uitlezing is om de Tfh-respons te evalueren. In GC, na het ontvangen van signalen gemedieerd door cytokines en co-stimulatory moleculen, B cellen zijn onderworpen aan klasse schakelen en somatische hypermutatie om high-affinity antilichamen te genereren11. Differentiële antilichaamklasseschakeling vindt plaats in differentiële cytokine-niche, waarbij IL4 en IL21 IgG1-klasseschakeling induceren, terwijl IFNγ IgG2-klasseschakelinginduceert 12. Plasmacellen zijn de producenten van uitgescheiden antilichamen en zijn terminaal gedifferentieerde cellen. Net als Tfh-cellen wordt de ontwikkeling van B-cellen in GC geassocieerd met dynamische expressie van veel belangrijke moleculen. Op basis van de huidige studie kunnen GC B-cellen worden geïdentificeerd als B220+PNA+Fas+ of B220+GL7+Fas+ cellen en plasmacellen, in vergelijking met hun precursoren, downregulate expressie van B220 en upregulate CD138 expressie13. Bovendien kunnen beide kenmerken worden gedetecteerd in flowcytometrie en immunofluorescentieanalyse, waardoor de GC-respons op de juiste manier wordt geëvalueerd.

Robuuste cellulaire en humorale reacties worden geïnduceerd in influenzavirusinfectie, waarbij Tfh- en Th1-cellen CD4+ T-celrespons14domineren, waardoor het een perfect model is voor Tfh-cellen differentiatiestudie. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), een veelgebruikte muis-aangepaste stam, wordt vaak gebruikt in deze studie14,15,16. Hier beschrijven we enkele basisprotocollen van Tfh-studierelevante test bij influenzavirusinfectie: 1) intranasale inenting van pr8-virus; 2) antigeenspecifieke Tfh-cellen, GC B- en plasmacellen en IL21-detectie met stroomcytometrie; 3) histologische visualisatie van GC; 4) detectie van antigeenspecifieke antilichaamtiter in serum met ELISA. Deze protocollen bieden de nodige technieken voor nieuwe onderzoekers in Tfh-geassocieerde studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Institut Pasteur uit Shanghai, China. Alle experimenten werden uitgevoerd op basis van de door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde dierprotocollen.

OPMERKING: Virusinfectie van muizen en isolatie van organen moeten worden uitgevoerd onder ABSL2-voorwaarde.

1. Inenting van PR8-influenzavirus en registratie van muizengewicht

  1. Bereid 8 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen voor op infectie in ABSL2 kamer.
    OPMERKING: Dit protocol is ook geschikt in experimenten met vrouwelijke muizen.
  2. Verdunning van het PR8-virus: haal het virus uit de vriezer van -80 °C en broed op ijs totdat het in vloeistof smelt. Vortex het stamvirus grondig en verdun het virus tot 2 PFU/μL met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) in een voorgekoelde buis van 1,5 ml.
  3. Muizenverdovendheid: weeg elke muis en bereken het volume (4-voudig (μL) het muisgewicht (g)) van natriumpentobarbital (2 mg/ml) dat moet worden gebruikt. Injecteer het berekende volume natriumpentobarbitale intraperitoneale.
    OPMERKING: Deze stap is om muizen gestaag en vredig te laten ademen, zodat nauwkeurige titer van het virus intranasaal kan worden ingeënt. Te snelle of trage hartslagen duiden op ongepaste verdoven. Bovendien wordt het gebruik van dierenartszalf aanbevolen om droogheid van de ogen te voorkomen.
  4. Intranasale inenting: vortex het verdunde PR8-virus grondig. Pipet 10 μL en voer zorgvuldig intranasale inenting uit aan één kant druppel voor druppel. Na het beëindigen van de inenting van alle muizen in één kooi (maximaal 5 muizen) aan deze kant, herhaal de inenting aan de andere kant (houd de ademhaling van de muis rustig en stabiel door de inenting). Elke muis is geïnfecteerd met 40 PFU van PR8 virus in totaal.
  5. Plaats de muizen in strenge ligfietsen in warme kooien voor een betere heropleving.
  6. Controleer het muisgewicht dagelijks gedurende 10 dagen. (De infectiedag wordt geregistreerd als Dag 0).

2. Isolatie van lymfocyten van milt en mediastinum lymfeklier (mLN)

  1. Muizen euthanasatie: plaats de muizen in een kleine kamer en euthanaseer de muizen door rustig in CO2 te pompen vanaf de onderkant van de kamer. Haal muizen eruit wanneer ze niet bewegen en voer cervicale ontwrichting uit om ervoor te zorgen dat muizen volledig sterven. Dompel de muizen onder met 75% ethanol en breng over naar de bioveiligheidskap.
  2. Immobiliseer de muizen met dissectienaalden op de absorberende met papier bedekte dissectieschuimplaat. Snijd de huid langs de middelste buiklijn en de achterpoten met een dissectieschaar en strek de huid met een pincet. Immobiliseer de uitgerekte huid met dissectienaalden.
  3. Bereid twee gerechten van 6 cm voor elke muis en bewaar ze op het ijs. Doe in elke schaal een celzeef van 70 μm en voeg 5 ml DMEM toe aangevuld met 1% foetaal runderserum (DMEM (1% FBS))
  4. Miltisolatie: snijd het buikvlies om de buikholte bloot te leggen met een dissectieschaar. Neem de milt en doe deze in de voorbereide schaal.
  5. mLN isolatie: snijd het diafragma en de bodem van de kooirib in de buurt van thymus. Trek de rib opzij en speld deze met dissectienaalden om de borstholte bloot te leggen. Trek de long opzij naar de rechterkant en gebruik een pincet om mLN te nemen, onder het hart en in de buurt van de ventrale kant van de luchtpijp.
  6. Doe de mlN in de voorbereide schaal.
  7. Verkrijg de eencellige suspensies: ga voorzichtig met een zuiger van 3 ml spuit door de 70-μm celzeef. Spoel de celzeef af met 1 ml verse DMEM (1% FBS). Resuspendeer de celsuspensie en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml.
  8. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Verwijder supernatant en voeg 1 ml DMEM (1% FBS) toe.
  9. Resuspendeer de celkorrel grondig met 1 ml-pipet. Voeg 4 ml DMEM (1% FBS) toe aan miltcelsuspensies en houd ze in het ijs voor de volgende bewerkingen.
    OPMERKING: Het is noodzakelijk om de celpellet te resuspenderen met 1 ml medium in de eerste plaats, niet 5 ml, voor het volledig isoleren van enkele cellen van pellet.
    Vanaf deze stap kunnen alle bewerkingen in het reguliere lab worden uitgevoerd.
  10. Miltceltelling
    1. Resuspend cellen door de buizen meerdere keren op en neer te draaien. Neem 10 μL in 90 μL rode bloedcellen (RBC) lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155mM NH4Cl). Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten en voeg 900 μL koude PBS toe om de reactie te beëindigen.
    2. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 6 min bij 4 °C en verwijder supernatant. Resuspend met 100 μL koude PBS. Neem 10 μL cellen in 10 μL van 0,4% w/v trypan blauw en haal 10 μL uit het mengsel voor het tellen van cellen met de hemocytometer.
    3. Berekening: cellen berekenen als reguliere methode. Kortom, tel celnummers in twee diagonale hoekvierkanten op de hemocytometer en krijg N1, N2 voor elk hoekvierkant. De celconcentratie van de celsuspensie van 5 ml moet worden berekend als (N1+N2)/2 x 104 /ml.

3. Immunostaining van polyklonale Tfh-cellen met PD-1 en CXCR5

  1. Kleuring met biotine-anti-CXCR5 antilichaam.
    1. Resuspend celsuspensies door de buis op en neer te draaien. Neem 2 x 106 cellen in de FACS-buis en voeg 2 ml kleurbuffer (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)) toe. Was door vortex op het vortex oscillatieapparaat.
    2. Centrifugeren bij 350 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de vloeistof eruit te gieten en dompel de buismond twee keer op het absorberende papier.
    3. Maak de celkorrel los met de residuvloeistof door op de bodem van de buis te tikken. Plaats de buis in de buishouder op ijs.
      OPMERKING: Het volume residuvloeistof is ongeveer 25 μL.
    4. Voeg 0,2 μL anti-muis CD16/CD32 (Fc-receptor blocker) toe voor elke buis. Vortex door zachtjes op de buisbodem te tikken en 10 minuten op ijs te incuberen.
      OPMERKING: Bereid het antilichaammengsel voor meerdere monsters door verdunning met 5μL kleurbuffer voor elke buis. Het recept voor het mengsel moet worden bereid door verdunnen (n/10+1) x 0,2 μL Fc-receptorblokker in (n/10+1) x 5 μL kleurbuffer en voeg 5,2 μL-mengsel toe aan elke buis.
    5. Voeg 0,3 μL biotine-antimuis CXCR5 toe aan het residu 30 μL kleurbuffer voor elke buis en vortex door op de buisbodem te tikken.
      OPMERKING: Bereid het mengsel zoals beschreven in stap 3.1.4.
    6. Incubeer gedurende 1 uur op ijs met voorzichtig resuspenderende cellen door op 30 minuten op de buis te tikken.
      OPMERKING: Vortex op 30 min is om celaggregaten te vermijden voor betere kleuring.
    7. Voeg 2 ml kleurbuffer en vortex toe aan het vortex-oscillatieapparaat. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 6 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg zoals beschreven in stap 3.1.2. Vortex door op de buis te tikken en op ijs te incuberen voor latere kleuring.
  2. Vlekken met andere oppervlaktemarkeringen.
    1. Bereid het antilichaammengsel (tabel 1) zoals beschreven in stap 3.1.4.
    2. Voeg antilichaammengsel toe aan elke buis. Vortex door op de buisbodem te tikken en 30 minuten op ijs te incuberen.
    3. Was cellen met 2 ml kleuringsbuffer. Centrifugeren bij 350 x g gedurende 6 min bij 4 °C.
    4. Gooi het supernatant weg en voeg 400 μL kleurbuffer toe. Vortex de buis op de vortex oscillatie apparaat en houd de buis in het donker tot flow cytometrie analyse.

4. Immunostaining van PR8 influenzavirus NP-specifieke Tfh-cellen

OPMERKING: Dit protocol voor het beitsen van NP-specifieke Tfh-cellen komt uit eerdere studies15,17.

  1. Biotine-CXCR5-kleuring uitvoeren zoals beschreven in stap 3.1, met dien verstande dat het celnummer dat voor kleuring wordt genomen 3 x 106 is voor voldoende antigeenspecifieke cellen om in stroomcytometrie te worden geregistreerd.
  2. Voeg 0,3 μL APC-geconjugeerde-IAbNP311-325 MHC klasse II (NP311-325) tetramer toe aan de buis van 3.1.7. Bereid het mengsel voor op meerdere monsters zoals in stap 3.1.4
    OPMERKING: Het is belangrijk om tetrameer te beitsen voordat anti-CD4-antilichamen worden toevoeging, omdat de binding tussen CD4 en anti-CD4-antilichaam de optimale tetrameerkleuring zou verstoren.
  3. Resuspend het celmengsel door zachtjes op de buis te tikken en in het donker te incuberen bij RT gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Bedek een nat papier op de mond van buizen om verdamping te verminderen
  4. Voeg het mengsel van andere oppervlaktemarkeringen toe (tabel 1) en ga 30 minuten door met incubatie bij RT.
  5. Was en resuspend cellen zoals beschreven in stap 3.2.3 en 3.2.4.

5. Immunostaining van Bcl6 in polyklonale Tfh-cellen

  1. Oppervlaktemarkeringen uitvoeren (tabel 2) kleuring zoals beschreven in punt 3, behalve dat de laatste wasbeurt met 2 ml PBS, in plaats van vlekkenbuffer.
  2. Centrifugeren bij 350 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en resuspend celkorrels door zachtjes op de buisbodem te tikken.
  3. Voeg 300 μL 3,7% formaldehydeoplossing (verdund van 37% formaldehyde met PBS) toe aan de buis voor celfixatie. Vortex op het vortex oscillatie apparaat en incuberen bij RT gedurende 20 min.
  4. Voeg 2 ml kleuringsbuffer toe voor wassen en centrifugeren bij 500 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en resuspend cellen door zachtjes op de buis te tikken.
  5. Voeg 300 μL van 0,2% Triton-X 100 toe en resuspend cellen door vortex op het vortex oscillatieapparaat. Incubatie bij RT gedurende 15 minuten.
  6. Voeg 2 ml kleuringsbuffer toe voor het wassen. Centrifugeren bij 500 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Gooi supernatant weg en resuspend cellen door zachtjes op de buisbodem te tikken.
  7. Voeg 1,5 μL PE-anti-Bcl6 antilichaam toe voor elke buis. Tik zachtjes op de bodem van de buis om het mengsel te resuspenderen en broed gedurende 2 uur bij RT met elke 30 minuten zachtjes op de buis te tikken.
    OPMERKING: Bedek een nat papier op de mond van buizen om de verdamping van het mengsel te verminderen.
  8. Voeg 2 ml PBS aangevuld met 0,01% Triton-X 100 toe aan de buis. Vortex en centrifugeren bij 500 x g gedurende 6 min bij 4 °C.
  9. Herhaal wassen als stap 5.8. Resuspend cellen met 400 μL kleuringsbuffer. Houd cellen in het donker op ijs tot de flowcytometrie analyse.

6. Intracellulaire kleuring van IL21

  1. Stimuleer cellen met PMA (phorbol 12-myristaat 13-acetaat) en ionomycine.
    1. Neem 2 x 106 cellen uit miltcelsuspensie en centrifugeer bij 350 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en resuspend celkorrel met 500 μL volledig T-celmedium. Breng de cellen over in de 24-putplaat.
    2. Voeg 20 nmol PMA en 2 μmol ionomycine toe aan 500 μL van volledig medium18 en meng grondig door op en neer te pipetten.
    3. Voeg in stap 6.2 bereide oplossing toe aan celsuspensie in de 24-putplaat en meng door de plaat te schudden. Stel de niet-gestimuleerde controle in door 500 μL volledig T-celmedium toe te voegen zonder toevoeging van PMA en ionomycine in de cellen. Incuber in een CO2-incubator bij 37°C gedurende 4 uur.
    4. Voeg 10 μmol BFA (Brefeldin A, opgelost met methanol) toe aan elke put om het Golgi-apparaat gemedieerd eiwittransport te blokkeren. Plaats de plaat terug naar de celincubator en incubeer gedurende 2 uur.
  2. Voer kleuring van celoppervlakmarkeringen uit.
    1. Resuspend cellen door zachtjes op en neer te spuiten en de cellen over te brengen in een FACS-buis. Voeg 1 ml kleurbuffer toe aan de buis en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 4 °C bij 350 x g.
    2. Voer fc-receptor blocker kleuring uit als stap 3.1.4.
    3. Celoppervlakmarkeringen(tabel 3) uitvoeren zoals beschreven in de stappen 3.2.1 tot en met 3.2.3, met uitzondering van wascellen met 2 ml PBS.
    4. Centrifugeren bij 350 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en resuspend cellen door op de buisbodem te tikken.
  3. Voeg 0,2 μL reagens uit de Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell kleurset toe en incubeer de buis gedurende 10 minuten in het donker bij RT om de kleuring van dode cellen uit te voeren.
  4. Voeg 2 ml PBS toe aan de buis en vortex op het vortex oscillatieapparaat. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  5. Voer de celfixatie uit zoals beschreven in stap 5.3 en 5.4.
  6. Voeg 300 μL kleuringsbuffer toe om cellen te resuspenderen en bewaar de buizen 's nachts in de koelkast van 4 °C. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 6 min bij 4 °C om het supernatant te verwijderen.
    OPMERKING: Deze stap kan worden weggelaten en direct na stap 6.5 stap 6.7 blijven volgen.
  7. Voeg 1 ml saponinenbuffer (kleuringsbuffer aangevuld met 0,2% (w/v) saponine) toe aan de buis en vortex op het vortexoscillatieapparaat. Incub op ijs gedurende 20 minuten om celpermeabilisatie uit te voeren.
  8. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 6 min bij 4 °C en gooi supernatant weg.
  9. Voeg 0,5 μL menselijke Fc-IL21-receptor toe aan elke buis. Bereid het antilichaammengsel voor meerdere als stap 3.1.4, behalve dat verdunde antilichamen met saponinenbuffer in plaats van kleuringsbuffer.
  10. Incubeer bij RT gedurende 1 uur met zachtjes op de buisbodem te tikken om cellen op 30 minuten te resuspenderen.
  11. Voeg 2 ml saponinebuffer toe om cellen te wassen en centrifugeer gedurende 6 minuten op 500 x g. Gooi supernatant weg en herhaal de was eenmaal.
  12. Voeg 0,1 μL APC-anti-menselijke Ig(H+L) toe aan elke buis. Bereid het mengsel voor meerdere monsters voor als stap 3.1.4, behalve dat verdunde antilichaam met saponinenbuffer in plaats van kleuringsbuffer.
  13. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs en was als stap 6.11.
  14. Resuspend cellen met 400 μL kleuringsbuffer. Bewaar het monster in het donker op ijs tot de flowcytometrie analyse.

7. GC B en plasmacellen kleuring

  1. Neem cellen en voer anti-Fc-receptor antilichaamkleuring uit als stappen van 3.1.1 tot 3.1.4.
  2. Voer oppervlaktemarkeringen(tabel 4) uit als stappen van 3.1.5 tot 3.1.7, behalve dat de incubatietijd 30 minuten is in plaats van 1 uur.
  3. Resuspend cellen met 400 μL kleuringsbuffer. Bewaar de monsters in het donker op ijs tot de flowcytometrie analyse.

8. Isolatie van serum uit bloed

  1. Verzamel op dag 14 na infectie (d.p.i 14) het bloed uit de gezichtsader en bewaar 's nachts bloedmonsters in een koelkast van 4 °C.
    OPMERKING: Voer bloedafname uit bij ABSL2-toestand en vanaf deze stap kunnen alle procedures in het reguliere lab worden uitgevoerd.
  2. Centrifugeer het bloed bij 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Isoleer het serum zorgvuldig met de pipet van 200 μL om vervuiling van rode bloedcellen te voorkomen. Aliquot in 3 buizen voor elk monster en bewaar ze op -80°C.

9. Test van HA-specifieke antilichaam titer met ELISA

  1. Bedek ELISA-platen met 50 μL van 2 μg/ml HA-eiwitoplossing per put en incubeer ze 's nachts in de koelkast van 4 °C.
  2. Was drie keer met 200 μL PBS-verdunde 0,05% tween (PBST). Voeg 100 μL PBST-verdunde 5% magere melk toe aan elke put en incub bij RT gedurende 2 uur om de niet-specifieke binding te blokkeren.
  3. Serumverdunning en incubatie: bereid 3% BSA in PBS voor als verdunningsbuffer. Verdun het serum in verdunningsbuffer als 1:50, 1:150, 1:450, ...... tot 1:36450 (3-voudige seriële verdunning wordt aanbevolen). Voeg 50 μL verdund serum toe aan elke put en broed 's nachts in de koelkast van 4°C.
  4. Gooi het serum weg en was de putten snel één keer door 200 μL PBST aan elke put toe te voegen (schud het zachtjes en gooi het vervolgens weg). Was vervolgens de platen langzaam op shaker met 200 μL PBST drie keer gedurende 5 minuten elk.
  5. Voeg 100 μL HRP-gelabeld secundair antilichaam toe dat specifiek is voor totaal IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, verdund met PBST) en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Was de platen volgens PBST zoals beschreven in punt 9.4.
  6. Haal hetzelfde volume Buffer A en Buffer B (TMB) uit de opslag van 4 °C en warm minstens 30 minuten op bij RT voor gebruik. Meng A en B en voeg 100 μL TMB toe aan elke put en incubeer ze gedurende 10-30 minuten bij RT door zachtjes te schudden.
    OPMERKING: Dit is een korte beschrijving van de handleiding TMB Substrate Reagent Set (BD,555214).
  7. Pipet 100 μL van 2M H2SO4 in elke put om de reactie te beëindigen. Lees de OD450-waarde door middel van een instrument.
  8. Gegevensanalyse: haal de uiteindelijke OD450-waarde op door het achtergrondsignaal (OD450-waarde van lege put) af te trekken. Teken de curve die overeenkomt met een antilichaamisotype van elk monster met de verdunningsfactor op de X-as en de OD450-waarde op de Y-as.

10. Histologie

  1. Isoleer de milt bij D.P.I 10. Fixeer ze in 3,7% formaldehydeoplossing gedurende 1 uur bij RT. Gooi de fixatiebuffer weg en was gedurende 5 minuten met PBS op de shaker.
  2. Droog de milt in PBS (10% sacharose) gedurende 1 uur uit bij 4°C en droog ze vervolgens uit in PBS (30% sacharose) bij 4°C met zacht schudden totdat de milt naar de bodem van de 15 ml buis zakt.
  3. Haal de gedehydrateerde milt eruit, veranker ze in een optimale snijtemperatuurverbinding en cryosectioned.
  4. Koel de aceton voor op -20°C. Incubeer de weefselsecties gedurende 10 minuten met voorgekoelde aceton. Was het weefsel drie keer met PBS.
  5. Permeabiliseer de weefselsecties met PBS die 0,2% Triton X-100 gedurende 20 minuten bevatten en was ze drie keer met PBS.
  6. Blokkeer de niet-specifieke binding met PBS die 10% normaal geitenserum (blokkerende buffer) gedurende 1 uur bij RT bevat en was de weefselsecties eenmaal met PBS.
  7. Blokkeer de niet-specifieke binding met STREPTAVIDIN/BIOTIN-blokkeringskit.
    OPMERKING: Laat de monsters vanaf deze stap niet drogen.
  8. Kleuring met primair antilichaam: voeg voorzichtig blokkerende bufferverdunde biotine-PNA (25 μg/ml) en rattenantimuis IgD (2,5 μg/ml) toe aan de weefselsecties. Incubeer de weefselsecties in de natte kamer in de vriezer van 4 °C 's nachts.
  9. Was de weefselsecties snel één keer met PBST. Was de weefselsecties in de PBST snel met langzaam schudden gedurende 5 minuten. Herhaal het wassen gedurende drie keer.
  10. Verdun Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) en Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) antilichamen met blokkerende buffer en voeg ze voorzichtig toe aan de weefselsecties
  11. Incuberen bij RT gedurende 1 uur.
  12. Was de weefselsecties als stap 10.8 en monteer voorzichtig met de verlengoplossing. Bedek het weefsel zorgvuldig met deklips en houd ze in het donker op 4 °C tot confocale analyse.
  13. Analyseer de grootte van de GC-reactie door de GC-getallen per gebiedsgrootte te tellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Karakterisering van de morbiditeit van de muis bij influenzavirusinfectie
Na influenzavirusinfectie zijn muizen minder actief en anorexia als gevolg van ziekte, wat wordt weerspiegeld door ernstig gewichtsverlies, een veelgebruikt symptoom om de morbiditeit van de muis te controleren19. Zoals getoond in figuur 1a,begonnen met het PR8-virus geïnfecteerde muizen gewicht te verliezen op dag 6, bereikten het hoogste verliesniveau op d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vanwege gespecialiseerde rollen in het bieden van B-celhulp voor het genereren van antilichamen met een hoge affiniteit, zijn Tfh-cellen uitgebreid bestudeerd in de mechanismen van differentiatie en manipulatie om nieuwe strategieën voor het ontwerp van vaccins te bieden. Influenzavirusinfectie veroorzaakt krachtige Tfh- en GC B-celresponsen, waardoor het een geschikt model is voor dit onderzoeksveld. In dit artikel beschreven we protocollen van influenzavirusinfectie door intranasale inenting, evaluatie van Tfh-geassoci...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken het personeel van flow cytometrie faciliteit, ABSL2 faciliteit en SPF dierlijke faciliteit van Institut Pasteur van Shanghai voor hun technische hulp en advies. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: Strategic Priority Research Program van de Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), de National Natural Science Foundation of China (31570886).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6
37% formaldehydeSigmaF1635
Anti-CD16/32 mouseThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504clone:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82clone: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82clone:GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42clone:IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82clone:IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150clone:MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070clone:7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216clone:29F.1A12
Streptavidin BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
Intracelluar staining of IL21
37% formaldehydeSigmaF1635
anti-human IgGJackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
human FCc IL-21 receptorR&D System
ionomycinSigmaI0634
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kitThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinMP102855
GC B and plasma cells staining
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81clone:RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070clone:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653clone:Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82clone:11-26c
PNA FITCSigmaL7381
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Substrate Reagent SetBD Pharmingen555214
Histology
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgGLife TechnologyA21434
anti-mouse IgDBiolegend405702
biotinylated PNAVector laboratoriesB-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidinLife TechnologyS11223
normal goat serumSouthernBiotech0060-01
Pro-long gold antifade reagentThermo Fisher ScientificP3630
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kitVector laboratoriesSP-2002

Referenties

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495(2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Flowcytometrie-analyseCXCR5-kleuringELISA-assayimmunofluorescentiedetectieisolatie van lymfeklierenmiltcel-suspensievirusinoculatieprotocol
Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.