Methodenartikel

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

DOI:

10.3791/60538

⸱

13 december 2019

 ,  , 
1Center for Nanomedicine and Theranostics, Technical University of Denmark, 2Center for Intestinal Absorption and Transport of Biopharmaceuticals, Technical University of Denmark, 3Department of Health Technology, Technical University of Denmark

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste onderzoek met liposomen als membraan modelsystemen of dragers van de levering van geneesmiddelen is afhankelijk van bulk read-out technieken en dus intrinsiek veronderstelt dat alle liposomen van het ensemble identiek zijn. Echter, nieuwe experimentele platforms die liposomen kunnen observeren op het niveau van één deeltje hebben het mogelijk gemaakt om zeer verfijnde en kwantitatieve studies uit te voeren over eiwit-membraan interacties of geneesmiddel drager eigenschappen op individuele liposomen, dus het voorkomen van fouten uit het ensemble gemiddelde. Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden, opsporen en analyseren van enkele liposomen met behulp van een microscopie-test op basis van fluorescentie, die dergelijke metingen van één deeltjes vergemakkelijkt. De Setup maakt het mogelijk om individuele liposomen op een enorme parallelle manier te laten zien en wordt gebruikt om intra-samplegrootte en compositionele inhomogeniteiten te onthullen. Bovendien beschrijft het protocol de voordelen van het bestuderen van liposomen op het enkele liposoom niveau, de beperkingen van de assay en de belangrijke functies die overwogen moeten worden bij het wijzigen van andere onderzoeksvragen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liposomen zijn sferische fosfolipide-gebaseerde blaasjes die sterk worden gebruikt zowel in basis-en toegepast onderzoek. Ze functioneren als uitstekende membraan modelsystemen, omdat hun fysiochemische eigenschappen gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd door de lipide-componenten die de liposoom1,2vormen, tevariëren. Ook, liposomen vormen de meest gebruikte drug levering nanocarrier systeem, het aanbieden van verbeterde farmacokinetiek en farmacodynamiek, alsmede hoge biocompatibiliteit3.

Voor vele jaren, liposomen zijn voornamelijk bestudeerd met behulp van bulk technieken, geven alleen toegang tot ensemble gemiddelde uitleeswaarden. Dit heeft geleid tot de meerderheid van deze studies om aan te nemen dat alle liposomen in het ensemble identiek zijn. Dergelijke ensemble-gemiddelde waarden zijn echter alleen correct als de onderliggende gegevensset uniform is verdeeld rond de gemiddelde waarde, maar een valse en bevooroordeelde conclusie kan vertegenwoordigen als de gegevensset meerdere onafhankelijke populaties bevat, bijvoorbeeld. Bovendien, ervan uitgaande dat het ensemble betekent om de hele bevolking te vertegenwoordigen, kan de informatie die zich verveelt binnen de onhomogeniteit tussen liposomen, vergeten. Pas recentelijk zijn kwantitatieve testen naar voren gekomen die in staat zijn enkele liposomen te onderzoeken, waardoor grote homogeniteiten tussen individuele liposomen worden onthuld met betrekking tot belangrijke fysisch-chemische eigenschappen, waaronder liposoom size4, lipide-compositie5,6en inkapings efficiëntie7, waarbij het belang van het bestuderen van liposomen op het enkele liposoom niveau wordt benadrukt.

Een onderzoeksgebied waar het gemiddelde van de liposoom eigenschappen van het ensemble is aangetoond dat de resultaten van de liposoom grootte afhankelijke eiwit-membraan interacties8,9bestuderen. Traditioneel, onderzoekers bestuderen van dergelijke processen zijn beperkt tot het voorbereiden van liposomen met verschillende ensemble gemiddelde diameters door extrusie door middel van filters met verschillende porie maten9. Echter, het extraheren van de diameter van individuele liposomen met behulp van enkele liposoom-assays heeft grote populatie overlapt onthuld, met liposomen geëxtrudeerd met 100 nm en 200 nm-filters die tot 70% overlappen in hun grootteverdeling4. Dit kan ernstige bias bulk metingen van liposoom grootte afhankelijke eiwit-membraan interacties10. Het uitvoeren van de membraan-eiwit interactiestudies met behulp van de enkelvoudige liposoom Assay, onderzoekers in plaats daarvan profiteerde van de grootte-polydispersiteit in het monster, waardoor ze een breed scala van liposoom diameters binnen elk experiment te bestuderen, het faciliteren van nieuwe ontdekkingen van hoe membraan kromming en samenstelling kan invloed hebben op eiwit werving voor membranen4,11,12. Een ander gebied waar de toepassing van één liposoom assays heeft bewezen instrumentale is in mechanistische studies van eiwit-gemedieerde membraan fusie13,14. Voor dergelijke kinetische metingen, de mogelijkheid om individuele fusie-evenementen te bestuderen verlicht de noodzaak voor de experimentele synchronisatie van het fusieproces, waardoor nieuwe mechanistische inzichten die anders zou zijn verloren in de spatiotemporele gemiddelden gedaan in bulk ensemble metingen. Daarnaast zijn enkele liposomen gebruikt als een membraan steiger, waardoor individuele eiwitten kunnen worden gemeten en nieuwe kennis kan worden gemaakt over transmembraan proteïne Structural Dynamics15,16. Bovendien maakten dergelijke op proteoliposome gebaseerde opstellingen het mogelijk om de functie van individuele transmembraan transporters te bestuderen17 en Pore-vormende proteïne complexen18 en het mechanisme van bioactieve membraan-permeabilizing peptiden19. Enkele liposomen zijn ook gebruikt als zachte stof nanofluïdica met oppervlakte-geïmmobiliseerde enkele liposomen die als kamers dienen voor enzymatische reacties in volumes van 10-19 L, waardoor de doorvoer en complexiteit van de screening testen met minimaal productverbruik20.

Onlangs zijn enkele liposoom-assays gebruikt voor het karakteriseren van medicijn leveringsliposomen op een eerder onprecenspringende detailniveau. Onderzoekers waren in staat om significante inhomogeneities te kwantificeren in de hoeveelheid polymeer die aan het oppervlak van individuele liposomen is bevestigd21. De enkele liposoom assays ook toegestaan metingen van de levering van de drug liposomen in complexe media, zoals bloed plasma, onthullen hoe elementen verankerd aan het liposoom oppervlak door middel van lipide ankers kunnen worden vatbaar voor dissociatie wanneer liposomen worden blootgesteld aan omstandigheden nabootsen die ervaren tijdens in vivo circulatie22. Over het algemeen worden de veelzijdigheid en het nut van de enkelvoudige liposoom-assays onderbouwd door de grote verscheidenheid aan problemen die deze opstellingen hebben gehanteerd om aan te pakken, en we stellen voor dat de methodologie zal blijven worden ontwikkeld en het gebruik in nieuwe wetenschappelijke velden te vinden.

Hier beschrijven we een fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom assay die het mogelijk maakt individuele liposomen op een hoge doorvoer te laten studeren (Figuur 1). Om de methode te illustreren, gebruiken we het om de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen individuele liposomen binnen een ensemble te kwantificeren. De assay maakt gebruik van fluorescentiemicroscoop beeldvorming van enkele liposomen geïmmobiliseerd op een gepassiveerde glazen oppervlak. We beschrijven eerst de kritische stappen in het liposoom fabricageproces dat zorgt voor een goede fluorescerende liposoom labeling en immobilisatie. Vervolgens beschrijven we de oppervlakte voorbereiding die nodig is om de liposoom-immobilisatie te vergemakkelijken voordat de procedure wordt beschreven voor het waarborgen van geschikte liposoom-oppervlakte dichtheden. We bespreken de microscopie parameters belangrijk voor het verwerven van afbeeldingen van hoge kwaliteit en afbakenen hoe eenvoudige data-analyse uit te voeren, waardoor de extractie van liposoom grootte en compositorische inhomogeniteit. Dit generieke protocol zou een goede basis moeten vormen voor de geïnteresseerde onderzoeker om de assay verder te ontwikkelen voor zijn of haar specifieke onderzoeksinteresse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van liposoom

Opmerking: in het kort bevat de bereiding van liposomen meestal drie cruciale stappen: 1) bereiding van droge lipide-films van de gewenste lipide-samenstelling; 2) rehydratie van de lipiden voor de vorming van liposomen; en 3) beheersing van de grootte en lamellariteit van de liposoom populatie.

  1. Weeg de lipiden af en los ze op in tert-butanol: water (9:1) in glazen flesjes.
    1. Los POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine; MW = 760 g/mol) tot 50 mM.
    2. Los cholesterol (MW = 387 g/mol) op tot 25 mM.
    3. Ontbinden DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-Atto488; MW = 1.316 g/mol) tot 0,1 mM.
    4. Ontbinden DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-Atto655; MW = 1.368 g/mol) tot 0,1 mM.
    5. Ontbinden DSPE-PEG2000-Biotine (1,2-distearyl-SN-glycero-3-fosfatethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleenglycol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) tot 0,1 mM.
      Opmerking: hitte lipiden tot 55 °C en gebruik magnetisch roeren om een volledige ontbinding van de lipiden te garanderen. U ook een sonicatiebad gebruiken. Ongebruikte lipiden voorraden kunnen gedurende enkele maanden bij-20 °C worden bewaard.
  2. Meng de lipide-voorraden bereid in stap 1,1 naar een molaire verhouding van POPC: cholesterol: DOPE-Atto488: DOPE-Atto655: DOPE-PEG-Biotine 68.95:30:0,5:0,5:0,05, door toevoeging van 138 μL POPC, 120 μL cholesterol, 500 μL van elk fluorescently gelabelde lipide, en 50 μL DSPE-PEG-Biotine op een frisse glazen injectieflacon.
    Opmerking: de exacte samenstelling van het liposoom kan gemakkelijk worden aangepast om de specifieke vraag van belang aan te pakken. Zie discussie voor meer informatie.
  3. Maak de deksel van de glazen injectieflacon los en klik de injectieflacon in vloeibare stikstof in de vriezer.
  4. Lyophilize het bevroren lipide mengsel 's nachts.
  5. Voeg 1 mL 200 mM D-Sorbitol buffer (sorbitol buffer) toe aan de droge lipiden.
  6. Verwarm het mengsel tot 45 °C en bloot aan magnetisch roeren gedurende ten minste 1 uur.
    Opmerking: de buffer moet overeenkomen met de specifieke vraag die wordt behandeld (bijv. fysiologische omstandigheden voor het bestuderen van membraan-eiwit interacties, of een specifieke klinisch goedgekeurde buffer voor het bestuderen van liposomen voor het leveren van geneesmiddelen). Echter, als een specifieke buffer niet vereist is voor het onderzoek, kan een buffer zonder ionen worden toegepast voor rehydratatie om de multilamellariteit van de liposomen te verminderen.
  7. Vries de lipide suspensie door de injectieflacon in vloeibare stikstof te dompelen en wacht tot de suspensie volledig is bevroren.
  8. Dompel de bevroren suspensie in een verwarmingbad bij 55 °C tot het mengsel volledig ontdooid is.
  9. Herhaal de stappen 1,7 en 1,8 totdat de liposoom suspensie is blootgesteld aan een totaal van 11 Vries/ontdooien cycli.
    Opmerking: herhaalde vries/dooi cycli hebben aangetoond dat het liposoom multilamellariteit23vermindert, wat van essentieel belang is voor de nauwkeurigheid van de enkelvoudige liposoom test, omdat multilamellaire liposomen de fluorescentie intensiteit versus de grootte verhouding van de liposoom van de liposomen zullen scheeftrekken. De multilamellariteit is meestal inherent laag bij het opnemen van meer dan 0,5% Gepegyleerd lipide in de formulering (zoals gewoonlijk gedaan in liposomen voor de levering van geneesmiddelen)24.
  10. Extruderen de liposoom suspensie eenmaal via een 800 nm polycarbonaat filter met behulp van een mini extrusieset. Volg de instructies van de fabrikant voor montage van de extrusiekit (Zie tabel met materialen).
  11. Bewaar de liposomen 's nachts bij 4 °C.

2. oppervlakte voorbereiding van de beeldvormings kamer

  1. Bereid bovien serumalbumine (BSA; 1 mg/mL), BSA-Biotine (1 mg/mL) en streptavidine (0,025 mg/mL) in 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur) 95 mM NaCl-buffer (HEPES-buffer).
    Opmerking: om Liposomale barsten te voorkomen, moet de sorbitol-buffer die wordt gebruikt voor rehydratatie en de HEPES-buffer die wordt gebruikt voor oppervlakte voorbereiding, isotone zijn. Het wordt daarom aanbevolen om de osmolariteit van de buffers vóór het experiment te controleren.
  2. Meng 1.200 μL BSA en 120 μL BSA-Biotine en voeg 300 μL van het mengsel toe aan elk goed in een 8-put voor microscopie.
    Opmerking: hier gebruiken we een in de handel verkrijgbare 8 well Microscoop Slide met een glazen bodem (Zie tabel van materialen), maar het protocol kan eenvoudig worden aangepast aan op maat gemaakte Microscoop kamers.
  3. Inbroed de glijbaan gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  4. Was de glijbaan 8x met 300 μL HEPES-buffer.
    Let op: Zorg ervoor dat u de putjes niet langer dan een paar seconden zonder buffer laat, want het uitdrogen van het oppervlak zal het beschadigen. Zorg er bovendien voor dat u het oppervlak niet krabt met de pipetpunt, want dit zal het ook beschadigen. Dus, wanneer aspirerende buffer uit een put, doe het vanaf de rand of hoek.
  5. Voeg 250 μL streptavidine toe en inincuberen gedurende 10 min bij RT.
  6. Herhaal de 8 wast beschreven in stap 2,4.
  7. Bewaar de Microscoop glijbaan met 300 μL sorbitol buffer in elke put bij 4 °C. Verdamping van het oplosmiddel zal het oppervlak beschadigen, dus zet de Microscoop dia in een Petri schaaltje en verzegel het met Parafilm tenzij de bereide glijbaan onmiddellijk wordt gebruikt.

3. Liposome immobilisatie

  1. Verdun de liposoom suspensie tot ongeveer 20 μM totaal lipide in sorbitol buffer. De procedure in sectie 1 zal een liposoom suspensie van ongeveer 10 mM totaal lipide opleveren.
  2. Plaats de dia op de Microscoop en concentreer u op het oppervlak van de kamer met behulp van het verhoogde Laser reflectie signaal van de glas/buffer interface als leidraad.
  3. Was de kamer 4x met 300 μL verse HEPES-buffer.
  4. Voeg 10 μL verdunde liposoom kolf (20 μM totaal lipide) toe aan een micro centrifugebuis.
  5. Neem 100 μL buffer uit de kamer, voeg toe aan de microcentrifuge buis bereid in stap 3,4, meng goed en plaats de 110 μL terug in de kamer.
  6. Plaats het preparaat onder de Microscoop en gebruik een rudimentale Microscoop-instelling die het signaal van de liposoom fluorophore (s) kan detecteren om de liposomen te observeren die op het oppervlak worden geïmmobiliseerd.
  7. Streef naar een liposoom oppervlaktedichtheid die tegelijkertijd schaars genoeg is om individuele liposomen te indentificeren en dicht genoeg dat het hoge doorvoer metingen vergemakkelijkt. Meestal met een 50 μm x 50 μm gezichtsveld is 300 − 400 liposomen per frame optimaal (Figuur 2). Dit kan meestal worden bereikt binnen 5 − 10 min.
    Opmerking: als er alleen snel bewegende fluorescerende deeltjes worden gedetecteerd in het gezichtsveld, kan een afwezigheid of te lage concentratie van een van de componenten die kritisch zijn voor het immobilisatie proces (BSA-biotine, streptavidin, DOPE-PEG-Biotine) de oorzaak zijn. Als er geen liposomen worden gedetecteerd, kan het ofwel gerelateerd zijn aan een lage concentratie van liposomen, onjuiste instellingen voor de fluorescentiedetectie, of mogelijk beeldvorming met een brandvlak niet op het glazen oppervlak.
  8. Nadat een geschikte liposoom oppervlaktedichtheid is bereikt, was de kamer 3x met 200 μL Hepes-buffer.
    Opmerking: Houd er rekening mee dat de immobilisatie kinetiek ook afhankelijk is van liposoom eigenschappen zoals grootte en lading en daarom altijd moet worden geoptimaliseerd voor elke liposoom formulering.

4. beeld verwerving

Opmerking: deze sectie zal veel afhangen van het Microscoop systeem dat beschikbaar is voor de onderzoeker die het experiment uitvoert. Er worden dus algemene richtlijnen beschreven voor het uitvoeren van de beeldvorming. Echter, de exacte instellingen en hoe ze toe te passen zal variëren tussen de verschillende Microscoop opstellingen. Sommige systemen kunnen bijvoorbeeld een gewenste combinatie van emissie filters kiezen, terwijl andere microscopen zijn uitgerust met specifieke, vooraf ingestelde filters.

  1. Stel de Microscoop in voorbeeld vormende enkele liposomen. Voor een optimale beeldkwaliteit en de daaropvolgende gegevensanalyse gebruikt u een hoge grijstinten-resolutie en een pixel schema waarmee u afzonderlijke liposomen oversampling. Een bitdiepte van 16 en ten minste 1.024 x 1.024 pixels voor een oppervlakte van 50 μm x 50 μm wordt aanbevolen. Indien beschikbaar kan regel middeling worden toegepast om ruis te verminderen (bijvoorbeeld 3 scans per lijn).
  2. Selecteer een excitatie Laser vermogen dat zowel een niet-significant frame-naar-frame bleken als sterk genoeg signaal garandeert om individuele liposomen duidelijk te discrimineren op de achtergrond. De optimale instelling hangt af van de specifieke Microscoop die wordt gebruikt en van de de-combinatie. Zorg ervoor dat de detectoren niet verzadigd zijn, want dit zal de kwantificering van de intensiteit vooroordelen.
  3. Beeldvorming van zowel de DOPE-Atto488 als de DOPE-Atto655 fluoroforen in de liposomen vereist Imaging meerdere kanalen. Zorg er dus voor dat elk kanaal opeenvolgend wordt afgebeeld om Kruis excitatie te voorkomen. Neem bijvoorbeeld eerst een afbeelding met spannende 488 nm en lees emissie bij 495 − 560 Nm. Daarna, neem een ander beeld door spannende op 633 nm maar lezing emissie alleen bij 660 − 710 nm. De bijzonderheden zijn afhankelijk van het Microscoop systeem (bijv. welke lasers en filters) beschikbaar zijn.
  4. Zorg ervoor dat u verschillende gebieden van het oppervlak bestrijkt, waarbij u ten minste 10 afbeeldingen van het monster verkrijgt, waardoor ten minste 3.000 individuele liposomen worden weergegeven. Als de oppervlaktedichtheid lager is dan 300 liposomen/frame, verkrijgt u meer afbeeldingen. Zorg ervoor dat u de Microscoop opnieuw richt voor elke nieuwe afbeelding.
    Let op: voor twee-kanaals beeldvorming, zorg ervoor dat de naam van de afbeeldingsbestanden, zodat paren van beelden met dezelfde liposomen in verschillende fluorescentie kanalen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd tijdens de data-analyse.
  5. Om de experimentele onzekerheid met betrekking tot de meting van de compositionele inhomogeniteit te kwantificeren, moet voor en na het opnieuw scherpstellen hetzelfde gebied van liposomen worden weer (Zie Figuur 3 en beschrijving in de tekst).
  6. Exporteer de afbeeldingen van de Microscoop-software als. TIFF-bestanden. Exporteer de twee kanalen van dezelfde liposomen afzonderlijk.

5. gegevensanalyse

Opmerking: speciaal ontwikkelde geautomatiseerde 2D Gaussiaanse aanpassings routines zijn eerder gebruikt6,11,12. Echter, om de toepasbaarheid van de methode te verhogen een Data-analyseproces dat gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in alle laboratoria wordt beschreven.

  1. Laad de corresponderende paar. TIFF-afbeeldingen van twee verschillende fluorescentie kanalen in hetzelfde beeldveld in de FIJI-software (FIJI is just ImageJ).
  2. Kies kleurin het menu afbeelding en gebruik de functie kanaal samenvoegen om een samengestelde van de twee kanalen te maken.
  3. Kijk of de liposomen die in twee verschillende kanalen zijn afgebeeld, een goede colokalisatie vertonen of dat er zichtbare drift is opgetreden.
    Opmerking: in het geval van drift tussen de twee fluorescentie kanalen (herkend als een systematische en gelijke X-Y offset tussen het signaal in de twee kanalen), kan een van de frames worden vertaald met behulp van de Transform ≫ vertalen functie in het beeld menu van Fiji. Echter, zorg moet worden genomen met dergelijke beeldmanipulatie. Het wordt daarom aanbevolen om in plaats daarvan zoveel mogelijk drift te vermijden bij het beeldvorming van de liposomen.
  4. Zorg ervoor dat de plug-in ComDet (v. 0.3.6.1 of nieuwer) is geïnstalleerd, of doe dit in het menu plugins .
  5. Open de plug-in ComDet om deeltjes te detecteren door naar het menu plugins te gaan en comdet v. 0.3.6.1 te kiezen ≫ deeltjes te detecteren.
  6. In ComDet, zorg ervoor dat u de detect deeltjes op beide kanalen individueel functie te kiezen. Stel de maximale afstand in tussen co-gelokaliseerde plekken die vergelijkbaar zijn met de geschatte deeltjesgrootte. Meestal is 4 pixels geschikt voor de hier beschreven instellingen.
  7. De signaal-ruis verhouding moet de detectie van gelijkmatige Dim deeltjes mogelijk maken met een geringe hoeveelheid fluorescentie. Stel in ComDet deze verhouding in op 3 door de gevoeligheid van de detectie in beide kanalen in te stellen op zeer Dim-deeltjes (SNR = 3).
    Opmerking: Hoewel deze SNR-waarde meestal geschikt is, kan het nodig zijn om deze hoger in te stellen (bijvoorbeeld als er veel beeldruis is die kan worden geïdentificeerd als liposomen en leidt tot valse positieven).
  8. Zorg ervoor dat de dozen met Bereken Colokalisatie en plot gedetecteerde deeltjes in beide kanalen worden gecontroleerd, voordat u op OKdrukt.
  9. Na het uitvoeren van de analyse, twee pop-up vensters met resultaten en Samenvatting zal tonen. Exporteer de resultaten van de gegevenstabel met de colokalisatie gegevens (deeltjes coördinaten en geïntegreerde intensiteit van elk gedetecteerd deeltje) naar een gegevensverwerkings software naar keuze door de tabel op te slaan als een. txt-bestand en deze in de software te importeren.
  10. Zorg ervoor dat elke liposoom slechts één keer in de gegevensset is opgenomen en niet zowel de Channel1/Channel2 als de Channel2/Channel1 ratio. Filter de gegevens dus alleen Abs_frame = 1 is uitgezet in stap 5,11.
    Opmerking: door te kiezen voor Cogelokaliseerde = 1, false positieven van ruis in de afbeeldingen kunnen worden verwijderd uit de analyse. Echter, eventuele liposomen met slechts één van de twee fluorescerende componenten die aanwezig zijn, zullen ook worden uitgesloten van de analyse, waardoor mogelijk belangrijke gegevenspunten uit de analyse worden verwijderd.
  11. Plot een histogram van de kolom met gegevens die de intensiteits ratio voor elke gedetecteerde liposoom bevatten.
  12. De mate van compositorische inhomogeniteit voor het onderzochte Liposomale systeem wordt weergegeven door de breedte van de verdeling van de intensiteits verhoudingen. Om de inhomogeniteit te kwantificeren, past u het histogram van de intensiteit ratio aan met een Gaussiaanse functie en extraheert u het gemiddelde (μ) en de standaarddeviatie (Sigma). Zie de sectie representatieve resultaten.
  13. Een waarde voor de mate van inhomogeniteit (DI) kan nu worden berekend met behulp van de variatiecoëfficiënt die is gedefinieerd als DI = Sigma/μ.

6. Liposome grootte kalibratie

  1. Neem een deel van de liposoom kolf en extruderen 21x door een 50 nm polycarbonaat filter zoals beschreven in stap 1,10.
  2. Verdun de liposomen door 10 μL van de liposoom suspensie toe te voegen aan 800 μL sorbitol buffer in een micro centrifugebuis.
  3. Breng het verdunde liposoom monster over in een polypropyleen Cuvette voor eenmalig gebruik.
  4. Meet de grootte met Dynamische lichtverstrooiing (DLS). Voer ten minste drie onafhankelijke runs uit om de grootte en polydispersiteit van de liposoom suspensie te meten.
    Opmerking: gebruik indien nodig een meer geconcentreerde liposoom suspensie voor de meting. Er kunnen ook alternatieven voor DLS (bijv. de tracking analyse van nanodeeltjes) worden toegepast om de grootte van de liposomen te meten. Een beschrijving van het uitvoeren van dergelijke bepaling van de deeltjesgrootte valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol.
  5. Beeld de kalibratie liposomen op de microscoop met exact dezelfde experimentele instellingen als gedefinieerd in de stappen 4,1 en 4,2.
  6. Extraheer de geïntegreerde intensiteit voor elke kalibratie-liposoom in de kalibratie beelden: Extraheer de gefilterde resultaten fiche met liposomen fluorescentie intensiteiten zoals beschreven in stappen 5.1 − 5.10. Uit de resultatentabel, pak de ' IntegratedInt ' kolom.
  7. Omdat de totale geïntegreerde intensiteit van een liposoom met het label in zijn membraan evenredig is aan het oppervlak van het liposoom en dus evenredig is met het kwadraat van de diameter, plot een kwadraat van de wortel intensiteit histogram van de intensiteit van de fluorescentie van de kalibratie liposomen.
  8. Monteer het in stap 6,7 geproduceerde geïntegreerde intensiteits histogram met een normale stam verdeling en extraheer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de kalibratie liposomen.
  9. Om de relatie tussen de vierkantswortel intensiteit (intSQRT) en de grootte van het liposoom te bepalen, berekent u de correctiefactor (C) met behulp van de gemiddelde liposoom diameter (dia) gewogen door het aantal dat is verkregen uit de DLS-metingen: dia = c x intSQRT is equivalent aan C = dia/intSQRT.
  10. Bereken de intSQRT -waarden voor de liposomen in het samenstellings-inhomogeniteits experiment en zet deze om in diameters door deze te vermenigvuldigen met de correctiefactor.
  11. Plot de waarde van de intensiteits ratio als een functie van diameter voor de compositionele inhomogeniteitsliposomen, waardoor de inhomogeniteit wordt bereikt als een functie van liposoom grootte voor een populatie liposomen van ongeveer 50 nm − 800 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het beschreven protocol is het mogelijk om enkele liposomen op een enorme parallelle manier te afbeelen (Figuur 1). De succesvolle oppervlakte-immobilisatie van liposomen moet onmiddellijk zichtbaar zijn na de toevoeging van de liposoom oplossing aan de kamer (stap 3,6 in het Protocol), aangezien diffractie-punten met beperkte intensiteit in de afbeelding moeten worden weergegeven (Figuur 1B en

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is belangrijk op te merken dat hoewel we in detail beschrijven hoe de enkelvoudige liposomen test kan worden gebruikt om de compositorische inhomogeniteit tussen individuele liposomen te bestuderen, het platform zeer veelzijdig is. Zoals eerder getoond en besproken in de inleiding, het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van aspecten van membraan-membraan fusie, eiwit-membraan interacties, of Liposomale drug Carrier karakterisering. Voor alle wetenschappelijke vragen die worden behandeld, lig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek [subsidie nummer 5054-00165B].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
8-well microscopy slides (µ slides)Ibidi80827Microscoopglaasjes met glazen bodem
Avanti Mini Extrusion kitAvanti Polar Lipids610000Verbruiksartikelen (Whatman filters) kunnen worden verkregen bij GE Healthcare
BSASigmaA9418
BSA-BiotinSigmaA8549
CholesterolAvanti Polar Lipids700000Handelt via Sigma
Computer met FIJI (Fiji Is Just ImageJ)ComDet plugin moet worden geïnstalleerd. Ook zal een dataverwerkingssoftware (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) die.txt-bestanden kan laden nodig zijn om de gegevens uit te plotten
DOPE-Atto488Atto-TechAD488-165
DOPE-Atto655Atto-TechAD655-165
DOPE-PEG-BiotinAvanti Polar Lipids880129Handelt via Sigma
D-SorbitolSigmaS-6021
Freeze-dryerbv. ScanVac Coolsafe van Labogene
GlasmateriaalBrown Chromatography150903Glasmateriaal dat bestand is tegen snap-freezing in vloeibaar stikstof. De 8 mL-versie van de materialen past ook bij de spuiten van het extrusiekit
HClHoneywell Fluka258148
VerwarmingsbadIn staat om minimaal 65 °C te verwarmen
Verwarmingsplaat met Magneet roerenIn staat om minimaal 65 °C te verwarmen
HEPESSigmaH3375
Vloeibare stikstofIncl. container voor opslag, bv. Rubber-bad
Magneet roerstavenVWR442-4520 (EU)
Microcentrifugebuizen 1,5 mLEppendorf0030 120.086 (EU)
MicroscoopVoor de afbeeldingen in dit protocol is een Leica SP5 confocale microscoop gebruikt
Na HEPESSigmaH7006
NaClSigmaS9888
NaOHHoneywell Fluka71686
POPCAvanti Polar Lipids850457Handelt via Sigma
StreptavidineSigmaS4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)Honeywell Riedel-de Haën24127
Ultrapuur waterbv. MilliQ

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  2. Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
  3. Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13(2015).
  4. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  5. Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
  6. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  7. Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372(2008).
  8. Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
  9. Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
  10. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  11. Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192(2015).
  12. Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
  13. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
  14. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
  15. Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
  16. Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
  17. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
  18. Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
  19. Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
  20. Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
  21. Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807(2019).
  22. Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
  23. Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
  24. Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
  25. Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
  26. Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Liposoomcompositiegrootte inhomogeniteitvries dooi cyclilipide extrusiestreptavidine biotinebindingcolocalisatieanalyseintensiteitsverhouding histogramdynamische lichtverstrooiing

Gerelateerde artikelen