Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen

Samenvatting

Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Samenvatting

Neutrofielen zijn een belangrijk lid van het aangeboren immuunsysteem en spelen een centrale rol in de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers en pathologische ontstekingsreacties. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines. Overweldigende infiltratie van neutrofielen kan leiden tot willekeurige weefselschade, zoals bij reumatoïde artritis (RA). Neutrofielen geïsoleerd van peritoneale exudate reageren op een gedefinieerde chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell of Zigmond kamer testen. Het luchtzakje experiment kan worden gebruikt om de chemotaxis van neutrofielen in de richting van lipopolysaccharide (LPS) in vivo te evalueren. Het adjuvante-geïnduceerde artritis (AA) muismodel wordt vaak gebruikt in RA-onderzoek, en immunohistochemische kleuring van gewrichtssecties met anti-myeloperoxidase (MPO) of anti-neutrofiele elastase (NE) antilichamen is een gevestigde methode om te meten neutrofiele infiltratie. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Inleiding

Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcellen en zijn goed voor 50−70% van de hele witte bloedcellen populatie bij de mens¹. Neutrofielen zijn een van de primaire responders tijdens acute ontsteking. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines vrijgegeven door weefsel-resident cellen^2,3,4, die wordt bemiddeld door de interacties tussen celhechting moleculen op het oppervlak van neutrofielen en vasculaire endothehelium cellen⁵. Neutrofielen zijn van fundament....

Protocol

Alle experimentele procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.

LET OP: C57BL/6 muizen (7-8 weken oud) werden gebruikt.

1. Neutrofiele isolatie

1. Verwerving van peritoneale ex-ex-datecellen
   1. Bereid verse 10% proteose peptone oplossing in ddH₂O. Bereken het volume dat nodig is op basis van het aantal muizen.
      OPMERKING: Stel het aantal muizen in als N, (2N+1) mL oplossing moet vooraf worden opgelost en gefilterd.
   2. Spuit de werkruimte met 70% ethanol. Gebruik een insulineinjector om 1 mL peptoneoplossi....

Resultaten

Peritoneale ex-exudate cellen werden verzameld uit lavage vloeistof van muizen. Cellen werden opnieuw onderbroken in 1 mL RPMI-1640 volledig medium, gelaagd op een twee-staps (54,8%/70,2%) discontinu dichtheidsgradiënt(figuur 1A) en gecentrifugeerd bij 1.500 x g gedurende 30 min. Neutrofielen (≥95%, ~1 x 10⁷ neutrofielen/muis) werden teruggewonnen uit de onderste interface (figuur 1B

Discussie

Gedetailleerde protocollen van sterk gezuiverde neutrofielen uit perifeer bloed^7,beenmerg en weefsels¹⁸ zijn beschikbaar voor een lange tijd. Hier nemen we een methode aan om neutrofielen te isoleren van peritoneale vloeistof¹⁹ waarin volwassen neutrofielen geïnactiveerd blijven voor verdere ontstekingsremmende en antioxidantstudies.

We gebruikten het luchtzakje experiment om de LPS-geïnduceerde infiltratie van neutrofiele.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.1% Fast Green Solution	Solarbio	8348b	Transfer 20 mg van fast grene FCF in één flesje naar een andere 100 mL beker. Voeg 20 mL van H2O toe aan de beker en los de vlek op door te roeren om een 0.1% fast green-oplossing te maken en filter deze met een Nalgene PES 75 mm-filter
0.1% Safranin O Staining Solution	Solarbio	8348a	Transfer 20 mg van safranine O-kleurvlek in één flesje in een 100 ml beker. Voeg 20 mL van H2O toe aan de beker en los de vlek op door te roeren om een 0.1% safranine O-kleurvloeistof te maken en filter deze met een Nalgene PES 75 mm-filter
0.5 M Ethyleendiaminetetraazijnzuur-oplossing (EDTA), pH 8.0	Sigma	324506	Steriele
100% Ethanol	Beijing Chemical Works
100% Methanol	Beijing Chemical Works
15 mL Conische Polypropyleen Centrifugebuis	Falcon	14-959-53A
23 G x 1 1/4" Naald	BD	305120
26 G x 3/8" Naald	BD	305110
3% bovien serum albumine (BSA)			Los 0.3 g BSA op in 10 mL PBS
3% H2O2			Meng 1 mL 30% H2O2 met methanol met 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018
30 G x 1/2" Naald	BD	305106
30% H2O2	Beijing Chemical Works
5 mL Spuit	BD	Z683574
50 mL Conische Polypropyleen Centrifugebuis	Falcon	14-432-22
50% Ethanol			Meng 500 mL 100% ethanol met 500 mL dH2O
54.8% Percoll			Meng 2.74 mL SIP met 2.26 mL 1×PBS, stil staan
70% Ethanol			Meng 700 mL 100% ethanol met 300 mL dH2O
70.2% Percoll			Meng 3.51 mL SIP met 1.49 mL 1×PBS, stil staan
80% Ethanol			Meng 800 mL 100% ethanol met 200 mL dH2O
95% Ethanol			Meng 950 mL 100% ethanol met 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast Differentiatieoplossing	Beyotime	C0165S
ANTILICHAMEN
Anti-Myeloperoxidase Antilichaam	Abcam	ab208670
Anti-Neutrofiel Elastase Antilichaam	Abcam	ab21595
Automatische Hematologie Analyzer	Sysmex	XS-800i
Bovine Serum Albumine (BSA)	VWR	0332-100G
Complete Freund's Adjuvans, 10 mg/ml	sigma	1002036152
Dekglas	CITOGLAS	10212432C
Meetlintdiktemeter	Mitutoyo	7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mL	Sigma	Z606340
Foetaal Runderserum (FBS) Premium	PAN	P30-1302
Gasanesthesiesysteem	ZS Dichuang	ZS-MV-IV
Geit Anti-Konijn IgG H&L (HRP)	PPLYGEN	C1309	Dit is het secundaire antilichaam dat wordt gebruikt bij immunohistochemische kleuring.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Steriele
Hematoxyline Kleuringsoplossing	ZSGB-BIO	ZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L3012
MEDIA EN SUPPLEMENTEN
Gemodificeerd Safranin O-fast Green FCF Kraakbeenkleuringskit	Solarbio	G1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	47729
Penicilline Streptomycine-oplossing, 100×	Invitrogen	1514022
Percoll	GE Healthcare	10245207	Dichtheidsgradiëntmedium
Permeabilisatiebuffer			Meng 100 μL Triton X-100 met 1 L dH2O om 0.01% Triton X-100 te krijgen
Fosfaat Buffer Saline (PBS), 1×			Meng 90% ddH2O met 10% (v/v) 10×PBS, geautoclaveerd
Fosfaat Buffer Saline (PBS), 10×			Los 16 g NaCl op, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (watervrij) in 200 mL ddH2O, pH 7.4 aanpassen, geautoclaveerd
PLASTIEK EN APPARATUUR
POEDER
Proteose Pepton	Oxoid	1865317
Retrieval Buffer			Meng 18 mL retrieval buffer A met 82 mL retrieval buffer B, voeg dH2O toe aan 1000 mL, pH aanpassen naar 6.0
Retrieval Buffer A Stock voor IHC			Los 4.2 g citroenzuur op (C