Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen

12.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60543

⸱

6 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Samenvatting

Neutrofielen zijn een belangrijk lid van het aangeboren immuunsysteem en spelen een centrale rol in de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers en pathologische ontstekingsreacties. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines. Overweldigende infiltratie van neutrofielen kan leiden tot willekeurige weefselschade, zoals bij reumatoïde artritis (RA). Neutrofielen geïsoleerd van peritoneale exudate reageren op een gedefinieerde chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell of Zigmond kamer testen. Het luchtzakje experiment kan worden gebruikt om de chemotaxis van neutrofielen in de richting van lipopolysaccharide (LPS) in vivo te evalueren. Het adjuvante-geïnduceerde artritis (AA) muismodel wordt vaak gebruikt in RA-onderzoek, en immunohistochemische kleuring van gewrichtssecties met anti-myeloperoxidase (MPO) of anti-neutrofiele elastase (NE) antilichamen is een gevestigde methode om te meten neutrofiele infiltratie. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Inleiding

Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcellen en zijn goed voor 50−70% van de hele witte bloedcellen populatie bij de mens1. Neutrofielen zijn een van de primaire responders tijdens acute ontsteking. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines vrijgegeven door weefsel-resident cellen2,3,4, die wordt bemiddeld door de interacties tussen celhechting moleculen op het oppervlak van neutrofielen en vasculaire endothehelium cellen5. Neutrofielen zijn van fundamenteel belang voor de verdediging en spelen een rol in pathologische ontstekingsreacties vanwege hun krachtige vermogen om weefsel te beschadigen door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere weefselbeschadigende moleculen3,6.

Eerdere studies hebben verschillende neutrofiele isolatieprotocollen van muizen of mensen beschreven. Oh et al. demonstreerde een dichtheidgradiëntscheidingsmethode om menselijke neutrofielen te isoleren van heel menselijk bloed7. Echter, de isolatie van voldoende neutrofielen van muisbloed is moeilijk vanwege het kleine bloedvolume. Als alternatief kunnen grote aantallen zuivere en levensvatbare muisneutrofielen worden ontlokt uit muisperitoneale vloeistof, en deze gezuiverde neutrofielen kunnen ex vivo worden gebruikt om verschillende aspecten van cellulaire functies ex vivo te onderzoeken, waaronder neutrofiele infiltratie, migratie, chemotaxis, oxidatieve uitbarsting, cytokine en neutrofiele extracellulaire val (NET) productie8. Transwell assays9 of Zigmond kamer assays10,11 kan worden gebruikt om neutrofiele migratie in vitro te evalueren. Het luchtzakjemodel wordt gebruikt om de migratie en infiltratie van neutrofielen in vivo te evalueren. Het onderhuidse luchtzakjemodel is een handig in vivo diermodel om de migratie van ontstekingscellen te bestuderen.

Traditioneel werden neutrofielen beschouwd als pathogene eliminators in acute ontstekingsfasen. Recente bevindingen hebben echter aangetoond dat neutrofielen gecompliceerde cellen zijn die een aanzienlijke verscheidenheid aan gespecialiseerde functies uitvoeren. Neutrofielen kunnen veel processen reguleren, zoals acuut letsel en reparatie, tumorigenese, auto-immuunrespons en chronische ontsteking12,13. Neutrofielen moduleren ook adaptieve immuunreacties en kunnen B-cellen en T-cellenreguleren 14,15. Een groot tekort aan neutrofielen leidt tot sterfte of ernstige immunodeficiëntie bij mensen en neutrofiele uitputting bij muizen leidt tot dodelijk ongeval, terwijl overmatige activering of rekrutering van neutrofielen in organen verschillende immuunziekten veroorzaakt, zoals reumatoïde artritis (RA) en systemische lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofielen zijn de meest voorkomende cellen in de synoviale vloeistof van RA-patiënten. Neutrofielen produceren overmatige hoeveelheden myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastasase (NE) via afbraak, wat kraakbeenerosie verergert. MPO is een peroxidase enzym voornamelijk uitgedrukt in de korrels van neutrofielen16. NE wordt geassocieerd met gewrichtskraakbeen vernietiging17. MPO en NE kunnen worden gebruikt om de status van neutrofiele migratie en infiltratie in het weefsel van RA-patiënten te evalueren.

Dit artikel biedt drie conventionele methoden om de migratie van normale neutrofielen geïnduceerd, zowel in vivo als in vitro, te evalueren, evenals de infiltratie van pathologische neutrofielen in een muisgewrichtspecifiek ontstekingsmodel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.

LET OP: C57BL/6 muizen (7-8 weken oud) werden gebruikt.

1. Neutrofiele isolatie

  1. Verwerving van peritoneale ex-ex-datecellen
    1. Bereid verse 10% proteose peptone oplossing in ddH2O. Bereken het volume dat nodig is op basis van het aantal muizen.
      OPMERKING: Stel het aantal muizen in als N, (2N+1) mL oplossing moet vooraf worden opgelost en gefilterd.
    2. Spuit de werkruimte met 70% ethanol. Gebruik een insulineinjector om 1 mL peptoneoplossing te tekenen en bellen te ontladen.
    3. Voer de eerste intraperitoneale injectie van 1 mL peptone oplossing per muis.
      1. Pak de muis in een head-down positie met een hand. Desinfecteer de injectieplek met met alcohol doordrenkte katoenen balletjes.
        OPMERKING: De gewenste injectiepositie ligt in het laterale aspect van het kwadrant linksonder of rechts van de buik.
      2. Bezielen de reagentia snel. Injecteer 1 mL in de peritoneale holte van elke muis met de insulineinjector.
        OPMERKING: De hoek tussen de naald en de huid moet ongeveer 15−30° zijn om te voorkomen dat de darm of andere organen gewond raakten.
    4. Laat ontstekingsreactie 's nachts ontwikkelen. Voer na 12 uur de tweede injectie op dezelfde manier uit als de eerste injectie.
    5. Drie uur na de tweede injectie, volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 5 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min. Verwijder de verdoofde muizen uit de kamer en offer ze op door cervicale dislocatie.
      OPMERKING: Voldoende diepte van anesthesie wordt gewaarborgd door de tenen te knijpen voordat muizen van de kamer naar de enkele ademhalingseenheid worden verplaatst. De benen mogen niet bewegen wanneer de tenen worden geknepen.
      OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden verwerkt in een weefselkweekkap.
    6. Spray de muis met 70% ethanol. Leg de muis op een steriele plastic pad en bevestig de ledematen met naalden.
    7. Gebruik een steriele set chirurgische hulpmiddelen om een horizontale incisie (~ 1 cm) te maken in het midden van de onderbuik. Til de huid van de bovenbuik met tangen en snijd langs de middellijn van de buik en bloot de intacte buikwand.
    8. Injecteer 5 mL steriel RPMI-1640 compleet medium in de buikholte met een naald van 30 G x 1/2". Plaats de naald door de buikvlieswand met de afgeschuinde rand van de naald naar boven en injecteer het hele volume.
    9. Schud het pad horizontaal gedurende 5 min. Masseer de buik zachtjes meerdere malen.
    10. Injecteer een naald van 23 G x 1 1/4" in de zijdelingse ruimte van de buik. Haal de buikvloeistof (~ 5 mL) eruit en verzamel deze in een centrifugebuis van 50 mL.
      LET OP: Plaats de buizen zo snel mogelijk op ijs in geval van neutrofiele activering.
    11. Injecteer nog eens 5 mL volledig medium en herhaal de procedure om de resterende cellen uit het peritoneum te verwijderen. Vul de peritoneale vloeistof in de centrifugebuis van 50 mL.
    12. Centrifugeer de gepoolde peritoneale vloeistof met 400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT).
    13. Gooi de supernatant weg. Resuspend de cellen in 1 mL rpmi-1640 complete medium.
      LET OP: Niet vortex om neutrofiele activering te voorkomen.
  2. Isolatie van neutrofielen
    1. Voeg 4 mL vers bereid 70,2% hellingsmedium met dichtheid (bijvoorbeeld Percoll) toe in een centrifugebuis van 15 mL.
    2. Voorzichtig overlay 4 mL vers bereid 54,8% dichtheid gradiënt medium op de 70,2% dichtheid gradiënt medium langzaam langs de rand van de buis met scherpe pipet tips in de 15 mL centrifuge buis.
      OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de interface tussen het 54,8% dichtheidsverloopmedium en 70,2% het verloopmedium van de dichtheid wordt verstoord.
    3. Bedek de 1 mL peritoneale celvering langzaam over de gemiddelde laag met een dichtheid van 54,8% met scherpe pipettips(figuur 1A).
      OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de interface tussen de celvering en 54,8% de dichtheid gradiënt medium verstoren.
    4. Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 30 min bij 22 °C zonder te remmen.
    5. Verzamel de neutrofielen op de interface van het 54,8% dichtheidsgradiënt en 70,2% hellingsgraadgemiddelde lagen(figuur 1B)op een nieuwe buis.
    6. Voeg 1 mL RPMI-1640 complete medium toe aan de verzamelde cellen en verwijder cellen voorzichtig door meerdere keren zachtjes te besuiaaiden. Centrifugeer bij 100 x g voor 10 min bij RT en verwijder voorzichtig de supernatant.
    7. Herhaal de wasstap (stap 1.2.6) eenmaal.
    8. Voeg 0,5 mL kweekmedium toe aan de pellet en bretel cellen opnieuw door meerdere keren zachtjes te besuisen. Neem een aliquot van 50 μL om de cellen te tellen met behulp van een automatische hematologieanalyzer.

2. Neutrofiele migratietest

  1. Meet de neutrofiele migratie door Transwell test9 of Zigmond kamertest zoals eerder beschreven10,11.

3. Luchtzakjetest

  1. Eerste luchtinjectie
    1. Op dag 0, volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 3 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min, en onderhouden van de anesthesie van elke muis in een enkele ademhaling eenheid met 2% isoflurane met een snelheid van 0,5 L /min.
      OPMERKING: Voldoende diepte van anesthesie wordt gewaarborgd door de tenen te knijpen voordat muizen van de kamer naar de enkele ademhalingseenheid worden verplaatst. De benen mogen niet bewegen wanneer de tenen worden geknepen.
    2. Gebruik een 0,22 μm-filter dat aan een spuit van 5 mL is bevestigd om een volume van 3 mL gesteriliseerde lucht te verkrijgen.
    3. Til de rughuid van de verdoofde muis op met een pincet en injecteer onderhuids 3 mL gesteriliseerde lucht met behulp van een 26 G x 3/8"-naald.
    4. Verwijder na de behandeling de muizen uit de ademhalingsunit. Controleer de muizen om ervoor te zorgen dat ze leven totdat ze beginnen te bewegen.
  2. Tweede luchtinjectie
    1. Injecteer op dag 3 nog eens 3 mL gesteriliseerde lucht in de eerder gevestigde luchtzak om het luchtzakje in stand te houden, zoals beschreven in punt 3.1.
  3. Behandeling
    1. Op dag 6, 6 uur voor het offer, injecteren verschillende behandelingen in de lucht zak. Injecteer 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) als negatieve controle. Injecteer 1 mL van 1 μg/mL LPS als de positieve controle om lokale ontstekingen te veroorzaken.
    2. Volledig verdoven muizen met 5% isoflurane voor 3 min in een gas anesthesie kamer met een snelheid van 2 L /min, en onderhouden van de anesthesie van elke muis in een enkele ademhaling eenheid met 2% isoflurane met een snelheid van 0,5 L /min. Bereid wassen buffer volgens Table of Materials.
      OPMERKING: Voldoende diepte van anesthesie wordt gewaarborgd door de tenen te knijpen voordat muizen van de kamer naar de enkele ademhalingseenheid worden verplaatst. De benen mogen niet bewegen wanneer de tenen worden geknepen.
    3. Voor elk luchtzakje was je het luchtzakje met 1 mL wasbuffer en verzamel je de ontstekingsexudate in een centrifugebuis van 15 mL. Was het luchtzakje met 2 mL wasbuffer 2x en verzamel de ontstekingsexudate in dezelfde centrifugebuis.
    4. Centrifugeer bij 100 x g voor 10 min bij RT. Gooi de supernatant weg en breg cellen opnieuw op in 1 mL wasbuffer. Tel de cellen om de neutrofiele verhouding te kwantificeren met behulp van de automatische hematologieanalyzer.
      OPMERKING: Zie representatieve resultaten in figuur 2.

4. Inductie van het adjuvant-geïnduceerde artritis (AA) muismodel

  1. Hang de hulpvervant (CFA) van Complete Freund op door ten minste 5 s vortexing en trek vervolgens 100 μL suspensie in een insulineinjector.
    OPMERKING: We raden aan om volledig nieuwe CFA te gebruiken in experimenten om steriliteit te garanderen.
  2. Verdovende muizen zoals beschreven in stap 3.1.1.
  3. Markeer de gekozen poot en injecteer 20 μL CFA in de enkelgewrichtsruimte. Injecteer 20 μL suspensie in vier periarticulaire vlekken op de gekozen poot (in totaal 80 μL).
  4. Verwijder muizen uit de ademhalingsunit en zet de verwerkte muizen in een nieuwe kamer. Monitor muizen om ervoor te zorgen dat ze ademen totdat ze weer in staat om te bewegen.
  5. Beoordeel elke 3 dagen de gewrichtsdiameter door de diameter van het enkelgewricht te meten met behulp van een zakdiktemeter(figuur 3A).
  6. Elke 3 dagen, beoordelen artritis ernst door artritis scoren criterium (Figuur 3C):0, normaal, geen bewijs van erythema en zwelling; 1, de mildste artritis, erythema en milde zwelling beperkt tot de tarsals of enkelgewricht; 2, matige artritis, erythema en milde zwelling die zich uitstrekt van de enkel tot de tarsals; 3, ernstige artritis, erythema en matige zwelling die zich uitstrekt van de enkel tot middenvoetsbeentje gewrichten; 4, de meest ernstige artritis, erythema en ernstige zwelling omvatten de enkel, voet en cijfers, of ankylosis van de ledemaat.

5. Immunohistochemische kleuring van gewrichtsdelen

  1. Gezamenlijke isolatie
    1. Offer de muis op in sectie 4 met behulp van cervicale dislocatie na anesthesie met isoflurane. Spray de muis met 70% ethanol.
    2. Verwijder de huid en een deel van de spier uit het achterbeen met een pincet en schaar. Spray het gewricht met 70% ethanol en verwijder de rest van de spieren met behulp van een papieren handdoek.
    3. Bevestig het enkelgewricht in 4% paraformaldehyde gedurende 2 dagen bij RT. Ontcalcificer het gewricht in 10% EDTA gedurende 1 maand bij RT en verander het medium wekelijks.
    4. Veranker het weefsel in paraffine en bereid weefselsecties van 4 μm dik voor.
      1. Plaats weefsel in een gemarkeerde mal met een bepaald volume van vloeibare paraffine. Ga even koel.
      2. Stel de dikte in op 4 μm en snijd plakjes op een microtoom. Drijf secties in een waterbad van 43 °C.
      3. Monteer de secties op glijbanen en zet de glijbanen 2 uur lang op 70 °C in de oven. Voor toekomstig gebruik, behoud de glijbanen op -20 °C.
  2. Safranin O en snelle groene kleuring van gewrichtssecties
    OPMERKING: De volgende kleuringsstappen worden uitgevoerd op RT.
    1. Plaats de glijbanen van stap 5.1.4.3 in een rek en voer de volgende wasbeurten uit om te hydrateren bij RT: xyleen voor 5 min (3x), 100% ethanol voor 2 min (2x), 95% ethanol voor 2 min (2x), 70% ethanol voor 2 min en 50% ethanol gedurende 15 min. Was in stromend leidingwater gedurende 3 min.
    2. Vlek in 0,1% snelgroene oplossing voor 5 min. Spoel in 1% azijnzuur voor 10 s.
    3. Vlek in 0,1% safranin O kleuroplossing voor 20 min. Dompel de dia's onder in de volgende wasbeurten: 95% ethanol voor 2 min (2x), 100% ethanol voor 2 min (2x) en xyleen gedurende 2 min (2x).
    4. Monteer de weefselsecties en observeer de weefsels onder een microscoop.
      OPMERKING: Zie representatieve afbeeldingen in figuur 4A.
  3. Immunohistochemische kleuring om neutrofielen te visualiseren
    1. Bak de paraffinesecties 2 uur bij 78 °C. Plaats de dia's in een rek en voer de volgende wasbeurten uit om te hydrateren bij RT: xyleen gedurende 15 min (2x), 100% ethanol voor 5 min (2x), 95% ethanol voor 5 min, 80% ethanol voor 5 min, H2O voor 3 min en PBS voor 3 min.
      OPMERKING: Laat dia's tijdens deze stap niet drogen.
    2. Voeg een druppel permeabilisatie buffer om het weefsel te dekken. Incubeer secties in een vochtigheidsgecontroleerde lade bij 37 °C.
    3. Spoel dia's in PBS gedurende 3 min (3x). Vermijd spoelen het weefsel direct.
    4. Voer warmte-geïnduceerde antigeen epitoop ophalen met behulp van een drukketel.
      1. Plaats dia's in een rek. Dompel glijbanen onder in de drukketel gevuld met ophaalbuffer.
      2. Zet de drukketel op een magnetron. Zet de magnetron op 600 W en verwarm de glijbanen voor 10 min.
      3. Houd na het koken de glijbanen in de ketel om af te koelen tot 90 °C. Haal de glijbanen eruit en spoel ze in PBS voor 3 min (3x).
    5. Doof endogene peroxidaseactiviteit in vers bereide 3% H2O2 bij RT gedurende 15 min. Spoel dia's in PBS gedurende 3 min (3x).
    6. Schets een grote cirkel rond het monster met een hydrofobe pen, vermijd het aanraken van het monster. Blok met 3% runderserumalbumine (BSA) in een vochtgecontroleerde kamer bij 37 °C gedurende 60 min.
    7. Verwijder de blokkeringsoplossing. Voeg snel 50 μL PBS-verdunde primaire antilichaam toe aan elke sectie. Bebroed vervolgens de glijbanen in een vochtigheidsgestuurde lade bij 4 °C 's nachts.
      OPMERKING: Voor verschillende antilichamen (1:25 voor MPO en 1:20 voor NE) worden verschillende verdunningsverhoudingen gebruikt.
    8. Op de tweede dag, neem de lade en laat het staan op RT voor 30 min. Spoel vervolgens de glijbanen in PBS gedurende 3 min (3x).
    9. Voeg 50 μL PBS-verdunde secundaire antilichamen toe aan het weefsel.
      OPMERKING: Er werden verschillende verdunningsverhoudingen toegepast: 1:1.000 voor MPO en 1:1.500 voor NE.
    10. Incubeer gedurende 30 min glijbanen in een vochtigheidsgecontroleerde lade bij 37 °C. Spoel vervolgens de glijbanen in PBS gedurende 3 min (3x).
    11. Ontwikkel in verdunde 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing voor 5 min. Houd de reactie in de gaten in het geval van de ontwikkeling van een donkere kleur. Spoel de glijbanen af in gedestilleerd water.
    12. Counterstain de glijbanen in hematoxyline voor 10 s. Spoel de glijbanen in leidingwater gedurende 5 min.
    13. Spoel in zure alcohol supersnelle differentiatie oplossing voor 3 s. Spoel vervolgens 10 min kraanwater in.
    14. Dompel de dia's onder in de volgende wasbeurten bij RT: 80% ethanol voor 5 min, 95% ethanol voor 5 min, 100% ethanol voor 5 min en xyleen voor 15 min (2x). Bevestig de coverslip met montageoplossing. Observeer het weefsel onder een microscoop.
      OPMERKING: Zie representatieve afbeeldingen in figuur 4B.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Peritoneale ex-exudate cellen werden verzameld uit lavage vloeistof van muizen. Cellen werden opnieuw onderbroken in 1 mL RPMI-1640 volledig medium, gelaagd op een twee-staps (54,8%/70,2%) discontinu dichtheidsgradiënt(figuur 1A) en gecentrifugeerd bij 1.500 x g gedurende 30 min. Neutrofielen (≥95%, ~1 x 107 neutrofielen/muis) werden teruggewonnen uit de onderste interface (figuur 1B

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gedetailleerde protocollen van sterk gezuiverde neutrofielen uit perifeer bloed7,beenmerg en weefsels18 zijn beschikbaar voor een lange tijd. Hier nemen we een methode aan om neutrofielen te isoleren van peritoneale vloeistof19 waarin volwassen neutrofielen geïnactiveerd blijven voor verdere ontstekingsremmende en antioxidantstudies.

We gebruikten het luchtzakje experiment om de LPS-geïnduceerde infiltratie van neutrofiele...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81430099 en 31500704), Internationale Samenwerkings- en Uitwisselingsprojecten (subsidienummer 2014DFA32950) en het onderzoeksprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine ( subsidienummers BUCM-2019-JCRC006 en 2019-JYB-TD013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% Fast Green SolutionSolarbio8348bTransfer 20 mg van fast grene FCF in één flesje naar een andere 100 mL beker. Voeg 20 mL van H2O toe aan de beker en los de vlek op door te roeren om een 0.1% fast green-oplossing te maken en filter deze met een Nalgene PES 75 mm-filter
0.1% Safranin O Staining SolutionSolarbio8348aTransfer 20 mg van safranine O-kleurvlek in één flesje in een 100 ml beker. Voeg 20 mL van H2O toe aan de beker en los de vlek op door te roeren om een 0.1% safranine O-kleurvloeistof te maken en filter deze met een Nalgene PES 75 mm-filter
0.5 M Ethyleendiaminetetraazijnzuur-oplossing (EDTA), pH 8.0Sigma324506Steriele
100% EthanolBeijing Chemical Works
100% MethanolBeijing Chemical Works
15 mL Conische Polypropyleen CentrifugebuisFalcon14-959-53A
23 G x 1 1/4" NaaldBD305120
26 G x 3/8" NaaldBD305110
3% bovien serum albumine (BSA)Los 0.3 g BSA op in 10 mL PBS
3% H2O2Meng 1 mL 30% H2O2 met methanol met 9 mL methanol
3,3'-diaminobenzidine (DAB) kitZSGB-BIOZLI-9018
30 G x 1/2" NaaldBD305106
30% H2O2Beijing Chemical Works
5 mL SpuitBDZ683574
50 mL Conische Polypropyleen CentrifugebuisFalcon14-432-22
50% EthanolMeng 500 mL 100% ethanol met 500 mL dH2O
54.8% PercollMeng 2.74 mL SIP met 2.26 mL 1×PBS, stil staan
70% EthanolMeng 700 mL 100% ethanol met 300 mL dH2O
70.2% PercollMeng 3.51 mL SIP met 1.49 mL 1×PBS, stil staan
80% EthanolMeng 800 mL 100% ethanol met 200 mL dH2O
95% EthanolMeng 950 mL 100% ethanol met 50 mL dH2O
Acid Alcohol Superfast DifferentiatieoplossingBeyotimeC0165S
ANTILICHAMEN
Anti-Myeloperoxidase AntilichaamAbcamab208670
Anti-Neutrofiel Elastase AntilichaamAbcamab21595
Automatische Hematologie AnalyzerSysmexXS-800i
Bovine Serum Albumine (BSA)VWR0332-100G
Complete Freund's Adjuvans, 10 mg/mlsigma1002036152
DekglasCITOGLAS10212432C
MeetlintdiktemeterMitutoyo7301
Eppendorf Microtubes, 1.5 mLSigmaZ606340
Foetaal Runderserum (FBS) PremiumPANP30-1302
GasanesthesiesysteemZS DichuangZS-MV-IV
Geit Anti-Konijn IgG H&L (HRP)PPLYGENC1309Dit is het secundaire antilichaam dat wordt gebruikt bij immunohistochemische kleuring.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-016-1ASteriele
Hematoxyline KleuringsoplossingZSGB-BIOZLI-9609
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL3012
MEDIA EN SUPPLEMENTEN
Gemodificeerd Safranin O-fast Green FCF KraakbeenkleuringskitSolarbioG1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)Sigma47729
Penicilline Streptomycine-oplossing, 100×Invitrogen1514022
PercollGE Healthcare10245207Dichtheidsgradiëntmedium
PermeabilisatiebufferMeng 100 μL Triton X-100 met 1 L dH2O om 0.01% Triton X-100 te krijgen
Fosfaat Buffer Saline (PBS), 1×Meng 90% ddH2O met 10% (v/v) 10×PBS, geautoclaveerd
Fosfaat Buffer Saline (PBS), 10×Los 16 g NaCl op, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4·2H2O, 0.48 g KH2PO4 (watervrij) in 200 mL ddH2O, pH 7.4 aanpassen, geautoclaveerd
PLASTIEK EN APPARATUUR
POEDER
Proteose PeptonOxoid1865317
Retrieval BufferMeng 18 mL retrieval buffer A met 82 mL retrieval buffer B, voeg dH2O toe aan 1000 mL, pH aanpassen naar 6.0
Retrieval Buffer A Stock voor IHCLos 4.2 g citroenzuur op (C

Referenties

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745(2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309(2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330(2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579(2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

NeutrofielenmigratieAir Pouch AssayAdjuvant-geïnduceerde ArtritisImmunohistochemische KleuringMyeloperoxidase-kleuringNeutrofiele Elastase-kleuringLPS-chemotaxisfMLP-assayAnalyse van GewrichtsontstekingScoring van Artritisernst
Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.