In vitro cultuur van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan Amniotische membraan

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van epitheelcellen uit verschillende anatomische gebieden van het humaan amniotische membraan om hun heterogeniteit en functionele eigenschappen te bepalen voor mogelijke toepassing in klinische en physiopathologische modellen.

Samenvatting

Verschillende protocollen zijn gerapporteerd in de literatuur voor de isolatie en de cultuur van menselijke amniotische epitheelcellen (HAEC). Echter, deze veronderstellen dat het amniotische epitheel is een homogene laag. De menselijke amnion kan worden onderverdeeld in drie anatomische gebieden: reflecterend, Placental en navelstreng. Elke regio heeft verschillende fysiologische rollen, zoals in pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we een protocol om humaan amnion weefsel in drie secties te ontleden en in vitro te onderhouden. In de cultuur, cellen afgeleid van de gereflecteerde amnion weergegeven een kubus morfologie, terwijl cellen uit zowel placenta en navelstreng gebieden waren plaveiselcel. Niettemin, alle verkregen cellen hebben een epitheliale fenotype, aangetoond door de immunodetectie van E-cadherin. Omdat de placenta-en weerkaatste gebieden in situ verschillen in cellulaire componenten en moleculaire functies, kan het voor in vitro studies noodzakelijk zijn om deze verschillen te overwegen, omdat ze fysiologische implicaties kunnen hebben voor het gebruik van HAEC in biomedisch onderzoek en de veelbelovende toepassing van deze cellen in regeneratieve geneeskunde.

Inleiding

Humaan amniotische epitheelcellen (HAEC) ontstaan tijdens de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling, op ongeveer acht dagen na de bevruchting. Zij komen voort uit een populatie van plaveiselcel epitheelcellen van de epiblast die afkomstig zijn van de binnenste laag van het amniotische membraan¹. Zo worden HAEC beschouwd als overblijfselen van pluripotente cellen uit de epiblast die het potentieel hebben om zich te differentiëren in de drie kiem lagen van het embryo². In de afgelopen tien jaar hebben diverse onderzoeksgroepen methoden ontwikkeld om deze cellen te isoleren van het amniotische membraan tijdens de drac....

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituto Nacional de Perinatología in Mexico-stad (Registernummer 212250-21041). Alle procedures die in deze studies werden uitgevoerd, waren in overeenstemming met de ethische normen van het Instituto Nacional de Perinatología, de verklaring van Helsinki en de richtlijnen die zijn uiteengezet in de officiële Mexicaanse standaard van het ministerie van volksgezondheid.

1. voorbereiding

1. Bereid een oplossing van 1x PBS met EDTA. Voeg hiervoor 500 μL 0,5 M EDTA-kolf toe aan 500 mL 1x PBS voor een eindconcentratie van 0,5 mM EDTA.
2. Maak het kweekmedium voor HAE....

Resultaten

HAEC werden geïsoleerd van elk van de drie anatomische gebieden van het vrucht vlies en individueel gekweekt in vitro. Na 48 h van de cultuur, cellen met een epitheel fenotype gehecht aan het oppervlak van de plaat, hoewel de media bevatte ook celpuin en zwevende cellen, die werden verwijderd zodra het medium werd veranderd (Figuur 3).

Tijdens de verwerking van de primaire cultuur (passage Zero, P0), kunnen sommige complicaties ontstaan die de experimentele gegeve.......

Discussie

We implementeerden een nieuw protocol om HAEC te isoleren van term membranen. Het verschilt van eerdere rapporten in dat elk membraan werd verdeeld in de drie anatomische gebieden vóór isolatie om cellen te analyseren van elk.

Een van de meest kritische stappen in het protocol is het wassen van het membraan om alle bloedstolsels te verwijderen, omdat ze de activiteit van trypsine kunnen verstoren bij het scheiden van de epitheelcellen. Het niet goed uitvoeren van deze stap kan leiden tot het v.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Culture reagents
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific/Gibco	21985023	55 mM
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific/Gibco	15240062	100X
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific/Gibco	12430054	Supplemented with high glucose and HEPES
EDTA	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9260G	0.5 M
Embryonic stem-cell FBS, qualified	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10439024
Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11140050	100X
Paraformaldehyde	any brand
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific/Gibco	10010023	1X
Saline solution (sodium chloride 0.9%)	any brand
Sodium Pyruvate	Thermo Fisher Scientific/Gibco	11360070	100 mM
Trypsin/EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific/Gibco	25300054
Disposable material
100 µm Cell Strainer	Corning/Falcon	352360
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3526
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning/Costar	3516
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube	any brand		with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl.
Sterile cotton gauzes
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL	any brand
Sterile surgical gloves	any brand
Equipment
Biological safety cabinet
Centrifuge
Micropipettes
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Sterile beakers of 500 mL
Sterile plastic cutting board
Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps
Sterile stainless steel container
Sterile tray
Tube Rotator	MaCSmix
Antibodies and Kits			Antibody ID
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	RRID:AB_3975
Anti-KI67	Santa Cruz	23900	RRID:AB_627859)
Anti-NANOG	Peprotech	500-P236	RRID:AB_1268274
Anti-OCT4	Abcam	ab19857	RRID:AB_44517
Anti-SOX2	Millipore	AB5603	RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4	Cell Signaling	4755	RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60	Cell Signaling	4746	RRID:AB_2119059
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029	RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036	RRID:AB_10563566
Tunel Assay Kit	Abcam	66110