Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

Summary

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Abstract

In vitro differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) heeft het vermogen om menselijke ontwikkeling te bestuderen op zowel biologische als moleculaire niveaus getransformeerd en cellen verstrekt voor gebruik in regeneratieve toepassingen. Standaard benaderingen voor de hESC cultuur met behulp van kolonie type cultuur te handhaven ongedifferentieerde hESCs en embryo id lichaam (EB) en rozet vorming voor differentiatie in verschillende kiem lagen zijn inefficiënt en tijdrovend. Gepresenteerd hier is een eencellige cultuur methode met behulp van hESCs in plaats van een kolonie-type cultuur. Deze methode maakt het mogelijk om de karakteristieke kenmerken van ongedifferentieerde hESCs te onderhouden, inclusief expressie van hESC-markers op niveaus die vergelijkbaar zijn met hESCs van het kolonie type. Bovendien, het protocol presenteert een efficiënte methode voor neurale voorlopercellen (NPC) generatie van eencellige type hESCs die Npc's binnen 1 week produceert. Deze cellen uitdrukken sterk verschillende NPC marker genen en kunnen differentiëren in verschillende neurale celtypen, waaronder Dopaminerge neuronen en astrocyten. Dit eencellige cultuur systeem voor hESCs zal nuttig zijn bij het onderzoeken van de moleculaire mechanismen van deze processen, studies van bepaalde ziekten en Drug Discovery-schermen.

Introduction

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) hebben het potentieel om te differentiëren in de drie primaire kiem lagen, die vervolgens differentiëren in verschillende multipotente voorlopercellen. Deze kilometerstanden geven vervolgens aanleiding tot alle celtypen in het menselijk lichaam. In vitro cultuur systemen van hESC hebben het vermogen om menselijke embryonale ontwikkeling te bestuderen getransformeerd en hebben gediend als waardevol hulpmiddel voor het verkrijgen van nieuwe inzichten in hoe deze processen op het biologische en moleculaire niveau worden gereguleerd. Evenzo, studies van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gegenereerd uit herprogrammering s....

Protocol

1. bereiding van de hESC-gekwalificeerde Basmembraan-gecoate platen

1. Langzaam ontdooien de hESC-gekwalificeerde kelder membraan matrix (Zie tabel van de materialen) oplossing bij 4 °c gedurende ten minste 2 – 3 uur of 's nachts om vorming van een gel te voorkomen.
2. Voor de bereiding van de kelder-gecoate platen, Verdun matrix in koude DMEM/F12 tot een 2% eindconcentratie. Meng goed en Coat elk goed van een 6-put plaat met 1 mL van de verdunde matrix oplossing.
3. Incuberen de kelder-gecoate platen op kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 3 uur of bij 4 °C 's nachts.
   Opmerking: platen met een kelder membraan matrix kunn....

Results

Gepresenteerd hier is een verbeterd protocol voor het onderhoud en de uitbreiding van de eencellige type cultuur van hESCs en hun efficiënte differentiatie in neurale voorlopercellen, die vervolgens differentieert in verschillende downstream neurale lijnen, met inbegrip van Dopaminerge neuronen en astrocyten.

Representatieve fase contrast beelden tonen celmorfologie in verschillende stappen tijdens de aanpassing van de kolonie type hESCs aan de eencellige type cultuur (Fig.......

Discussion

Schaalbare en efficiënte methoden voor de differentiatie van hESCs in verschillende kilometerstanden en het genereren van voldoende aantallen gedifferentieerde cellen zijn belangrijke criteria voor geneesmiddelen screening en stamceltherapie. Verschillende methoden voor het passeren van één cel zijn gepubliceerd, waarin cellen worden gekweekt in de aanwezigheid van rotsremmer of andere kleine moleculen om de overleving te verbeteren, maar de eindproducten van deze cultuur methoden zijn kolonie type hescs

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm m-dishes	ibidi	81156	Cell culture dish
6-well plates	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Cell detachment solution
Activin A	R&D system	338-AC-050
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4403
B27 supplement	Thermo Fisher	17504044
B27 supplement (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Applied Biological Materials	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
Centrifuge	DAMON/ICE	428-6759
CO2 incubator	Thermo Fisher	4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)	Corning	354277	Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Cell freezing solution
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Applied Biological Materials	Z101705
GDNF	Applied Biological Materials	Z101057
Geltrex matrix	Thermo Fisher	A1569601	Basement membrane matrix
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout DMEM	Thermo Fisher	10829018
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poly-L-ornithine	Sigma Aldrich	P3655
ROCK inhibitor	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Applied Biological Materials	Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium	Stemcell Technologies	5833	NPC expansion medium