Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

21.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60575

⸱

29 januari 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Samenvatting

Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om eiwitexpressie en lokalisatie te verkennen tijdens zowel normale ontwikkelings- als ziektetoestanden. Hoewel veel immunohistochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor weefsel- en weefselsecties van zoogdieren, vereisen deze protocollen vaak modificatie en optimalisatie voor niet-zoogdiermodelorganismen. Zebravissen worden steeds vaker gebruikt als een modelsysteem in fundamenteel, biomedisch en translationeel onderzoek om de moleculaire, genetische en celbiologische mechanismen van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Zebravissen bieden veel voordelen als modelsysteem, maar vereisen ook aangepaste technieken voor optimale eiwitdetectie. Hier bieden we ons protocol voor de gehele mount fluorescentie immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven. Dit protocol beschrijft bovendien verschillende montagestrategieën die kunnen worden gebruikt en een overzicht van de voor- en nadelen die elke strategie biedt. We beschrijven ook wijzigingen in dit protocol om detectie van chromogene substraten in hele mountweefsel en fluorescentiedetectie in gesectioneerd larveweefsel mogelijk te maken. Dit protocol is in grote lijnen van toepassing op de studie van vele ontwikkelingsstadia en embryonale structuren.

Inleiding

De zebravis (Danio rerio) is ontstaan als een krachtig model voor de studie van biologische processen om verschillende redenen, waaronder korte generatie tijd, snelle ontwikkeling, en beaambaarheid aan genetische technieken. Als gevolg hiervan worden zebravissen vaak gebruikt in hoge doorvoer kleine molecuul schermen voor toxicologisch onderzoek en drugs ontdekking. Zebravissen zijn ook een aantrekkelijk model voor de studie van ontwikkelingsprocessen, aangezien één vrouwtje routinematig 50-300 eieren tegelijk kan produceren en de optisch heldere embryo's zich extern ontwikkelen, waardoor ontwikkelingsprocessen efficiënt kunnen worden gevisualerd. Echter, vroeg onderzoek baseerde zich meestal op voorwaartse genetische schermen met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of andere mutageens als gevolg van uitdagingen bij het vaststellen van omgekeerde genetische technieken. Ongeveer twee decennia geleden werden morpholinos voor het eerst gebruikt bij zebravissen om gerichte genen neer te halen1. Morpholinos zijn kleine antisense oligonucleotiden die de vertaling van doelmRNA remmen na micro-injectie in een embryo in een vroeg ontwikkelingsstadium. Een grote zwakte van morpholinos is dat ze worden verdund als de cellen te verdelen en over het algemeen verliezen effectiviteit door 72 uur na de bevruchting (hpf). Terwijl morpholinos een krachtig instrument blijven voor verstoring van het zebravisgen, worden transcriptionor-achtige effector nucleases (TALENs), zink-vinger nucleases (ZFNs), en geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic herhalingen (CRISPRs) meer recent gebruikt om direct gericht op de zebravis genoom2,3. Deze omgekeerde genetische strategieën, in combinatie met voorwaartse genetica en hoge doorvoerschermen, hebben de zebravissen vastgesteld als een krachtig model om genexpressie en functie te bestuderen.

De capaciteit om genfunctie te bestuderen vereist over het algemeen een evaluatie van de spatio-tijdelijke distributie van gen of genproductuitdrukking. De twee meest gebruikte technieken om dergelijke expressiepatronen te visualiseren tijdens de vroege ontwikkeling zijn in situ hybridisatie (ISH) en hele mount immunohistochemie (IHC). In situ hybridisatie werd voor het eerst ontwikkeld in 1969 en is gebaseerd op het gebruik van gelabelde antisense RNA sondes om mRNA expressie in een organisme te detecteren4. In tegenstelling, gelabelde antilichamen worden gebruikt in immunohistochemie om eiwitexpressie te visualiseren. Het idee van het etiketteren van eiwitten voor detectie dateert uit de jaren 19305 en de eerste IHC experiment werd gepubliceerd in 1941 toen FITC-gelabelde antilichamen werden gebruikt om pathogene bacteriën in geïnfecteerde weefsels op te sporen6. ISH en IHC zijn in de daaropvolgende decennia sterk geëvolueerd en verbeterd en worden nu zowel routinematig gebruikt in het moleculaire en diagnostische onderzoekslaboratorium7,8,9,10,11. Hoewel beide technieken voor- en nadelen hebben, biedt IHC verschillende voordelen ten opzichte van ISH. Praktisch, IHC is veel minder tijdrovend dan ISH en is over het algemeen minder duur, afhankelijk van de kosten van de primaire antilichaam. Bovendien, mRNA expressie is niet altijd een betrouwbare metrische van eiwitexpressie als het is aangetoond bij muizen en mensen dat slechts ongeveer een derde van de eiwit overvloed variatie kan worden verklaard door mRNA overvloed12. Om deze reden is IHC een belangrijk supplement om ISH-gegevens te bevestigen, indien mogelijk. Ten slotte kan IHC subcellulaire en co-lokalisatiegegevens verstrekken die niet kunnen worden bepaald door ISH13,14,15. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode om eiwitten betrouwbaar te detecteren door immunohistochemie in hele mount zebravisembryo's en larven. Het doel van deze techniek is het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie van een eiwit van belang in het hele embryo. Deze technologie maakt gebruik van antigeenspecifieke primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Het protocol is gemakkelijk aan te passen aan gebruik op dia-gemonteerde weefselsecties en voor gebruik met chromogene substraten in plaats van fluorescentie. Met behulp van dit protocol, we aantonen dat de ontwikkeling van zebravissen skeletspier drukt ionotropische glutamaat receptoren, in aanvulling op acetylcholine receptoren. NMDA-type glutamaat receptor subunits zijn detecteerbaar op de longitudinale spier op 23 pkf.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De procedures voor het werken met zebravis fokken volwassenen en embryo's beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Murray State University.

1. Embryoverzameling en fixatie

  1. Bereid paaitanks voor door volwassen zebravis gemengde seksparen of groepen in tanks te plaatsen met een gaas of sleuvenvoering gevuld met systeemwater 's nachts.
  2. Bij lichten aan, verander de paaitank water voor vers systeemwater om uitwerpselen te verwijderen. Gebruik een 14 h/10 h lichte donkere cyclus met lichten die aangaan om 9 uur.
  3. Zodra eieren zijn gelegd, terug te keren de volwassenen naar huis tanks.
  4. Verzamel eieren door ze op te maken met behulp van een transfer pipet of gieten ze in een mesh zeef.
  5. Breng de eieren over naar petrischaaltjes die halverwege met embryomedium zijn gevuld (zoals 30% Danieau of E2-embryomedium met 0,5 mg/L methyleenblauw), waardoor het aantal embryo's per schotel wordt beperkt tot 50.
  6. Verwijder alle eieren die dood zijn of niet te verdelen.
    OPMERKING: Dode embryo's kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als ze ondoorzichtig worden en vaak "troebel" lijken. Als methyleenblauw aan embryomedium wordt toegevoegd, krijgen de dode embryo's een donkerblauw uiterlijk.
  7. Broed gerechten van eieren bij 28,5 °C tot ze het gewenste stadium bereiken. Voor dit experiment, verhogen van de embryo's tot 23 pkf.
  8. Optioneel) Breng de embryo's op 24 pk fin naar 200 μM 1-fenyl 2-thiourea (PTU) in embryomedium om melanogenese16,17te voorkomen . Als alternatief bleekmiddelen na fixatie (zie optioneel punt 5).
  9. Verander embryo medium of PTU medium per dag.
  10. Dechorionate onuitgebroede embryo's met behulp van ultra-fijne-tip tangen onder een stereomicroscoop. Als alternatief, chemisch dechorionate embryo's door uitte broeden in 1 mg/mL Pronase in embryo medium gedurende enkele minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de embryo's uit Pronase en was drie keer met embryomedium.
  11. Gedechorionated embryo's blijven bij plastic. Bewaar ze in glas of plastic petrischaaltjes bedekt met 1-2% agarose opgelost in embryomedium. Verplaats gedechorionated embryo's met behulp van brandgepolijste Pasteur pipten om schade te minimaliseren.
  12. Breng de embryo's over op centrifugebuizen van 1,5 mL met behulp van een plastic of brandgepolijste pipet.
  13. Verwijder embryomedium met een micropipet. Laat alleen genoeg vloeistof om alleen de embryo's te dekken na elke vloeistofverandering.
  14. Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een chemische rookkap.
    LET OP: PFA is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.
  15. Bevestig de embryo's in 4% PFA voor 1-2 uur met zacht schommelen bij kamertemperatuur. U ook de embryo's 4 uur vastzetten tot 's nachts bij 4 °C.
  16. Was drie keer in 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) gedurende 5 min.
  17. Gebruik de embryo's onmiddellijk of bewaar maximaal 1 week op 4 °C.
  18. Voor langdurige opslag dehydrateert u de embryo's in 100% methanol (MeOH) 2 uur of 's nachts bij -20 °C. Bewaar de embryo's enkele maanden op -20 °C in MeOH.
    LET OP: MeOH is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.

2. Embryopreparaat

  1. Rehydrateer de embryo's door middel van seriële incubatie bij kamertemperatuur.
    1. Incubeer in 75% MeOH/25% 1x PBS voor 5 min, rocken.
    2. Incubeer in 50% MeOH/50% 1x PBS voor 5 min, rocken.
    3. Incubeer in 25% MeOH/75% 1x PBS voor 5 min, rocken.
    4. Incubeer in 100% PBTriton voor 5 min, rocken.
  2. (Optioneel) Bereid een verse eiwitase K-werkoplossing (10 μg/mL in PBTriton) op ijs door 10 μL vers ontdooide eiwitase K-bouillon (10 mg/mL) toe te voegen.
    1. Permeabilize de embryo's door tot 30 min te verteren in Proteinase K.
      LET OP: Voorgestelde timing is <24 pkf: geen spijsvertering; 24 pkf: 15 min spijsvertering; en 7 dagen oud: 30 min spijsvertering.
    2. Spoel gepermeabiliseerde embryo's in PBTriton en bevestig in 4% PFA gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
    3. Was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 5 min op kamertemperatuur met zacht schommelen.

3. Primaire antilichaam incubatie

  1. Selecteer een commerciële blokkeringsoplossing of serum dat overeenkomt met de secundaire antilichaamgastheersoorten (bijvoorbeeld 10% geitenserum in PBTriton) met of zonder 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).
  2. Blokkeer de embryo's in blokkerende oplossing voor 1-3 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen.
  3. Incubeer in primair antilichaam verdund in blokkerende oplossing of 1% serum in PBTriton 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen. In dit experiment, de primaire antilichamen gebruikt waren anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA receptor, en anti-fosfo-Histone H3, elk verdund tot een laatste concentratie van 1:500 in 1% geit serum in PBTriton.
  4. Was vijf keer in PBTriton gedurende 10 minuten op kamertemperatuur tijdens het schommelen.

4. Secundaire antilichaam incubatie

  1. Selecteer een secundair antilichaam op basis van de gastheersoorten van het primaire antilichaam en de gewenste golflengte.
  2. Incubeer in secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing of 1% serum gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (of 's nachts bij 4 °C) tijdens het schommelen.
    OPMERKING: Fluorescerende secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. We gebruikten 1:500 geit-anti-muis Alexa488 verdund in 1% geitenserum in PBTriton.
  3. Bedek de buizen met aluminiumfolie of bedek met een lichtblokkerende doos voor deze en alle volgende stappen.
  4. Was drie keer in PBTriton gedurende 10 min op kamertemperatuur tijdens het schommelen.
  5. Breng de embryo's over naar een 50% glyceroloplossing in PBS over een bed van 2% agarose in embryomedium en ga verder naar documentatie of ga verder naar verdere verwerkingsstappen hieronder.

Optionele stappen

5. Bleken

  1. Bereid bleekoplossing in een buis van 1,5 mL voor door 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL van 2 M KOH en 100 μL van 30% H2O2toe te voegen.
  2. Omkeren van de buis drie keer te mengen.
  3. Pipetteer 1 mL bleekoplossing richting aan de embryo's.
  4. Open de embryobuisdop om gas te laten ontsnappen. Tik voorzichtig op de buis op de bank om bubbels los te maken.
  5. Monitor het bleekproces (gebruik indien nodig een microscoop) en stop de reactie wanneer pigment voldoende wordt verwijderd (ongeveer 5 min voor 24 pk f of 10 min voor 72 pkf).
  6. Verwijder de bleekoplossing voorzichtig met een micropipet en spoel embryo's drie keer in 1 mL PBTriton.
    LET OP: Embryo's zijn plakkerig in deze stap.
  7. Ga hieronder verder naar documentatie of verdere verwerkingsstappen.

6. Embryodissectie en Deyolking

  1. Om de dooier te verwijderen, breng je een kleine hoeveelheid (~ 200 μL of genoeg om het embryo volledig te bedekken, maar beperkend genoeg om te beperken waar het kan zweven) van 1x PBS naar een depressieglijbaan of een gewone glazen glijbaan.
  2. Gebruik een plastic overdracht pipet om 1 of meer embryo's te verplaatsen naar de PBS druppel.
  3. Gebruik ultrafijne tangen en 00 insectenpennen om de dooier uit elkaar te halen en heel voorzichtig dooierkorrels van het ventrale oppervlak van het embryo te schrapen (zie ook Cheng et al., 2014)18.
  4. Verwijder dooierkorrels en vul PBS indien nodig aan.
  5. Herhaal dit totdat het embryo voldoende vrij is van dooier.

7. Vlakke montage op glijbanen

  1. Breng dedooierembryo's over op een geladen glazen schuif met een plastic pipet of een micropipet te met 1 mL met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen). Oriënteer naar wens met een 200 μL micropipett tip of insectenpin.
  2. Wick weg overtollige PBS met een Kim doekje of papieren handdoek.
  3. Voeg 2-3 druppels montagemedium toe aan de glijbaan en de coverslip.
  4. De lucht droogt ongeveer 5 tot 10 min.
  5. Sluit het dekselglas op de glijbaan met duidelijke nagellak.
    LET OP: De randen van het afdekglas moeten volledig bedekt zijn met een dunne, doorlopende laag nagellak.
  6. Laat ongeveer 10 minuten drogen voordat u beeldgeeft.

8. Montage in Agarose

  1. Bereid 1% agarose in embryomedium door 0,5 g agarose toe te voegen aan 50 mL embryomedium in een microgolfveilige kolf of beker van ten minste 3x groter volume dan gewenst.
  2. Verwarm in een magnetron, wervelend om de 30 s, totdat agarose volledig is opgelost.
  3. Maak 1 mL aliquots in centrifugebuizen van 1,5 mL. Bewaar de aliquots op kamertemperatuur.
  4. Dek buisdoppen af met dopsloten voor het verwarmen.
  5. Plaats agarose buizen in een drijvende buis houder in een beker half gevuld met water.
  6. Magnetron het bekerglas met drijvende buizen voor 2-3 min, of totdat agarose volledig is gesmolten.
  7. Breng een embryo over op de overbrugde glijbaan met een plastic pipet of een 200 μL micropipette met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen).
  8. Plaats het embryo op een rechthoekige coverslip met insectenpinnen en voeg ongeveer 20 μL gesmolten agarose direct toe aan het embryo.
  9. Oriënteer snel de regio van belang het dichtst bij de coverslip met behulp van 00 insecten pinnen.
    LET OP: Dit is een omgekeerde mount.
  10. Breng de agarose buis terug naar de warmwaterbuis vlotter tussen elk gebruik en magnetron als dat nodig is.
  11. Beeld dat een microscoop gebruikt wanneer agarose uithardt. Houd het gemonteerde embryo ondersteboven voor gebruik op een omgekeerde microscoop. Draai de coverslip om (zodat de agarose onder de coverslip ligt) voor gebruik op rechtopstaande microscopen.

9. Montage op overbrugde glijbanen

  1. Om overbrugde glijbanen te maken, lijm vierkante coverslips aan de glazen glijbaan met behulp van een kleine stip van superlijm.
    OPMERKING: Er moet een trog van ten minste 5 mm breed tussen de coverslips. Twee #1 coverslips hoog is meestal geschikt voor 24-48 pkf embryo's, terwijl drie coverslips hoog nodig kan zijn voor 72 pkf.
  2. Breng 1-2 deyolked embryo's over naar de overbrugde glijbaan met een plastic pipet of een 200 μL micropipette met een getrimde tip (om schuifspanning te verminderen).
  3. Wick weg overtolligvocht met een Kim doekje of papieren handdoek.
  4. Voeg een daling van ≥80% glycerol direct toe aan het embryo.
  5. Dek af met een rechthoekig dekselglas. De druppel glycerol moet het dekselglas raken.
  6. Voeg meer glycerol toe aan de ruimte tussen het dekselglas en de dia als dat nodig is om het embryo volledig te bedekken met een marge van glycerol aan de zijkanten van het embryo.
  7. Schuif het rechthoekige dekselglas voorzichtig om het embryo in positie te rollen voor beeldvorming.

10. DAB-kleuring

OPMERKING: Deze sectie begint na stap 4.2 hierboven en vervangt de rest van stap 4.

  1. Bebroed de embryo's in een blokkerende oplossing met een geperoxideerd secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C tijdens het schommelen.
  2. Was drie keer in PBTriton gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  3. Breng de embryo's over op een kweekplaat of depressieplaat met een transferpipet.
  4. Meng 50 μL van 1% DAB (3,3'-diaminobenzidine) opgelost in ddH2O en 50 μL van 0,3% waterstofperoxide en breng tot 1 mL met PBS.
    LET OP: DAB is een gevaarlijk materiaal. Draag handschoenen en gooi dab-verontreinigde vloeistoffen en vaste stoffen in aangewezen gebieden.
  5. Bedek met HRP bevlekte embryo's met de hierboven opgestelde DAB-oplossing en monitor onder een microscoop op kleurontwikkeling (meestal 1-5 min).
  6. Na het bereiken van het gewenste niveau van kleurontwikkeling, spoel de embryo's kort in PBS.
  7. Breng de embryo's terug naar een buis van 1,5 mL voor fixatie.
  8. Bevestig de embryo's opnieuw voor 15-20 min in 4% PFA bij kamertemperatuur.
  9. Was de embryo's drie keer in PBTriton gedurende 5 min.
  10. Ga naar documentatie.

11. Gewijzigd protocol voor kleuring sectioned tissue dat is gemonteerd op dia's

  1. Omring weefsel om te worden bevlekt met een pap pen.
  2. Breng de glijbanen naar een vochtige kamer.
  3. Voeg 1 mL PBS direct toe aan de dia.
  4. Incubeer 7 min bij kamertemperatuur om inbeddingmedium te verwijderen.
  5. Giet PBS af door dia om te keren.
  6. Rehydrateer 1 min in maximaal 1 mL TNT buffer (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
  7. Blokkeer in maximaal 1 mL blokkeringsoplossing (commercieel of 10% serum + 2% BSA) voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. Incubeer 's nachts in primair antilichaam verdund in 1% serum of blokkeringsoplossing bij 4 °C.
  9. Was vijf keer in maximaal 1 mL TNT-buffer bij kamertemperatuur.
  10. Incubeer in secundair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Bedek de kamer met folie of gebruik een donker deksel.
  11. Was vijf keer in TNT bij kamertemperatuur. Giet de laatste wasaf.
  12. Monteer met 2-3 druppels montagemedium en coverslip. Laat 5-10 min zitten.
  13. Sluit het dekselglas op de glijbaan met behulp van duidelijke nagellak. Laat volledig drogen voordat beeldvorming.

12. Documentatie

  1. Neem de volledige procedure en eventuele afwijkingen op in een labnotebook.
  2. Neem de concentratie, naam, catalogusnummer, fabrikant en lotnummer van het primaire antilichaam op.
  3. Plaats de juiste gemonteerde monster op de microscoop fase. Zoek de regio van belang.
  4. Selecteer een relatief helder voorbeeld. Stel camerabelichting in en gain, zodat het signaal voldoende helder is zonder te verzadigen.
  5. Vergelijk de kleurintensiteit van dezelfde interesseregio met dezelfde blootstellingsinstellingen wanneer u vergelijkt tussen experimentele embryo's met antilichamen en controleantilichamen (ex. IgG) embryo's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hele mount immunohistochemie maakt gebruik van antilichamen om het ruimtelijke patroon van eiwitexpressie in het intacte dier te detecteren. De basisworkflow van immunohistochemie (afgebeeld in figuur 1)omvat het fokken van zebravis, het kweken en voorbereiden van embryo's, het blokkeren van niet-specifieke antigenen, het gebruik van een antigeenspecifiek primair antilichaam om het eiwit van belang te targeten, dat primaire antilichaam op te sporen met een ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Immunohistochemie is een veelzijdig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de spatio-temporele expressie van vrijwel elk eiwit van belang in een organisme te karakteriseren. Immunohistochemie wordt gebruikt op een breed scala aan weefsels en modelorganismen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik bij zebravissen. Immunohistochemie bij verschillende soorten kan verschillende fixatie- en behandelingstechnieken vereisen, waardoor oplossingen worden geblokkeerd, afhankelijk van soorten en de aanwezigheid van endogene pe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen informatie te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering van NIH subsidie 8P20GM103436 14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Aluminum foil, heavy dutyKirklandElk merk mag worden vervangen
Anti-NMDA-antilichaamMillipore SigmaMAB363
Anti-fosfo-histon H3 (Ser10), clone RR002Millipore Sigma05-598
Anti-pan-AMPA-receptor (GluR1-4)Millipore SigmaMABN832
Bovine serumalbumine (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Calciumnitraat [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Centrifugebuizen, 1,5 mlAxygenMCT150C
Klare nagellakSally HansonElke nagellak of verharder kan worden vervangen
Depressie (concaviteit) glijbaanElectron Miscroscopy Sciences71878-01
DiaminobenzidineThermo Scientific1855920
Embryo medium, Danieau, 30%17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES in ultrapuur water.
Embryo medium, E27,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L methyleenblauw
Zwevende buishouderThermo Scientific59744015
Fluorescentie-samengestelde microscoopLeica BiosystemsDMi8
Fluorescentie stereomicroscoopLeica BiosystemsM165-FC
Glazen deksels 18 mm x 18 mmCorning284518
Glazen deksels 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
Glazen dia'sFisher Scientific12-544-4
GlycerolFisher ScientificBP229-1
Geit anti-muis IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES-oplossingSigma AldrichH0887
Vochtige kamer met dekselSimportM920-2
Waterstofperoxide, 30%Fisher ScientificH325-500
Immunedge pap penVector labsH-4000
Insectenpins, maat 00Stoelting5213323
Magnesiumsulfaat (MgSO4 · 7H2O)Sigma Aldrich63138
GaasfilterOneidaElk merk mag worden vervangen
MethanolSigma Aldrich34860
MethyleenblauwSigma AldrichM9140
Micro-buisjes dopvergrendelingResearch Products International145062
MicrogolfovenToastmaster
Muis IgGSigma AldrichI8765
Normaal geitenserumMillipore SigmaS02L1ML
Roterende mixerFisher Scientific88-861-044
ParaformaldehydeFisher Scientific04042-500
Pasteur pipettenFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount montagemediumFisher ChemicalSP15-500
Petrischaal (glas)Pyrex3160100
Petrischaal (plastic)Fisher ScientificFB0875713
1-fenyl 2-thioureumAcros Organics207250250
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 10x, pH 7,4Gibco70011-044
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1x1x gemaakt van 10x stock verdund in dH2O
Kaliumchloride (KCl)Sigma AldrichP9333
Kaliumhydroxide (KOH)FisherP250-500
Kaliumfosfaat monobasisch (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PronaseSigma Aldrich10165921001
Proteinase KInvitrogenAM2544
Natriumchloride (NaCl)Sigma AldrichS7653
Natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
Paaitank met deksel en inzetstukAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + dia'sFisher Scientific12-550-15
Superlijm gel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1% Tween20; gemaakt in dH2O
TransferpijpFisher13-711-7M
Trichlorazijnzuur (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris-basisFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Ultrafijne pincettenFisher Scientific16-100

Referenties

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376(2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991(2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Proteïne-expressieconfocale microscopieantilichaamskleuringweefselfixatieblokkeringsoplossingsecundair antilichaammontagestrategieënfluorescentiedetectie
Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.