Method Article

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcriptie factoren kunnen veranderen de expressie van tal van doelgenen die een verscheidenheid van downstream processen waardoor ze goede doelen voor anti-kanker therapieën beïnvloeden. Echter, direct gericht transcriptie factoren is vaak moeilijk en kan leiden tot nadelige bijwerkingen als de transcriptie factor nodig is in een of meer volwassen weefsels. Het identificeren van upstream regulatoren die afwijkend activeren transcriptie factoren in kankercellen biedt een meer haalbaar alternatief, vooral als deze eiwitten zijn gemakkelijk te drogeren. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt om arrayed medium-scale lentivirale bibliotheken en een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie verslaggever assay te combineren om nieuwe regelgevers van transcriptie factoren in kankercellen te identificeren. Onze aanpak biedt een snelle, eenvoudige en goedkope manier om honderden genen in één experiment te testen. Om het gebruik van deze aanpak aan te tonen, hebben we een scherm uitgevoerd van een arrayed lentivirale RNAi-bibliotheek met verschillende regelgevers van Ja-geassocieerdeiwit (YAP) en transcriptieco-activator met PDZ-bindend motief (TAZ), twee transcriptieco-activators die de downstream-effectoren van het Hippo-pad zijn. Deze benadering kan echter worden aangepast om te screenen op regelgevers van vrijwel elke transcriptiefactor of cofactor en kan ook worden gebruikt om CRISPR/CAS9-, cDNA- of ORF-bibliotheken te screenen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze test is om virale bibliotheken te gebruiken om regelgevers van transcriptiefactoren op een relatief snelle en goedkope manier te identificeren. Afwijkende transcriptieactiviteit wordt geassocieerd met kanker en metastase1,,2,3,4,5,6, dus gericht op transcriptiefactoren in kankercellen is een veelbelovende therapeutische benadering. Echter, transcriptie factoren zijn vaak moeilijk te richten farmacologisch7 en velen zijn nodig voor de normale cellulaire functie in volwassen weefsels8,9,10. Gericht op de kanker-geassocieerde trajecten die aberrantly activeren transcriptie factoren om ziekte te rijden is een meer haalbare aanpak met het potentieel om minder ernstige bijwerkingen hebben. De commerciële beschikbaarheid van arrayed lentivirale en retrovirale RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, of ORF bibliotheken stelt onderzoekers in staat om het belang van talrijke genen te testen in een enkel experiment. Er is echter een betrouwbare uitlezing voor gewijzigde transcriptieactiviteit vereist.

Hier beschrijven we het gebruik van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test en arrayed lentivirale bibliotheken om eiwitten die transcriptie factoren in kankercellen te reguleren identificeren. In deze test worden shRNAs die zich richten op kanker-geassocieerde genen geleverd aan zoogdierkankercellen via lentivirale transductie en cellen worden geselecteerd voor stabiele integratie met behulp van puromycine. De cellen worden vervolgens getransfecteerd met een verslaggever constructie die firefly luciferase gedreven door een promotor die specifiek is voor de transcriptie factor die wordt onderzocht en een controle constructie die Renilla luciferase uitdrukt van een constitutief actieve promotor die niet reageert op de transcriptie factor wordt onderzocht. We demonstreren deze aanpak met een proof-of-concept scherm voor regelgevers van YAP en TAZ, de kritische downstream-effectors van het Hippo-pad8,10,11. Abnormale activiteit van YAP en TAZ bevordert verschillende stappen van de uitgezaaide cascade11 en wordt waargenomen bij veel vormen van kanker11,12,13. Echter, hoe YAP en TAZ worden aberrantly geactiveerd in sommige kankercellen is nog niet volledig begrepen. YAP en TAZ binden geen DNA, maar worden in plaats daarvan aangeworven om promotors door andere transcriptiefactoren. Leden van de TEA-domein (TEAD)-familie van transcriptiefactoren zijn de belangrijkste bindende partners voor YAP en TAZ en zijn van cruciaal belang voor de meeste YAP- en TAZ-afhankelijke functies. Onze verslaggever constructie drukt firefly luciferase van een YAP / TAZ-TEAD-responsieve promotor en eerdere studies hebben aangetoond dat het getrouw veranderingen in YAP-TEAD en TAZ-TEAD transcriptie activiteit2,14,15detecteert .15

Onze aanpak is snel, medium-throughput, en vereist geen screening faciliteiten, geautomatiseerde robots, of diepe volgorde van gepoolde bibliotheken. De kosten zijn relatief laag en er zijn tal van commercieel beschikbare bibliotheken om uit te kiezen. De benodigde apparatuur en reagentia zijn ook relatief standaard in de meeste laboratoria. Het kan worden gebruikt om te screenen voor regelgevers van vrijwel elke transcriptie factor als een luciferase-gebaseerde verslaggever bestaat of wordt gegenereerd. We gebruiken deze benadering om shRNAs in kankercellen te screenen, maar elke cellijn die met redelijke efficiëntie kan worden getransfecteerd, kan worden gebruikt met elk type arrayed-bibliotheek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Een schematische samenvatting van dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Voorbereiding van de lentivirale vectorbibliotheek

OPMERKING: Het gedemonstreerde scherm gebruikte een arrayed shRNA-bibliotheek gekocht als glycerol-bestanden in 96-putplaten, maar bibliotheken kunnen ook handmatig worden samengesteld op basis van een lijst met kandidaten. Passende besturingselementen moeten in elke bibliotheek worden overwogen en opgenomen. Dit omvat een niet-targeting controle shRNA (shNTC), een controle shRNA gericht op de transcriptie factor wordt onderzocht, en indien mogelijk, een shRNA gericht firefly luciferase.

  1. Voeg 1,3 mL Luria Broth (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% gistextract, 1% NaCl, pH 7.5) met 100 μg/mL ampicillin toe aan elke put van een 96-well deep well plaat. Inent elk goed met 2 μL glycerolvoorraad en groei 's nachts bij 37 °C met constante agitatie bij 225 tpm.
  2. Breng elke bacteriële cultuur over in een centrifugebuis van 1,5 mL en pellet de bacteriën door centrifugering bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min.
  3. Zuiver elke vector met behulp van een bacteriële mini-prep kit door het volgen van het protocol van de fabrikant.
  4. Bepaal de concentratie van elke vector met behulp van een spectrofotometer.
  5. Bewaar de plasmiden op -20 °C.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.

2. Verpakking van de arrayed lentivirale bibliotheek

OPMERKING: Alle werkzaamheden met betrekking tot lentivirus, met inbegrip van verpakking, infectie, en de daaropvolgende kweek van geïnfecteerde cellen moeten strikt voldoen aan de institutionele bioveiligheid regels en voorschriften.

  1. Breid de 293FT-cellen uit met behulp van volledige groeimedia (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 4 mM L-glutamine, 4.500 mg/L glucose en natriumpyruvaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine antibioticum en 2 mM L-glutamine).
  2. Zaad voor elke vector in de bibliotheek vanaf stap 1.4 één 24-put met 1 x 105 293FT-cellen.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat sommige extra putten van een controle virale vector worden verpakt en gebruikt om de titer van het virus te testen voordat u doorgaat naar stap 3 (zie hieronder).
  3. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Een algemeen protocol voor de verpakking van lentivirus dat eerder werd beschreven14 is teruggebracht tot 24 putten voor dit protocol. Het gebruikt psPAX2 voor lentivirale verpakking en VSVG als laageiwit. Als ectropic virus gewenst is, kan een vector die Eco levert worden gebruikt in plaats van VSVG. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat dit protocol is geoptimaliseerd om een virale titer te bereiken die tussen de 30%-70% infectie-efficiëntie van de doelcellen geeft (zie Discussie). Zie Aanvullende tabel 1 voor een lijst met alle gebruikte vectoren.
  4. Stel een transfection mengsel voor elke virale vector uit stap 1.4 zoals hieronder beschreven. Elke transfection moet 250 ng van de virale vector, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μL transfection reagens 1 en 23,75 μL transfection buffer (zie Tabel van materialen)bevatten.
    1. Verdun elke lentivirale vector tot 50 ng/μL met nucleasevrij water en breng vervolgens 5 μL (250 ng) over in een put van een 96-put PCR-plaat.
    2. Maak de transfection super mix door het mengen van 1,25 μL * X van transfection reagens 1 en 23,75 μL * X van voorverwarmde transfection buffer waar "X" is het totale aantal transfections plus enkele extra om rekening te houden met volumeverlies tijdens pipetteren.
    3. Incubeer de transfection super mix bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Voeg 125 ng * X van psPAX2 en 125 ng * X van VSVG aan de buis van transfection super mix van Stap 2.4.3 en zachtjes pipet op en neer te mengen. Ga snel naar Stap 2.4.5.
    5. Onmiddellijk aliquot het mengsel uit stap 2.4.4 in elke buis van een PCR strip, en gebruik dan multi-channel pipet om 25 μL het mengsel over te brengen in elke put met virale vector uit stap 2.4.1.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
    7. Breng alle 30 μLs van elke 96-put van stap 2.4.6 over in een put van de 24-put met 293 FT cellen uit stap 2.3.
  5. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor 24 uur en vervang vervolgens de media in elke put van de 24-putplaat door 500 μL verse volledige groeimedia. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor nog eens 24 uur.
  6. Met behulp van een multi-channel pipet, verzamel de virale supernatant van elke put en aliquot 220 μL (genoeg voor 1 infectie in stap 3 plus wat extra volume) in twee 96-putten elk. Dit zijn de matrixen virale supernatant platen.
  7. Bewaar de matrixen virale supernatant platen op -80 °C.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het wordt ook aanbevolen om een deel van de extra controle virus dat werd verpakt (zie hierboven) op de cellen te worden besmet voordat u doorgaat naar stap 3 te testen. Dit is om ervoor te zorgen dat de titer voldoende is om ten minste 30% infectie efficiëntie te bereiken.

3. Infectie van de cellen voor het scherm

OPMERKING: Menselijke melanoomcellen (A375) werden gebruikt om deze aanpak aan te tonen, maar deze methode kan worden toegepast op alle aanhangende cellen die infecteren met lentivirus. Celkweek en beplatingmoeten echter voor elke cellijn worden geoptimaliseerd (zie Discussie).

  1. Breid de cellen uit om te worden geïnfecteerd in volledige groeimedia.
  2. Zaad 24-well platen met 1 x 105 cellen in 0,5 ml volledige groeimedia per put. Zaad een goed voor elke virale vector worden getest (met inbegrip van controles) en omvatten een extra goed dat niet zal worden besmet die zal dienen als een controle voor de selectie van geneesmiddelen in stap 3.7.
  3. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
  4. Infecteer elk goed uit stap 3.2 met een andere virale supernatant van de bevroren arrayed lentivirale supernatant als volgt.
    1. Bereid complete groeimedia voor die 20 μg/mL polybreen bevatten.
    2. Ontdooi de arrayed lentiviral bibliotheek supernatants van Stap 2.7 naar kamertemperatuur.
    3. Vermeer de groeimedia van de 24-putplaten uit Stap 3.2 en voeg onmiddellijk 200 μL polybreenhoudende groeimedia toe aan elk goed.
    4. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 200 μL virale supernatant van elke 96-put van stap 3.4.2 naar de 24 putten uit stap 3.4.3.
  5. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 voor 24 - 48 uur.
    OPMERKING: Sommige cellijnen kunnen langer dan 24 uur nodig hebben om de shRNAs uit te drukken en puromycine resistent te worden. De virale vector die hier wordt gebruikt levert een Turbo-GFP-IRES-puroR met een miR30-gebaseerde shRNA in de 3'UTR van puroR (Figuur 1). Infectie efficiëntie en expressie van de puromycine resistentie gen en de shRNA werden gecontroleerd door groene fluorescerende eiwitten.
  6. Bereid complete groeimedia voor die 2,5 μg/mL puromycine bevatten.
    OPMERKING: De selectieconcentratie van puromycine varieert tussen cellijnen. Het wordt aanbevolen dat een antibioticum doden curve worden uitgevoerd voor elke cellijn te worden tested voorafgaand aan het scherm.
  7. Zuig de media van elke put aan en vervang met 500 μL puromycine-bevattende volledige groeimedia.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u ook puromycine toe te voegen aan een controle niet-geïnfecteerde goed dat kan worden gebruikt in de volgende stappen om ervoor te zorgen dat de puromycine selectie is voltooid.
  8. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
    OPMERKING: Het is het beste om te selecteren voor 48 uur, dus beplating dichtheid en virale titer moet worden geoptimaliseerd, zodat de cellen niet overconfluent vóór 48 uur.
  9. Zorg ervoor dat de geïnfecteerde cellen groen zijn onder de fluorescerende microscoop, en dat cellen op een controle niet-geïnfecteerde goed behandeld met puromycine zijn allemaal dood voordat u doorgaat naar stap 4.

4. Zaaien cellen voor transfection van dual-luciferase verslaggever

OPMERKING: Er moet een testtransfection worden uitgevoerd om de optimale zaaidichtheid voor elke nieuwe cellijn te bepalen.

  1. Trypsinize elk goed uit stap 3.9 en breng ongeveer 1 x 105 cellen in putten op de overeenkomstige positie op de nieuwe 24-well plaat als volgt.
    OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor de screening van bibliotheken met honderden shRNAs, dus het is niet haalbaar om elke put van geïnfecteerde cellen te tellen. Daarom werden de onderstaande stappen gebruikt om celnummers in elke put te schatten om ongeveer dezelfde platingdichtheid te garanderen.
    1. Groepeer de putten van stap 3.9 in 3 - 4 groepen zodanig dat alle putten in een groep een vergelijkbare celdichtheid hebben.
    2. Trypsinize 1 vertegenwoordiger goed van elke groep met 200 μL trypsin-EDTA (1x PBS aangevuld met 0,5 mM EDTA en 0,1% trypsin) voor 5 min bij 37 °C. Neutraliseer vervolgens de trypsine-EDTA door 400 μL puromycine toe te voegen met volledige groeimedia.
    3. Tel elke vertegenwoordiger goed om het totale celnummer te bepalen en verdun de celsuspensie van elke vertegenwoordiger goed tot 2 x 105 cellen/mL van het gebruik van volledige groeimedia.
    4. Zaad 0,5 mL (1 x 105 cellen) van elke put van stap 4.1.3 in de overeenkomstige positie op een nieuwe 24-putplaat en incubeer deze nieuwe 24-well plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
    5. Gebruik voor elke groep uit stap 4.1.1 het totale celnummer dat in stap 4.1.3 is bepaald om het volume van trypsine-EDTA te berekenen dat aan elke put moet worden toegevoegd, zodat de resulterende celsuspensie 1 x 106 cellen/mL bedraagt.
    6. Voeg het juiste volume trypsin-EDTA toe aan elke put en incubeer gedurende 5 min bij 37 °C.
      OPMERKING: Voor groter scherm wordt aanbevolen dat de 24-put platen worden trypsinized en opnieuw geplated in groepen in plaats van allemaal tegelijk om de levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen.
    7. Gebruik tijdens de bovenstaande incubatie een multi-channel pipet om 400 μL puromycine-bevattende volledige groeimedia toe te voegen aan de overeenkomstige putten op een nieuwe 24-well plaat.
    8. Breng 100 μL celsuspensie (ongeveer 1 x 105 cellen) van elke put over naar de overeenkomstige positie op de nieuwe 24-putplaten die in stap 4.1.7 zijn voorbereid.
    9. Herhaal stap 4.1.6 tot en met 4.1.8 voor alle platen van gegroepeerde putten uit stap 4.1.1, één plaat tegelijk.
  2. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.

5. Transfection of dual-luciferase reporter

  1. Transfect elk goed uit Stap 4.2 met de dual-luciferase verslaggever bouwt als volgt.
    OPMERKING: De totale hoeveelheid DNA en de optimale verhouding van firefly luciferase reporter vector te controleren Renilla luciferase vector moet worden bepaald voordat u begint met deze test. Hier, 400 ng van een DNA-mengsel dat 20 delen firefly luciferase verslaggever en 1 deel controle Renilla luciferase bevat werd gebruikt.
    1. Maak het transfection verdunningsmengsel (Buis A) en het verdunningsmengsel van de melder (Buis B) door de aangegeven volumes van elk reagens (tabel 1) te mengen vermenigvuldigd met het totale aantal transfections (plus enkele extra).
      OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor transfection reagens 2 (zie Materiaaltabel). Als een ander transfection reagens wordt gebruikt, moet de transfection vóór deze stap worden geoptimaliseerd.
    2. Meng het transfection verdunningsmengsel (Buis A) met reporter verdunningsmengsel (Buis B) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min om transfetiemengsel te produceren.
    3. Spoel tijdens de bovenstaande incubatie elke 24-put uit stap 4.2 met 0,25 mL fosfaatbufferzout (PBS) en voeg 447 μL complete groeimedia toe aan elke put.
    4. Gebruik na de incubatietijd van 15 min een multi-kanaals pipet om 53 μL transfection mix te verdelen over elke put van de 24-put platen.
  2. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.

6. Kwantificering van dual-luciferase-activiteiten

  1. Meet luciferase activiteit met behulp van een plaatlezer en een dual-luciferase reporter assay kit zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de aangegeven reporter assay kit (zie Tabel van materialen)en volgt het aanbevolen protocol van de fabrikant.
    1. Bereid voldoende 1x passieve lysisbuffer voor alle putten plus enkele extra (75 μL is per put nodig) door 5x passieve lysisbuffer (meegeleverd in kit) 1 tot 5 te verdunnen met gedeïoniseerd water. Ook ontdooireagens A en reagens B Buffer (geleverd in kit, 100 μL van elk is nodig voor elke put).
    2. Aanzuigen de media van elke put van de 24-well plaat van Stap 5.2.
    3. Voeg 75 μL van 1x passieve lysis buffer aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min met af en toe schudden.
    4. Bereid reagens B door 50x reagens B substraat (geleverd in kit) 1:50 te verdunnen met ontdooide reagens B buffer.
    5. Voeg 30 μL van 1x passieve lysisbuffer toe aan 4 putten voor blanking (zie Aanvullende tabel 2).
    6. Breng 30 μL lysaat van stap 6.1.3 over in dubbele putten van een 96-put platte bodem witte testplaat.
    7. Gebruik een multi-channel pipet om 50 μL reagens A aan elke put toe te voegen en lees het firefly luciferase signaal met een plaatlezer.
    8. Gebruik een multi-channel pipet om 50 μL reagens B van stap 6.1.4 aan elke put toe te voegen en lees het Renilla luciferase signaal met een plaatlezer.
  2. Verwerk de ruwe gegevens als volgt (zie Aanvullende tabel 2voor een gedetailleerde beschrijving).
    1. Neem monsters met een zeer laag Renilla luciferase-signaal uit, omdat lage waarden aangeven dat de virale constructie giftig was of dat er te weinig getransfecteerde cellen werden gestoond.
      OPMERKING: Zoals uitgelegd in de discussie, aanzienlijk "lage" Renilla luciferase signaal kan resulteren in afwijkende resultaten. Hier werden putten waarin het Renilla luciferasesignaal meer dan 1 standaarddeviatie onder het gemiddelde was uitgesloten (zie Aanvullende tabel 2). Dit was gebaseerd op eerdere studies uitgevoerd met behulp van dit reporter systeem in deze cellen14,maar kan verschillen in andere cellijnen.
    2. Normaliseer de ruwe vuurvlieg luciferase waarde van elke put aan de ruwe Renilla luciferase waarde van dezelfde put om de firefly /Renilla ratio te verkrijgen.
    3. Gemiddelde de firefly /Renilla ratio's van alle repliceren controle putten en dan verdelen de firefly /Renilla verhouding van elke andere goed door dat aantal om een vouw verandering te krijgen.
    4. Wijs het controlemonster toe en stel defirefly/Renilla ratio waarde in op 1.
    5. Gemiddelde de firefly/Renilla ratio's van de dubbele putten en plot met de standaarddeviatie.
      OPMERKING: De standaarddeviatie wordt niet gebruikt voor statistische analyse, maar als een middel om putten te identificeren waar de replicaties aanzienlijk verschillen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze YAP/TAZ-TEAD reporter construct (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) bevat een minimale SV-49 promotor met 5 herhalingen van het canonieke TEAD binding element (MCAT)15 die het firefly luciferase gen aandrijft ( Figuur1). Het wordt samen met de PRL-TK-controlevector (Promega) in cellen omgezet, die Renilla luciferase uitdrukt van de cons...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie tonen we een aanpak voor medium-throughput screening van arrayed virale bibliotheken in combinatie met een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie reporter test die kan worden gebruikt om te identificeren en testen van nieuwe toezichthouders van transcriptie factoren. Het is van cruciaal belang om het reportersysteem voor elke cellijn voorafgaand aan een scherm te karakteriseren en te optimaliseren. Experimenten moeten worden gedaan om te bevestigen dat de melder reageert op veranderde activiteit van de tr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Emily Norton en Mikaelan Cucciarre-Stuligross bedanken voor hun hulp bij de voorbereiding van shRNA-vectoren. Dit werk werd mede ondersteund door een Susan G. Komen Career Catalyst Grant die werd toegekend aan J.M.L. (#CCR17477184).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plateUSA Scientific1896-2000Voor bacteriële mini-prep
Trypsin - 2.50%Gibco15090-046Component van trypsine-EDTA
96 well flat bottom witte assay plateCorning3922Voor dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EAVoor bacteriële mini-prep
Bacto-tryptone - poederSigma-Aldrich95039Component van LB-bouillon
Dual-luciferase reporter assay systeem, inclusief LAR II reagens (reagens A), Stop & Glo substraat (reagens B substraat) en Stop & Glo buffer (reagens B buffer) - KitPromegaE1960Voor dual-luciferase assay
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium, magnesium en fenol rood - 9.6 g/LHimediaTS1006Voor PBS
EDTA - 0.5 MVWR97061-406Component van trypsine-EDTA
Ethanol - 100%Pharmco-AAPER111000200Voor bacteriële mini-prep
Foetaal runder serum - 100%VWR97068-085Component van volledig groeimedium
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268Voor virusinfectie
HyClone DMEM/Hoge glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; natriumpyruvaatGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component van volledig groeimedium
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesVoor dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mMGibco25030-081Component van volledig groeimedium
Lipofectamine 3000 (Transfectiereagens 2) - 100%Life technologiesL3000008Voor transfecties
Moleculair biologie water - 100%VWR02-0201-0500Voor verdunning van shRNA-vector voor virusverpakking
NaCl - poederBDHBDH9286Component van LB-bouillon
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermo scientificVoor het meten van vector DNA-concentratie
Opti-MEM (Transfectiebuffer) - 100%Gibco31985-062Voor transfecties
Penicilline Streptomycine - 10.000 Eenheid/ml (Penicilline); 10.000 µg/ml (Streptomycine)Gibco15140-122Component van volledig groeimedium
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - KitThermo Fisher ScientificK210010Voor bacteriële mini-prep
Puromycine - 2.5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Voor antibioticum selectie na infectie
TC20 geautomatiseerde celtellerBio-RadVoor celtelling
X-tremeGENE 9 DNA transfectiereagens (Transfectie reagens 1) - 100%Roche6365787001Voor virusverpakking
Gistextract - poederVWRJ850Component van LB-bouillon
P3000 (Transfectie reagens 3) - 100%Life technologiesL3000008Voor transfecties

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519(2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269(2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976(2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles