Ondanks een langdurige interesse in de oorsprong van dierlijke diversiteit, hebben we een beperkt begrip van de genetische veranderingen die ten grondslag liggen aan de evolutie van morfologie, fysiologie en gedrag. De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, is een krachtig model geworden om ons begrip van hoe eigenschappen evolueren, verder te ontwikkelen. Deze vissoort bestaat uit twee morphotypes, een ogen-hebbende rivierbewonende morph (oppervlaktevis) die overvloedig is in rivieren in Mexico en Zuid-Texas, en oogloze grotwoonende morphs (grotvissen) die gedijen in de voortdurend donkere kalksteengrotten in de Sierra del Abra-regio in Noordoost-Mexico1. Er zijn 29 bekende groep populaties die zijn ontstaan uit ten minste twee onafhankelijke invasies van oppervlaktevissen2,3. De grot- en rivier-morphs zijn interfertile gebleven en zijn gemakkelijk te fokken in het laboratorium, waardoor onderzoekers de eigenschappen kunnen genetisch in kaart brengen die evolueren als reactie op de unieke selectiedruk in de grot. Bijvoorbeeld, afwezigheid van licht heeft geleid tot regressie van ogen4,5,6,7,8,9, pigment10,11,12,13,14, en slaap15,16,17,18,19; beperkte voedingsstoffen hebben geselecteerd voor overeten20, gewichtstoename21, en vetopslag22; en navigeren in het donker heeft een verhoogde vermogen om de omgeving te waarnemen bevorderd23,24,25,26,27,28. Een groeiend aantal onderzoekers benut deze vis om de genetische basis van evolutie te onderzoeken. Omdat sommige eigenschappen die adaptief zijn in grotvissen, schadelijk zijn voor mensen, is de grotvis ook aantrekkelijk geworden voor biomedisch onderzoek21,29,30,31. Met het doel om reproduceerbaarheid te bevorderen en een platform te bieden voor nieuwe onderzoekers, biedt deze JoVE-methodencollectie technieken voor huisvesting, eigenschapsmeting en onderzoek van genactiviteit.
Als uitgangspunt dient de in vitro-bevruchtingsprocedure die door Peuß et al.32 wordt gedemonstreerd, meerdere doelen aangezien het een methode biedt om 1) grot/oppervlakte-hybriden te verkrijgen die moeilijk te fokken kunnen zijn, 2) embryo's in één-celstadium voor micro-injecties, en 3) stadia-gematchte monsters voor analyse van embryonale fenotypes. A. mexicanus plant zich typisch 's nachts voort. Peuß et al. beschrijven een systeem om de licht-donkercyclus te veranderen en vissen te verkrijgen die geprimed zijn voor gametenverzameling tijdens normale werkuren. Hun visuele demonstratie van gametenverzameling is bijzonder nuttig aangezien deze stap zorgvuldige techniek vereist. Hun artikel is essentieel voor een aantal downstream-toepassingen, inclusief vergelijking van genexpressiepatronen tijdens embryogenese.
Luc et al.33 bieden een robuust in situ-hybridisatieprotocol geoptimaliseerd voor het visualiseren van genexpressie in A. mexicanus embryo's. Ze vereenvoudigen deze meerdaagse procedure met behulp van een checklist (verstrekt als aanvullend bestand) en delen richtlijnen voor probleemoplossing. Aanvullend aan deze methode, tonen Riddle et al.34 hoe genexpressie en eiwitlokalisatie in uitgekomen vissen te onderzoeken met behulp van geheel-mount immunohistochemie. Om zinvolle vergelijkingen tussen morphotypes na uitkomst en het begin van voeding te maken, is het noodzakelijk om de groeicondities te controleren. Ze laten zien hoe volwassenen te fokken via natuurlijke uitspoeling en larven te kweken bij vaste dichtheden op een rotifer-dieet dat aanzienlijke voordelen heeft in voedingsstofgehalte en kosten in vergelijking met andere voedselbronnen. Hun immunokleuringsprotocol herkent met succes antigenen in de hersenen, darm en pancreas tot 12 dagen na uitkomst, waardoor late stadia van orgaanontwikkeling en -functie kunnen worden onderzocht. Belangrijk is dat ze een lijst met antilichamen verstrekken die met succes zijn gebruikt in A. mexicanus. De gecombineerde methoden van Luc et al. en Riddle et al. zijn nuttig om de effecten van genetische manipulatie te analyseren.
In deze methodencollectie beschrijven Stahl et al.35 meerdere manieren om genfunctie te manipuleren in A. mexicanus inclusief: morpholino-micro-injectie, CRISPR-Cas9-gemedieerde mutagenese, en Tol2-gemedieerde transgenese. Naast het demonstreren van pico-injectie en screening van geïnjecteerde embryo's, bieden ze nuttige richtlijnen voor het ontwerpen van morpholino's, geleide RNA's en transgenen. Ze delen resultaten die elk van deze technieken valideren. Bijvoorbeeld, het targeten van Hypocretine/orexine (HCRT) met behulp van een splicing-blokkerende morpholino vermindert de activiteit van locomotie en verhoo