Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60593

⸱

23 maart 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

In dit artikel

Samenvatting

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Samenvatting

Ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel vereist een nauwkeurige coördinatie van complex cellulair gedrag en interacties. Het gebruik van hoge resolutie in vivo beeldvormingstechnieken kan een duidelijk venster geven op deze processen in het levende organisme. Bijvoorbeeld, delen cellen en hun nakomelingen kan worden gevolgd in real time als het zenuwstelsel vormen. In de afgelopen jaren hebben de technische ontwikkelingen in veelkleurige technieken de soorten vragen die kunnen worden onderzocht, uitgebreid. De multicolor Brainbow aanpak kan worden gebruikt om niet alleen onderscheid te maken tussen zoals cellen, maar ook om kleur-code meerdere verschillende klonen van verwante cellen die elk afkomstig zijn uit een voorloper cel. Dit zorgt voor een multiplex lineage analyse van veel verschillende klonen en hun gedrag tegelijkertijd tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen te visualiseren over real-time binnen het zich ontwikkelende zebravis zenuwstelsel. Dit is vooral handig voor het volgen van cellulaire interacties tussen dergelijke cellen, die moeilijk differentieel te labelen met behulp van traditionele promotor-gedreven kleuren. Onze aanpak kan worden gebruikt voor het bijhouden van afstammingsrelaties tussen meerdere verschillende klonen tegelijk. De grote datasets gegenereerd met behulp van deze techniek bieden rijke informatie die kwantitatief kan worden vergeleken met genetische of farmacologische manipulaties. Uiteindelijk kunnen de gegenereerde resultaten helpen om systematische vragen te beantwoorden over hoe het zenuwstelsel zich ontwikkelt.

Inleiding

In de vroege ontwikkelingsfasen delen poelen van gespecialiseerde voorlopercellen zich herhaaldelijk in proliferative zones, waardoor verschillende arrays van dochtercellen worden geproduceerd. De cellen geboren tijdens deze ontwikkelingsperiode zal dan differentiëren en reizen naar de ontluikende organen te vormen. In het zenuwstelsel, voorouders zoals radiale glia aanleiding geven tot onrijpe neuronen in ventriculaire zones. Als neuronen migreren uit de buurt van ventrikels en volwassen, het uitdijende weefsel vormt uiteindelijk de zeer complexe structuren van de hersenen1,2,3,4,5,6. De coördinatie tussen de verdeling van de voorouders en differentiatie en migratie van neuronen zal de uiteindelijke grootte, vorm en dus functie van de hersenen bepalen, die direct gedragbeïnvloeden 7,8,9,10. Hoewel strakke controle over deze processen duidelijk cruciaal is voor de normale ontwikkeling van de hersenen, zijn de globale mechanismen die deze dynamiek reguleren niet goed begrepen. Hier beschrijven we een hulpmiddel om de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen met een cellulaire resolutie, waardoor onderzoekers voorlopercellen en neuronen in vivo in het zich ontwikkelende zebravisbrein met Brainbow kunnen visualiseren en hun gedrag in de loop van de tijd kunnen volgen via time-lapse confocale microscopie11. De aanpak kan ook worden aangepast om andere delen van het zich ontwikkelende embryo te visualiseren.

Om cellen in het zich ontwikkelende zebravisbrein te observeren en te onderscheiden, hebben we de Brainbow cellabelingtechniek11aangepast. Brainbow maakt gebruik van de willekeurig bepaalde, combinatorische expressie van drie verschillende fluorescerende eiwitten (FPs) om een populatie van cellen te labelen. Terwijl de standaardexpressie voor Brainbow-expressie de rode FP dTomato is, resulteert recombinatie door het enzym Cre recombinase in expressie van mCerulean (cyaan fluorescerend eiwit, GVB) of geel fluorescerend eiwit (YFP)12,13. De gecombineerde hoeveelheid van elke FP uitgedrukt in een cel geeft het een unieke tint, waardoor duidelijk visueel onderscheid van naburige cellen. Bovendien, wanneer een voorloper cel verdeelt, zal elke dochtercel erven de kleur van zijn moedercel, producerenkleurgecodeerde klonen en waardoor onderzoekers celafstamming11,,14traceren . Terwijl oorspronkelijk gebruikt om neuronale circuits bij muizen12te analyseren, is Brainbow sindsdien uitgedrukt in een breed scala van modelorganismen, waaronder zebravis15.

Onze techniek bouwt voort op eerdere multicolor labeling en imaging methoden om direct beeld meerdere kleurgecodeerde klonen na verloop van tijd in levende zebravissen. Vanwege hun optische transparantie als embryo's, zebravissen zijn zeer geschikt voor beeldvorming experimenten16, en eerdere studies hebben brainbow gebruikt in zebravissen om een verscheidenheid van weefsels te bestuderen, met inbegrip van het zenuwstelsel11,15,17,19,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. De mogelijkheid om direct beeld in het levende organisme, samen met hun snelle ex-utero ontwikkeling, maken zebravissen een waardevol model van gewervelde ontwikkeling. In tegenstelling tot de zoogdierhersenen is de gehele proliferative zone van de zebravisachterbrein direct beschikbaar voor beeldvorming zonder verstoring van zijn endogene omgeving6. Hierdoor kunnen experimenten worden uitgevoerd in het levende organisme, in plaats van in vitro of vaste weefselpreparaten. In tegenstelling tot vaste beeldvormingsexperimenten maken in vivo studies een longitudinale ontwerp mogelijk, waardoor uren aan gegevens worden geproduceerd die kunnen worden geanalyseerd op patronen, waardoor de kans op het waarnemen van relatief zeldzame gebeurtenissen toeneemt. Afhankelijk van de snelheid en lengte van de gebeurtenissen van belang, onderzoekers kunnen ervoor kiezen om korte (1-2 uur) of lange (tot ~ 16 uur) time-lapse imaging experimenten uit te voeren. Door het gebruik van de zebrafish heat shock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow expressie kan tijdelijk worden gecontroleerd28,29. Bovendien, de mozaïek uitdrukking geïnduceerd door deze promotor is zeer geschikt voor etikettering en het bijhouden van vele klonen11.

De mogelijkheid om visueel te identificeren meerdere klonen in de levende hersenen is een voordeel van deze methode. Belangrijke eerdere studies die de rol van klonen binnen de ontwikkeling van het zenuwstelsel onderzocht gebruikt retrovirale vectoren om een enkele voorloper cel en zijn nakomelingen label met behulp van een enkele FP of andere gemakkelijk gevisualiseerde eiwitten. Een dergelijke etikettering stelt onderzoekers in staat om in de loop van de tijd één kloon te observeren, hetzij in vitro , hetzij in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. In tegenstelling tot methoden om het gedrag van cellen in één kloon te volgen, stellen de verschillende kleuren van Brainbow onderzoekers in staat om dynamiek onder klonen te observeren. Bovendien, door brainbow te gebruiken om vele klonen binnen de hersenen te etiketteren, worden de extra gegevens over clonal gedrag verzameld met betrekking tot technieken die één enkele kloonetiket1. Belangrijk is dat de hier beschreven benaderingen kunnen worden uitgebreid om ontwikkelingsvergelijkingen te genereren tussen vissen die verschillende genetische of farmacologische manipulaties hebben ondergaan18. Over het algemeen maken deze voordelen time-lapse in vivo confocale beeldvorming van Brainbow-uitdrukkende zebravissen ideaal voor onderzoekers die de ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel onderzoeken, met name diegenen die geïnteresseerd zijn in de rol van klonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Het Lewis & Clark College.

1. Micro-injectie van zebravisembryo's

  1. Zet wilde type, volwassen zebravissen in geslacht gescheiden paring tanks de middag voorafgaand aan het uitvoeren van micro-injecties39,40.
  2. Bereid de DNA-oplossing voor in de ochtend van de micro-injecties. Verdun hsp:Zebrabow11 plasmide DNA tot een concentratie van ~10 ng/μL in 0,1 mM KCl, samen met 2,5% fenolrood en 3,75 U Cre recombinase enzym.
  3. Voer micro-injecties van DNA-oplossing uit in eencellige zebravisembryo's binnen 45 min van bevruchting39,41. Injecteer ongeveer 4,2 nL van deze oplossing in elk embryo, gelijk aan ~42 pg plasmilaat-DNA.
    LET OP: De micro-injectie stap kan worden weggelaten als een transgene, Brainbow-expressing zebrafish lijn in plaats daarvan wordt gedekt, zoals Tg (ubi:Zebrabow)15 en Tg (neurod: Zebrabow)18. Het uitvoeren van micro-injecties kan voordelig zijn omdat het onderzoekers in staat stelt om het kopieernummer en de etiketteringsdichtheid te titreren. Bovendien kan een tweede DNA-constructie die een specifiek genproduct tagt of manipuleert, indien gewenst naast Brainbow worden geïnjecteerd (bijvoorbeeld een veelrood fluorescerend eiwit dat brainbow18aanvult).
  4. Bewaar geïnjecteerde embryo's in petrischaaltjes van E3 medium39 in een 28 °C incubator gedurende 24 uur.

2. Hitteschok om Brainbow Expression te induceren

LET OP: Als het plasmide DNA geïnjecteerd of het transgene uitgedrukt maakt geen gebruik van de hsp70 promotor om de expressie te rijden, de hitte schok stap kan worden overgeslagen, en gezonde embryo's moeten onmiddellijk worden overgedragen aan fenylthiourea (PTU) op 24 uur na bevruchting (hpf).

  1. Bij 24 pkf, ruim dode en misvormde embryo's uit de groep geïnjecteerde embryo's. Breng vervolgens de gezonde embryo's over naar een buis van 50 mL, met maximaal 20 embryo's/buis.
  2. Vul de buizen met 10 mL E3. Plaats een dop op de top van elke buis, maar niet goed sluiten.
  3. Plaats het buisrek met de 50 mL buizen rechtop in een waterbad van 37 °C. Zorg ervoor dat het waterniveau in het bad hoger is dan het niveau van de E3 in de buizen en laat ze 80 tot 90 min.
  4. Haal het smeerrek met de embryo's uit het waterbad en keer rechtop terug naar de couveuse van 28 °C. Laat de E3 tot 1 uur afkoelen en de embryo's komen geleidelijk aan aan de temperatuur. Breng vervolgens de embryo's over naar petrischalen van 0,2 mM PTU in E3 opgewarmd in de couveuse om pigmentatie van embryo's te voorkomen.
    LET OP: PTU is een giftige chemische stof die met zorg moet worden behandeld en op de juiste manier moet worden verwijderd. Het dragen van handschoenen wordt voorgesteld.

3. Screening Embryo's voor Brainbow Expression

  1. Onderzoek de embryo's na de hitteshock om 2 tot 4 uur na de hitteshock onder een standaard fluorescentiedissectiemicroscoop voor expressie van GVB of YFP, wat duidt op een succesvolle Brainbow-recombinatie (uit standaardexpressie van dTomato).
    LET OP: Als er meerdere fluorescentiefilteropties beschikbaar zijn, is screening op GVB de meest efficiënte manier om goed gehercombineerde vissen te identificeren. Als GVB- en YFP-filters niet beschikbaar zijn, kan YFP ook slecht worden gevisualiseerd onder groene fluorescerende eiwitfilters (GFP) vanwege de overlap in hun spectrale profielen.
  2. Selecteer embryo's met robuuste FP-expressie en breng over op een apart gerecht met PTU. Afbeelding embryo's op 1 dag na de bevruchting (dpf; 28 hpf of later) of onderhouden van embryo's in PTU en beeld op 2 of 3 dpf.

4. Embryo's monteren voor in vivo beeldvorming

  1. Bereid voorafgaand aan de dag van het experiment de beeldkamer en het embryomanipulatie-gereedschap voor.
    1. Bereid de beeldkamer voor door een kunststof ring voorzichtig te superlijmen in het midden van een petrischaal van 60 mm.
    2. Bereid eventueel een op maat gemaakte embryomanipulator voor om embryo's in de schotel te verplaatsen en embryo's te oriënteren tijdens het monteren. Bouw de manipulator door supergluing een kleine lengte van nylon vislijn (~ 1 / 2 in, ~ 6 pond) aan het einde van een houten wattenstaafje stok die is gesneden tot een ~ 4 in lengte.
  2. Indien nodig (d.w.z. beeldvorming bij 2 dpf of eerder), alvorens de embryo's te dechorionaat met behulp van spuiten onder een dissectiemicroscoop te monteren.
  3. Verdoven zezebravissen embryo's.
    1. Vul een 60 mm petrischaal halverwege met E3 en voeg 5-6 druppels van 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S toe aan een uiteindelijke concentratie van ~0,2 mM. Wervel om te mengen.
      LET OP: Tricaine moet met zorg worden behandeld en op de juiste manier worden verwijderd.
    2. Breng embryo's van de PTU over naar de tricaine-oplossing, zodat er zo min mogelijk PTU wordt overgedragen. Terwijl visreflexen na 1-2 min moeten ophouden, laat de embryo's in tricaine voor maximaal 10 min om een grondige verdoving voor time-lapse imaging experimenten te garanderen.
    3. Bevestig dat de embryo's goed verdoofd zijn. Beoordeel de schrikreflex door de embryostaarten voorzichtig aan te raken met de embryomanipulator. Als een reflexbeweging wordt waargenomen, voeg een extra druppel tricaine aan de schotel zo ver mogelijk van de embryo's mogelijk en wervelen om te mengen. Let op de embryohartslag onder een dissectiebereik. Als het abnormaal traag is, voeg extra druppels E3 toe aan de schotel om de tricaineconcentratie te verminderen.
  4. Zet verdoofde embryo's in agarose.
    1. Breng de vis naar het midden van de plastic ring in de beeldkamer en verwijder zoveel mogelijk overtollige E3 met behulp van een fijn-getipte overdracht pipet.
    2. Bedek met een schone overdrachtpipet de vis met 1,0% laagsmelte agarose (LMA) in E3, opgeslagen bij 42 °C en vul de hele plastic ring met een dun laagje agarose. Gebruik een transfer pipet om voorzichtig trek de embryo's in de pipet tip en terug in de agarose zonder de invoering van luchtbellen.
    3. Voordat de agarose verhardt, gebruik snel een embryo manipulator om de vis op de juiste manier te oriënteren. Als beeldvorming met een rechtopstaande microscoop, plaats de embryo's zo dicht mogelijk bij het bovenste oppervlak van de agarose mogelijk. Plaats de embryo's parallel aan de bodem van de beeldkamer met de staart recht.
      LET OP: Voor beeldvorming in de achterhersenen kunnen de embryo's in een dorsale of sagittale weergave worden geplaatst. Zorg ervoor dat ervoor wordt gezorgd dat de hoofden van de embryo's niet zinken terwijl de agarose nog vloeibaar is. Andere oriëntaties kunnen geschikt zijn om andere zich ontwikkelende weefsels voor beeldvorming te richten. Voor omgekeerde microscopen, montage zou anders worden gedaan, meestal positionering van de vis dicht bij de bodem van een glazen bodem Petri schaal.
  5. Wacht tot de agarose uithardt en vul de beeldkamer met E3. Voeg zoveel Mogelijk E3 toe om rekening te houden met de verdamping in de loop van de beeldvorming.

5. Time-lapse Confocalimaging of Developing Zebrafish Hindbrain

  1. Plaats de beeldkamer op de confocale microscoop ter voorbereiding van de beeldvorming.
    1. Plaats de beeldkamer met de vis en E3 op de confocale microscoop.
    2. Selecteer een doelstelling met een hoog numeriek diafragma en een lange werkafstand, zoals een doelstelling van 20x wateronderdompeling (1.0 NA).
    3. Zoek een regio met de juiste dichte en heldere etikettering van het celtype(s) van belang.
      LET OP: Een temperatuurgestuurd stadium/apparaat op de microscoop kan ook worden gebruikt om temperatuur en vochtigheid te regelen tijdens lange beeldvormingssessies. Dit kan de verdamping verminderen.
  2. Stel de acquisitieparameters in voor Brainbow imaging.
    1. Beeld elk FP-kanaal opeenvolgend. Bij gebruik van een commerciële software (bijvoorbeeld Zen-software), wordt dit gedaan door het voorbereiden van drie "tracks". Gebruik een Argon-laser om GVB op te wekken bij 458 nm en YFP op 514 nm. Gebruik een DPSS 561 nm laser om dTomato op te winden. Verzamel emissies tussen 463-509 nm voor GVB, 519-555 nm voor YFP en 566-691 nm voor dTomato.
    2. Voor het scherm display, code GVB zo blauw, YFP als geel, en dTomato als rood.
      LET OP: Deze instellingen variëren afhankelijk van welke laserlijnen en andere functies beschikbaar zijn op de confocale microscoop. Om de snelheid van beeldvorming te verhogen, kunnen GVB- en dTomato-kanalen tegelijkertijd worden weergegeven zonder merkbare bleed-through. Als er ook een aparte FP wordt afgebeeld, zoals een veelrode FP, kan dit achtereenvolgens of gelijktijdig met YFP worden weergegeven.
    3. Stel de algemene beeldparameters in om 16-bits afbeeldingen te maken met een resolutie van ten minste 1024 x 1024 en gemiddeld twee keer. Pas de zoom aan afhankelijk van het gebied en het celtype van de rente (d.w.z. voor hindbrain-beeldvorming met een doelstelling van 20x zal de zoom variëren van 1,0-2,5). Maximaliseer het gezichtsveld om de groei van de vis in de loop van de tijd mogelijk te maken.
    4. Het bekijken van een track tegelijk (en het uitschakelen van andere lasers om fotobleekte te voorkomen), het optimaliseren van de acquisitie-instellingen voor elke FP individueel (bijvoorbeeld, laserkracht, pinhole grootte, photomultiplier buis te krijgen, enz.).
    5. Selecteer Z-stackbereik op afbeelding.
      LET OP: Houd er bij lange imagingsessies (>2 h) rekening mee dat de vis in de loop van de beeldvorming zal blijven groeien, dus zowel het XY-veld als het Z-stack-assortiment moeten dit met extra ruimte in de weg staan. Als beeldvorming van de achterhersenen, ruimte in het veld voor het weefsel te bewegen rostrally tijdens de beeldvorming periode. Er moet ook ruimte worden opgenomen voor groei in de Z-dimensie. Neem in de afbeelding ongeveer 10-20 μm boven het gebied van belang, of de vis is gepositioneerd voor sagittale of dorsale weergave.
  3. Stel parameters in voor time-lapse imaging.
    1. Selecteer een tijdsinterval. Intervallengte varieert tussen 10-30 min om mitotische en apoptotische gebeurtenissen in de zich ontwikkelende achterhersenen te volgen. Intervallengte is afhankelijk van de snelheid van de gebeurtenissen van belang en de totale tijd die nodig is om een enkele Z-stack vast te leggen.
    2. Selecteer de lengte van de beeldvormingssessie. Time-lapse imaging sessies komen over het algemeen 's nachts voor en kunnen minstens 16 uur duren.
  4. Voer het experiment uit.
    OPMERKING:     De vis kan onmiddellijk na beeldvorming worden geëuthanaseerd of zorgvuldig worden ontleed uit de agarose met behulp van spuiten en teruggestuurd naar E3 om te herstellen. Teruggewonnen vis kan dan opnieuw worden afgebeeld op een later tijdstip, hoewel de celpositie en diepte in deze periode zullen verschuiven als gevolg van de algehele groei.

6. Time-lapse Bestandsbeheer

  1. Importeer het afbeeldingsbestand in de analysesoftware.
    1. Als u Zen-software gebruikt, slaat u het bestand op in de CZI-indeling zodra de afbeeldingsacquisitie is voltooid. Zorg ervoor dat u ruwe gegevens opslaat in een indeling die compatibel is met Fiji42 en/of andere software.
    2. Importeren in Fiji-software met behulp van BioFormats Importer.
      LET OP: Time-lapse-bestanden zullen groot zijn en kunnen aanzienlijke hoeveelheden tijd en geheugen nodig hebben om te openen voor analyse. Het is dus nuttig om strategisch te zijn in hoe ze worden opgeslagen en geopend. Het kan handig zijn om een versie van lagere kwaliteit op te slaan die gemakkelijker kan worden geopend om te zoeken naar gebeurtenissen die van belang zijn voor het oog.
  2. Als u Fiji gebruikt, maakt u kleinere, beter beheerbare subsets van time-lapse-bestanden. Deelverzamelingen genereren, bijvoorbeeld door de volledige Z-stack op het eerste tijdspunt te bekijken) of door diepte (bijvoorbeeld de eerste 50 Z-secties op elk tijdstip weer te geven) door op Afbeeldingte klikken | Stapels| Instrumenten| Substack maken.

7. Kwantitatieve kloonkleuranalyse van Brainbow Images

  1. Meet de gemiddelde rode, groene en blauwe (RGB) intensiteitswaarden voor de cellen van belang in Fiji.
    OPMERKING:     Deze instructies zijn specifiek voor beeldanalyse in Fiji. Echter, onderzoekers kunnen de voorkeur aan gemiddelde RGB intensiteit waarden te verkrijgen in een alternatief softwareprogramma.
    1. Zorg ervoor dat het bestand correct is bijgesneden, zodat er geen zwarte ruimte is rond de randen van de afbeelding. De zwarte ruimte zal kunstmatig de minimale intensiteitsmetingen verlagen die voor de analyse nodig zijn. Als het bestand moet worden bijgesneden, selecteert u de knop Rechthoekselectie en tekent u een interessegebied (ROI) rond het gezichtsveld, met uitzondering van alle zwarte ruimte. Klik op Afbeelding| Gewas.
    2. Stel het meetgereedschap in om gemiddelde, minimale en maximale metingen met de grijze waarde te nemen. Klik op Analyseren| Stel metingen in. Controleer of de selectievakjes voor Min en Max Grijswaarde en Gemiddelde grijswaarde zijn geselecteerd.
    3. Als u de ruwe gegevensbestanden of subsetted Z-stacks in Fiji bekijkt, worden cellen gevonden die van belang zijn voor kloonkleuranalyse. In de achterhersenen kunnen vermeende klonen visueel worden geïdentificeerd door hun gedeelde tint en hun radiale oriëntatie. Selecteer geen cellen die in nauw contact staan met, en dus moeilijk op te lossen van, naburige cellen van een andere kleur. Het kan moeilijk zijn om hun tint te kwantificeren.
    4. Zoek het midden Z-vlak van de cel van belang met behulp van de Z-scrollbar. Klik met de rechtermuisknop op de knop Ovaal selecteren en selecteer de knop Elliptische selectie. Andere selectietools zijn geschikt voor verschillende celtypen. Teken een elliptische ROI rond de centrale ~ 2 / 3 van de cel lichaam.
    5. Selecteer met de C-scrollbarhet rode (dTomato)-kanaal. Neem de gemiddelde intensiteitsmeting voor dit kanaal door Analyserente selecteren | Maatregel. Herhaal dit met dezelfde ROI en het brandpuntsvlak voor de groene (YFP) en blauwe (GVB) kanalen en sla alle gemiddelde intensiteitswaarden op.
    6. Klik ergens op de afbeelding om de elliptische ROI in de cel van belang te verwijderen.
    7. Als u achtergrondniveaus voor normalisatie wilt meten, gebruikt u de C-scrollbar en selecteert u het rode kanaal (dTomato). Neem de minimale intensiteitsmeting voor het hele veld in dit kanaal door Analyserente selecteren | Maatregel. Herhaal dit met hetzelfde brandpuntsvlak voor de groene (YFP) en blauwe (GVB) kanalen en sla alle minimumintensiteitswaarden op.
  2. Bereken relatieve RGB-kanaalgewichten voor de cellen van belang.
    OPMERKING:     De berekening van relatieve RGB-kanaalgewichten op basis van deze intensiteitswaarden kan worden uitgevoerd in verschillende softwareprogramma's, zoals Microsoft Excel of R43.
    1. Normaliseer de gemiddelde intensiteitsmeting van de cel-ROI voor elk kanaal door de minimale intensiteit af te trekken van het hele veld in dat kanaal en het brandpuntsvlak.
    2. Som de genormaliseerde gemiddelde RGB-intensiteitswaarden van elk kanaal op om de totale genormaliseerde RGB-intensiteit voor de cel te vinden.
    3. Bereken het relatieve kanaalgewicht voor elk kanaal door de genormaliseerde gemiddelde intensiteitswaarde voor dat kanaal te delen door de totale genormaliseerde RGB-intensiteit.
  3. Geef relatieve RGB-kanaalgewichten weer als ternaire plots met behulp van het Ternaire-pakket voor R43,44. Ternaire plots zijn handig om de clustering van vergelijkbare kleuren in 3D RGB-ruimte te visualiseren.
  4. Bereken de kleurspreidingscoëfficiënt om het verschil tussen celkleuren te kwantificeren.
    1. Bereken de Euclidische afstand tussen de twee kleuren in 3D RGB-ruimte met de volgende vergelijking:
      figure-protocol-1
      waarbij R, G en B de relatieve RGB-kanaalgewichten zijn, berekend in punt 7.2.
    2. Voor het gemak van begrip, normaliseren van de kleur afstand door te delen door √2, de maximaal mogelijke afstand tussen kleuren, om een kleur spreiding coëfficiënt tussen 0 en 1 te verkrijgen, waar 0 geeft precies dezelfde kleur en 1 geeft volledig verschillende kleuren (bijvoorbeeld, puur rood en puur blauw).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze sectie illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de in vivo multicolor time-lapse imaging aanpak die hier wordt beschreven. We tonen aan dat Brainbow kleurgecodeerde klonen van cellen in de proliferative venricular zone van de zich ontwikkelende zebravis achterhersenhelft14 (Figuur 1).

Typisch, toen Brainbow-gelabelde cellen werden gerangschikt langs een bepaalde radiale vezel, ze deelden dezelfd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode om klonen van voorlopercellen en neuronen in de zich ontwikkelende zebravis achterhersens te visualiseren en ze in vivo te volgen met behulp van Brainbow en time-lapse confocale microscopie11. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met in vitro of ex vivo studies is de mogelijkheid om de proliferative zone van de gewervelde hersenen in zijn natuurlijke omgeving in de loop van de tijd direct te observeren. Deze techniek bouwt voort op eerdere studies...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Y. A. Pan, J. Livet en Z. Tobias voor technische en intellectuele bijdragen. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (Award 1553764) en de M.J. Murdock Charitable Trust.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL transfer pipette (fine tip)Globe Scientific, Inc.134020
1-phenyl-2-thioureum (PTU)Alfa AesarL06690Verdund tot 0.2 mM in E3 om embryo pigmentatie te voorkomen
50 mL conische buisjesCorning352070Voor het verhitten van embryo's
6 lb nylon vislijnSecureLineNMT250Voor het maken van embryo manipulators
7.5 mL transfer pijpGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881Voor E3
WattenstaafjesPuritan867-WC NO GLUEVoor het maken van embryo manipulators
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
Digitale droge badGenemate490016-616Gebaten om LMA te bewaren bij 42 °C
Epifluorescentie dissectiescoop
Glazen capillaire buisjesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
IncubatorForma Scientific3158Om embryo's te bewaren bij 28 °C
Injectieplaat mallenAdaptive Science ToolsTU-1
Isotemp waterbadFisher Scientific2320Voor het verhitten van embryo's
KClAMRESCO0395Voor E3 en voor DNA oplossing voor injecties
Laser-scanning confocale microscoopZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120Om agarose injectie platen te maken
Low-melt agarose (LMA)AMRESCOJ234
ParingstanksAquaneering, Inc.ZHCT100
MethyleenblauwSigmaM9140Voor E3
MgSO4Sigma9397Voor E3
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
MicropijptrekmachineSutter Instrument Co.P-97
MS-222 Tricaine-SWestern Chemical, Inc.Stock gemaakt op 4 mg/mL in omgekeerde osmose (RO) water, dan druppelsgewijs toegevoegd aan E3 tot een eindconcentratie van 0.2 mM om embryo's te anesthetiseren
NaClJ.T. Baker4058-01Voor E3
Petrischalen (90 mm, 60 mm)Genesee Scientific32-107GOm embryo's te huisvesten en een beeldvormingskamer te creëren (60 mm)
Fenol roodSigmaP0290
Zachte stikringmarkeringenClover Needlecraft, Inc.354Voor het creëren van een beeldvormingskamer met Petrischaal
Superlijm (Ultra gel control)Loctite1363589Voor het maken van embryo manipulators
SpuitnaaldenBeckton DickinsonBD329412Voor het dechorioneren van embryo's

Referenties

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3(2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120(2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53(2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115(2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635(2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239(1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Brainbow-imagingzenuwstelsel van zebravissenneurale progenitorcellenclonale lineage-analysemulticolor fluorescentiein vivo imagingtracking van celdelingdetectie van apoptoseinterkinetische nucleusmigratie
Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.