Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Summary

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Abstract

Ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel vereist een nauwkeurige coördinatie van complex cellulair gedrag en interacties. Het gebruik van hoge resolutie in vivo beeldvormingstechnieken kan een duidelijk venster geven op deze processen in het levende organisme. Bijvoorbeeld, delen cellen en hun nakomelingen kan worden gevolgd in real time als het zenuwstelsel vormen. In de afgelopen jaren hebben de technische ontwikkelingen in veelkleurige technieken de soorten vragen die kunnen worden onderzocht, uitgebreid. De multicolor Brainbow aanpak kan worden gebruikt om niet alleen onderscheid te maken tussen zoals cellen, maar ook om kleur-code meerdere verschillende klonen van verwante cellen die elk afkomstig zijn uit een voorloper cel. Dit zorgt voor een multiplex lineage analyse van veel verschillende klonen en hun gedrag tegelijkertijd tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen te visualiseren over real-time binnen het zich ontwikkelende zebravis zenuwstelsel. Dit is vooral handig voor het volgen van cellulaire interacties tussen dergelijke cellen, die moeilijk differentieel te labelen met behulp van traditionele promotor-gedreven kleuren. Onze aanpak kan worden gebruikt voor het bijhouden van afstammingsrelaties tussen meerdere verschillende klonen tegelijk. De grote datasets gegenereerd met behulp van deze techniek bieden rijke informatie die kwantitatief kan worden vergeleken met genetische of farmacologische manipulaties. Uiteindelijk kunnen de gegenereerde resultaten helpen om systematische vragen te beantwoorden over hoe het zenuwstelsel zich ontwikkelt.

Introduction

In de vroege ontwikkelingsfasen delen poelen van gespecialiseerde voorlopercellen zich herhaaldelijk in proliferative zones, waardoor verschillende arrays van dochtercellen worden geproduceerd. De cellen geboren tijdens deze ontwikkelingsperiode zal dan differentiëren en reizen naar de ontluikende organen te vormen. In het zenuwstelsel, voorouders zoals radiale glia aanleiding geven tot onrijpe neuronen in ventriculaire zones. Als neuronen migreren uit de buurt van ventrikels en volwassen, het uitdijende weefsel vormt uiteindelijk de zeer complexe structuren van de hersenen^1,2,3

Protocol

Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Het Lewis & Clark College.

1. Micro-injectie van zebravisembryo's

1. Zet wilde type, volwassen zebravissen in geslacht gescheiden paring tanks de middag voorafgaand aan het uitvoeren van micro-injecties^39,40.
2. Bereid de DNA-oplossing voor in de ochtend van de micro-injecties. Verdun hsp:Zebrabow¹¹ plasmide DNA tot een concentratie van ~10 ng/μL in 0,1 mM KCl, samen met 2,5% fenolrood en 3,75 U Cre recombinase enzym.

Results

Deze sectie illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de in vivo multicolor time-lapse imaging aanpak die hier wordt beschreven. We tonen aan dat Brainbow kleurgecodeerde klonen van cellen in de proliferative venricular zone van de zich ontwikkelende zebravis achterhersenhelft¹⁴ (Figuur 1).

Typisch, toen Brainbow-gelabelde cellen werden gerangschikt langs een bepaalde radiale vezel, ze deelden dezelfd.......

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode om klonen van voorlopercellen en neuronen in de zich ontwikkelende zebravis achterhersens te visualiseren en ze in vivo te volgen met behulp van Brainbow en time-lapse confocale microscopie¹¹. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met in vitro of ex vivo studies is de mogelijkheid om de proliferative zone van de gewervelde hersenen in zijn natuurlijke omgeving in de loop van de tijd direct te observeren. Deze techniek bouwt voort op eerdere studies.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes	Corning	352070	For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line	SecureLine	NMT250	For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	For E3
Cotton swabs	Puritan	867-WC NO GLUE	For making embryo manipulators
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Digital dry bath	Genemate	490016-616	Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubator	Forma Scientific	3158	To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp water bath	Fisher Scientific	2320	For heat shocking embryos
KCl	AMRESCO	0395	For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Mating tanks	Aquaneering, Inc.	ZHCT100
Methylene blue	Sigma	M9140	For E3
MgSO4	Sigma	9397	For E3
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl	J.T. Baker	4058-01	For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red	Sigma	P0290
Soft stitch ring markers	Clover Needlecraft, Inc.	354	For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)	Loctite	1363589	For making embryo manipulators
Syringe needles	Beckton Dickinson	BD329412	For dechorionating embryos