Monitoring PD-1-Blocking Antilichamen gebonden aan T-cellen afgeleid van een druppel perifeer bloed

Samenvatting

We ontwikkelden een eenvoudige flow cytometrie test voor de evaluatie van de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen, waarbij slechts een druppel perifeer bloed van kankerpatiënten.

Samenvatting

Immuun checkpoint remmers, waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, hebben aanzienlijk verbeterd behandeling resultaten in verschillende vormen van kanker. De farmacologische werkzaamheid van deze immunotherapieën is langdurig en strekt zich zelfs uit tot na de stopzetting van hun injecties, als gevolg van aanhoudende bloedconcentraties. Hier ontwikkelden we een eenvoudige flow cytometrie test om de T-cel binding status van de PD-1-blokkerende antilichamen nivolumab en pembrolizumab te evalueren. Net als een glucosetest, vereist deze test slechts een druppel perifeer bloed. Het visualiseren van antilichaambinding op T-cellen is betrouwbaarder dan het meten van de concentraties van antilichamen. Bovendien, indien nodig, kunnen we potentieel analyseren veel onderscheidende immuun-gerelateerde markers op T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Dit is dus een eenvoudige en minimaal invasieve strategie om het farmacologische effect van PD-1-blokkerende antilichamen bij kankerpatiënten te analyseren.

Inleiding

PD-1-blokkerende antilichamen zijn de standaardkeuze geworden voor de behandeling van verschillende vormen van kanker, waaronder niet-kleincellige longkanker (NSCLC)^1,2,3,4. Ze vertonen een opmerkelijk therapeutisch effect bij een subgroep van kankerpatiënten die niet hebben gereageerd op conventionele cytotoxische chemotherapieën. Immuuncontroleremmers (II's), waaronder PD-1-blokkerende antilichamen, kunnen echter een uniek en duidelijk spectrum van bijwerkingen veroorzaken, zogenaamde immuungerelateerde bijwerkingen (irA's)⁵. Hoewel irAE's bijna alle weefsels kunnen beïnvloeden, worden ze meestal waargenomen in het maag-darmkanaal, endocriene klieren, huid en lever, en ze kunnen preutse, huiduitslag, misselijkheid, diarree en schildklieraandoeningen^{veroorzaken 6,7}. In het algemeen verschijnen de meeste ira's binnen 1 tot 2 maanden na de opening van is-i's. In sommige gevallen kunnen ze echter later dan 1 jaar na het begin van de behandeling of zelfs na stopzetting van de behandeling^6,7. Ze veroorzaken ook verschillende symptomen die moeilijk te discrimineren kunnen zijn van andere pathologieën. Het kan dus een uitdaging zijn om irAE's snel te diagnosticeren en op de juiste manier te behandelen. irAE's kunnen invloed hebben op alle weefsels, en hun begin wordt sterk beïnvloed door circulerende immuuncellen, met name T-cellen gebonden aan PD-1-blokkerende antilichamen. Daarom is een eenvoudige en minimaal invasieve methode om antilichaamgerichte T-cellen te controleren belangrijk in klinische omgevingen.

Hier ontwikkelden we een eenvoudige methode om de binding van PD-1-blokkerende antilichamen tegen T-cellen te beoordelen met behulp van een druppel perifeer volbloed van kankerpatiënten die nivolumab of pembrolizumab kregen. Met behulp van deze aanpak konden we elk van de volgende monitoren: 1) de duur van antilichaambinding aan T-cellen, 2) de bezetting van T-cel PD-1 moleculen door therapeutische antilichamen, en 3) de activeringsstatus en immunologische kenmerken van T-cellen. Deze methode is een wijziging van een eerder gerapporteerde techniek⁸. De benodigde hoeveelheid bloed is bijna gelijk aan die nodig is voor een glucosetest, en de aanpak vereist geen mononucleaire celverrijking of co-culturing met PD-1-blokkerende antilichamen. We hebben bevestigd dat deze methode ook kan worden uitgevoerd met behulp van bevroren monsters, waaronder perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) en cellen uit pleurale effusie, pericardiale effusie, bronchoalveolar lavage vloeistof, en hersenvocht, wat suggereert dat deze strategie nuttig kan zijn in de context van een multicenter studie. Deze methode kan de vroege diagnose van irAE's vergemakkelijken en ook helpen bij het bepalen van de juiste immunosuppressieve behandelingen om hun symptomen onder controle te houden en de optimale tijden te identificeren om latere therapieën na PD-1-remmers te starten.

Protocol

De bemonstering werd uitgevoerd tijdens routineklinische procedures. Alle menselijke monsters werden verkregen nadat geïnformeerde toestemming werd verstrekt door de proefpersonen, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en met de goedkeuring van de ethische toetsingscommissie van de Graduate School of Medicine, Osaka University, Japan (15383 en 752).

1. Volkoren monster voorbereiding en kleuring

1. Verzamel bloedmonsters in bloedafnamebuizen met ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA).
   OPMERKING: Bloedafname kan worden uitgevoerd met behulp van een gewone naald of een bloedlancet.
2. Breng 20 μL volbloedmonsters over naar 5 mL round-bottom polystyreenstroomcytometriebuizen.
   OPMERKING: Om de niet-specifieke binding van cellen aan buizen te verminderen, wordt 1 mL van 2% foetaal runderserum (FBS) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toegevoegd in buizen en gedurende 10 s vortexed voordat ze op monsters worden aangebracht.
3. Voeg 20 μL van 2% FBS toe aan PBS.
4. Voeg 10 μL menselijk-specifieke FcR-blokkeringsreatoeër toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
5. Voeg 500 μL rode bloedcellysebuffer toe. Meng goed en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
6. Voeg 4 mL van 2% FBS toe in PBS en draai cellen bij 400 x g (1.500 tpm) voor 5 min bij 4 °C. Verwijder supernatant door aspiratie.
7. Herhaal het was- en aspiratieproces beschreven in stap 1.6.
8. Cellen opnieuw opschorten in 100 μL van 2% FBS in PBS en verdelen in twee buizen van elk 50 μL.
9. Voeg antilichamen van oppervlaktemarkeringtoe(tabel 1 )toe . Meng goed en incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
   OPMERKING: Bij het profileren van de T-cel immuunstatus, kan het aantal markers worden verhoogd op basis van de stroom cytometrie machine kwaliteit.
10. Was monsters 2x zoals beschreven in stap 1.6.
11. Cellen opnieuw opschorten in 200 μL van 2% FBS in PBS.

2. Flow Cytometrische Analyse

1. Steek buizen in de flow cytometer en verwerven cellen, in principe volgens het aanbevolen protocol⁹.
2. Noteer 10.000 gebeurtenissen als de lymfocytenpoort (figuur 1A) en exportstroomgegevens als .fcs-bestanden voor analyse.
3. Open bestanden in de analysesoftware. Visualiseer de cellen op een voorwaartse verstrooiing (FSC) (A) versus zijverstrooiing (SSC) (A) plot en poortlymfocyten(figuur 1A).
4. Nadat u afzonderlijke cellen hebt geselecteerd met FSC (H) vs. FSC (W) en SSC (H) vs. SSC (W)(figuur 1B) en deze hebt weergegeven op een CD3 vs. CD8 of CD3 vs. CD4-plot, wordt de CD8 T-cellen en CD4 T-cellen(figuur 1C)gepoort.
5. Nadat u de gated cells hebt geselecteerd en ze hebt weergegeven op een PD-1 vs. menselijke IgG4-plot, identificeert u PD-1-blokkerende antilichaamgebonden CD8- en CD4 T-cellen op basis van isotypebesturing(figuur 1D).

Resultaten

De gating strategie en flow cytometrie analyse (Figuur 1) kan detecteren PD-1-blokkerenantilichaam binding aan T-cellen verkregen uit een daling van NSCLC patiënt perifere bloed. Voordat PD-1-blokkerende antilichaam wordt toegediend, zijn er geen menselijke IgG4-positieve CD8- of CD4 T-cellen aanwezig en kan PD-1-expressie worden bevestigd door een PD-1-detectieantilichaam (EH12.1) (figuur 2A). Na nivolumab of pembrolizumab toediening kan IgG4 (...

Discussie

In dit artikel rapporteren we een methode met behulp van een flow cytometer om PD-1-blokkerende antilichamen te detecteren die gebonden zijn aan T-cellen afkomstig van een druppel perifeer bloed, die we oorspronkelijk ontwikkelden voor nivolumabdetectie¹⁰. Hoewel deze techniek is zeer eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, twee belangrijke punten moeten worden opgemerkt om nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Een daarvan is dat om PD-1 moleculen te detecteren, een geschikt antilichaam dat concur...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody	BioLegend	300518	Clone RPA-T4
BD FACS Canto II Flow Cytometer	BD
Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301048	Clone RPA-T8
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control	abcam	ab81200
Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc	abcam	ab99825	Clone HP6025
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3	BD	558117	Clone UCHT1
PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD	561272	Clone EH12.1
PE-Cy7 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557646