Elektrochemotherapie bij 3D oculair melanoom sferoïden met behulp van een op maat gemaakte elektrode

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van 3D conjunctivale en oogmelanoom sferoïden en het gebruik van handbediende op maat gemaakte elektroden voor in vitro elektrochemotherapie van 3D sferoïden in een kweekput. Dit biedt nieuwe perspectieven in het gebruik van elektrochemotherapie bij de behandeling van oculair melanoom.

Samenvatting

Elektrochemotherapie (ECT) is de combinatie van voorbijgaande porievorming na toepassing van elektrische pulsen met de toediening van cytotoxische geneesmiddelen, die het cytotoxische effect van het aangebrachte middel als gevolg van membraanveranderingen versterken. In vitro 3D-kweeksystemen simuleren de in vivo tumorgroei en behouden de biologische kenmerken van tumoren nauwkeuriger dan conventionele monolaagse celculturen. We beschrijven een protocol voor de ontwikkeling van 3D-tumororganoïden met behulp van conjunctivaal melanoom (CM) en oogmelanoom (UM) cellijnen, evenals het gebruik van handbediende op maat gemaakte elektroden, geschikt voor in vitro ECT in de kweekput zonder vernietiging van de tumoromgeving. Dit protocol analyseert de cultuur en groei van 3D CM- en UM-sferoïden en hun reactie op bleomycine (2,5 μg/ml) alleen, elektroporatie (EP) (750 volt/cm, 8 pulsen, 100 μs, 5 Hz) alleen en ECT als een combinatie van EP en bleomycine. De geneesmiddelconcentratie en de EP-instellingen die in dit protocol worden gebruikt, zijn volgens eerdere experimenten vastgesteld als geprefereerde ECT-omstandigheden. De test die werd gebruikt om de sferoïde levensvatbaarheid te bepalen, werd 3-7 dagen na de behandeling uitgevoerd. Het effect op de levensvatbaarheid en groei van de 3D-tumorsferoïden was alleen significant na ECT. De op maat gemaakte elektroden worden in detail beschreven om de toepassing van pulsen in de kweekput te vergemakkelijken. Deze nieuwe behandeling van 3D UM- en CM-sferoïden vormt een opstap voor toekomstige klinische toepassing.

Inleiding

Oogmelanoom (UM) is de meest voorkomende primaire intraoculaire tumor bij volwassenen, terwijl conjunctivaal melanoom (CM) 2% van alle oculaire melanomen vertegenwoordigt 1,2,3,4,5,6. Brachytherapie, protonenbundelradiotherapie en fototherapie zijn de eerstelijnsbehandelingen in de UM, terwijl enucleatie van de aardbol nodig kan zijn ^1,2,3. De behandeling van CM varieert tussen oculaire oncologische centra; Excisiebiopsie gevolgd door lokale chemotherapie en/of bestralingstherapie is de meest voorkomende behandelingsbenadering⁴. Ondanks de behandeling wordt CM geassocieerd met een mortaliteit van 25%-30%⁵.

Er is een gebrek aan literatuur over de vorming van CM- en UM-sferoïden en de toepassing van ECT bij oculair melanoom ^6,7,8. Tumorsferoïden hebben betere biologische kenmerken dan conventionele 2D-celculturen en zijn voorgesteld als een nuttig hulpmiddel om de in vivo tumoromgeving na te bootsen⁹. Elektrochemotherapie (ECT) combineert het gebruik van niet-permeabele cytotoxische geneesmiddelen met elektroporatie (EP)¹⁰. EP is de lokale toepassing van korte en intense elektrische pulsen die cellen tijdelijk permeabiliseren voor een lokale toename van de opname van kankergeneesmiddelen in kankercellen en resulteert in verhoogde celdood¹¹. Deze studie stelt een protocol op dat de ontwikkeling van CM- en UM-sferoïden beschrijft en onderzoekt de resultaten na ECT met bleomycine. Dit protocol kan onderzoekers op het gebied van oculaire oncologie helpen bij het gebruik van andere therapeutische modaliteiten op sferoïden of bij het bestuderen van verdere effecten van ECT. Door het beperkte gebruik van ECT in de oogheelkunde is er weinig kennis over de werking en het proces van deze modaliteit; Dit experiment kan dus in de toekomst het spectrum van behandelingsopties verbreden. We stellen een nieuwe, op maat gemaakte handbediende plaatelektrode-instelling voor, die de ECT van de sferoïde in de kweekputten mogelijk maakt zonder enige vernietiging van de tumoromgeving.

Protocol

1. Sferoïde vorming

1. Gebruik aanhangend groeiende kankercellijnen voor sferoïdevorming.
2. Zorg voor alle celkweek geassocieerde stappen onder steriele bankomstandigheden.
3. Bereid het standaard volledige kweekmedium voor zoals aanbevolen voor de betreffende cellijnen en verwarm het met behulp van een waterbad tot 37 °C.
   OPMERKING: Hier werden de humane conjunctivale cellijnen CM2005.1, CRMM1, CRMM2 en de oogmelanoomcellijnen 92.1, OMM1 en OMM2 gebruikt en gekweekt in Ham F-12-medium met respectievelijk 10% foetaal runderserum en RPMI met 10% foetaal runderserum.
4. Maak de cellen van belang los met behulp van standaard enzymatische verteringsmethoden (bijv. trypsine-EDTA-oplossing).
5. Om het aantal vitale cellen te bepalen, resuspendeert u 10 μl van de celsuspensie in 10 μl Trypan blauwoplossing (1:1) en telt u de cellen met behulp van een kamer (hemocytometer of een geautomatiseerde cellenteller) binnen 5 minuten. Cellen moeten <90% van de samenvloeiing zijn en in goede staat verkeren.
6. Om sferoïden te vormen, zaait u 5 x 10³ cellen per putje met een totaal volume van 200 μL compleet kweekmedium in ultra-lage hechtingsplaten met 96 putjes. Incubeer de plaat bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO_{2 bevat}.
   OPMERKING: Gebruik voor een effectieve remming van de cellulaire hechting ultra-lage hechtingsplaten met een covalent gebonden hydrofiele, niet-ionische, neutraal geladen hydrogel op het oppervlak. Deze hydrogel remt de onsterfelijkheid van cellen en dwingt ze in een zwevende toestand om 3D-sferoïden te bouwen.
7. Controleer de sferoïdevorming met een microscoop.
   OPMERKING: Sommige cellijnen vormen geen ronde 3D-tumorsferoïden in de eerste passage. Passage de cultuur van de tumorbol voordat ze een donker centrum beginnen te ontwikkelen. Dissocieer de tumormassa's afhankelijk van de cellijn na 4-10 dagen door trypsinisatie. Zaai daarna de afzonderlijke cellen in een verse 96 ultra-low attachment plate. Door deze procedure verschillende passages te herhalen, zullen cellen zich aanpassen aan de 3D-cultuur.

2. Elektrochemotherapie van de tumorsferoïden

1. Gebruik als testcontrole onbehandelde sferoïden en sferoïden die alleen met EP of bleomycine zijn behandeld.
2. Pas de instellingen voor de elektroporator aan (aantal pulsen, pulsfrequentie, duur en voltage; zie materiaaltabel). Gebruik voor melanoomcellen 8 blokgolf elektrische pulsen met een sterkte van 750 volt/cm, een pulsduur van 100 μs, een herhalingsfrequentie van 5 Hz.
3. Bereid op dag 3 van de sferoïde cultuur een verse bleomycinesulfaatoplossing in steriel PBS met een concentratie van 5 μg/ml in een tube van 15 ml.
4. Vervang het celkweekmedium van de sferoïden door 200 μl kweekmedium te verwijderen en voor elk putje opnieuw te vullen met 100 μl vers volledig kweekmedium.
5. Voeg 100 μL bleomycinesulfaatoplossing toe aan elk putje (eindconcentratie 2,5 μg/ml). Voeg 100 μL vers medium toe aan onbehandelde controles en sferoïden die alleen zijn behandeld met EP in plaats van bleomycinesulfaatoplossing.
6. Voer de elektroporatie uit.
   OPMERKING: De elektroden in figuur 1 zijn geproduceerd in de onderzoekswerkplaats van de Universiteit van Halle-Wittenberg. Ze zijn gemaakt van roestvrij staal en passen op de handgreep van de elektroporator. De elektroden zijn ontworpen voor gebruik in ultra-lage bevestigingsplaten met 96 putjes. Soortgelijke roestvrijstalen elektroden kunnen ook gemakkelijk worden vervaardigd voor alternatieve toepassingen.
   1. Steriliseer elektroden met 70% ethanol en laat de elektroden drogen. De diameter van de elektroden is 1 mm, de opening tussen de twee elektroden is 4 mm en de lengte van elke elektrode is 8 mm (Figuur 1a).
   2. Plaats de elektroden op de bodem van het putje, met de sferoïden tussen de elektroden. Dit maakt de ideale positionering van de sferoïde tussen de twee elektroden mogelijk (Figuur 1b).
   3. Schud de plaat zodat de sferoïden vanaf de bodem van het putje kunnen bewegen en tussen de elektroden kunnen worden geplaatst. De sferoïde bevindt zich slechts een paar seconden tussen de elektroden.
   4. Start de elektroporatie met voorkeursinstellingen.
   5. Vervang de bleomycinesulfaatoplossing in het putje door 150 μL medium te vervangen door 150 μL vers medium.
   6. Incubeer de cellen gedurende maximaal 10 dagen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO₂ bevat. Als de onbehandelde sferoïden een donker centrum beginnen te ontwikkelen, beëindig dan het experiment. Vervang elke 2-3 dagen 150 μL van het celkweekmedium. Voorkom sferoïde verstoring door de pipetpunt aan de rand van de put te plaatsen, de plaat te kantelen en langzaam te pipetteren.

3. Bepaling van de sferoïde grootte

1. Meet de sferoïde grootte op de dag van de behandeling (startpunt) en 3-7 dagen na de behandeling met behulp van helderveldmicroscopie door de dwarsdoorsnede van de sferoïden te berekenen met behulp van ImageJ Fiji¹¹.
2. Maak een afbeelding van de afzonderlijke sferoïden met de schaalbalk. Gebruik een vergroting waardoor de hele sferoïde zichtbaar is. Zo werd voor CM2005.1 een vergroting van 5x gebruikt. Sla de afbeelding op als JPEG.
3. Analyseer de sferoïde grootte door de dwarsdoorsnede te berekenen met behulp van ImageJ/Fiji.
   1. Installeer de software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Start ImageJ/Fiji. Importeer de sferoïde-afbeelding: Bestand > Openen.
   3. Om de schaal in te stellen, kiest u de lijnknop van de werkbalk en markeert u de lijn van de schaalbalk in de afbeelding met een muisklik: Analyseer > Schaal instellen. Gebruik een bekende afstand en vul de afstand van de schaalbalk in. Verander de lengte-eenheid in μm. Klik op het veld globaal om de instellingen toe te wijzen voor alle afbeeldingen met dezelfde vergrotingsfactor.
   4. Converteer de afbeelding naar 8-bits: Afbeelding > Type > 8-bits.
   5. Kies Afbeelding > Pas > Automatische drempel aan (selecteer > Bereik niet opnieuw instellen). De sferoïde is rood of zwart gemarkeerd, afhankelijk van de gekozen drempelmarkering. Pas de schuifregelaars zo aan dat de sferoïde pixels rood worden, maar niet-sferoïde pixels niet van kleur veranderen. Sluit het dialoogvenster Drempel zonder op een van de knoppen te klikken.
   6. Als u de dwarsdoorsnede van de sferoïde wilt berekenen, kiest u Analyseren > Metingen instellen en klikt u op Gebied, Beperken tot drempel en Label weergeven. Sluit het dialoogvenster Afmetingen instellen door op OK te klikken.
   7. Als u de resultaten wilt weergeven, kiest u Deeltjes analyseren > Analyseren en wijzigt u de grootte (μm²) = 10000-oneindig om ruis te verwijderen. Klik op de knop Resultaten weergeven en sluit het venster door op OK te klikken. In de resultaten worden de sferoïden met het label en het gebied weergegeven. Door de analyses van verschillende sferoïden te herhalen, worden de resultaten weergegeven in het venster Resultaten .
   8. Om de relatieve behandelingsrespons van de met ECT behandelde sferoïden te bepalen in vergelijking met de onbehandelde en enkelvoudig behandelde controles, berekent u de procentuele veranderingen van de dwarsdoorsnede.

4. Bepaling van de levensvatbaarheid van sferoïden

1. Meet de sferoïde levensvatbaarheid 3-7 dagen na de behandeling met behulp van een cellevensvatbaarheidstest die geschikt is voor 3D-celculturen volgens de instructies van de fabrikant. De test moet grote sferoïden binnendringen en lyseren om de levensvatbaarheid te kunnen detecteren door kwantificering van ATP, dat de aanwezigheid van metabolisch actieve cellen signaleert.
   OPMERKING: In dit experiment werd een op luminescentie gebaseerde test als uitleesmethode gebruikt. De levensvatbaarheid van de met ECT behandelde sferoïden werd zeven dagen na de behandeling vergeleken met controles.

Resultaten

De experimenten werden uitgevoerd met op maat gemaakte handelektroden, die zijn samengesteld uit hoogwaardig roestvrij staal. De dikte van de elektroden is 1 mm, de breedte is 4 mm, de opening tussen de twee elektroden is 4 mm en de lengte van elke elektrode is 8 mm (Figuur 1). EP en bleomycine alleen hebben geen significant effect op de levensvatbaarheid en groei van zowel UM- als CM-tumorsferoïden. ECT vertoont een significante vermindering van de levensvatbaarheid van de tumor en van de sferoïdegrootte. Verlies van sferoïde architectuur met gedeconstrueerde celfragmenten rond de sferoïden en necrose op het centrale en perifere gebied van alle geteste sferoïden werden waargenomen na ECT met bleomycine. Figuur 2 toont de resultaten van de CM2005.1 cellijnen. Gemetastaseerde UM-cellijnen vertoonden een hogere respons in vergelijking met primaire cellijnen na ECT⁸.

Figuur 1: Op maat gemaakte handelektroden. De elektroden zijn gemaakt van hoogwaardig roestvrij staal. Het handvat van de elektroden wordt bij de elektroporator geleverd. De dikte van de elektroden is 1 mm, de breedte is 4 mm, de opening tussen de twee elektroden is 4 mm en de lengte van elke elektrode is 8 mm (a); elektroporatie van sferoïden in een formaat met 96 putjes (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Cytotoxisch effect van elektrochemotherapie op tumorsferoïden van de conjunctivale melanoomcellijn CM2005.1. Elektrochemotherapie (ECT, 750 V/cm na toepassing van 2,5 μg/ml bleomycine) veroorzaakte sterkere cytotoxische effecten bij sferoïden in vergelijking met elektroporatie (EP) alleen of chemotherapie met bleomycine (2,5 g/ml) alleen. Het cytotoxische effect werd gemeten door zowel de dwarsdoorsnede als een levensvatbaarheidstest te berekenen als percentage van de onbehandelde controle zeven dagen na de behandeling. Boxplots tonen de gemiddelde dwarsdoorsnede van sferoïden (a); de gemiddelde levensvatbaarheid van sferoïden (b); Representatieve afbeeldingen van sferoïden, schaalbalk = 200 μm (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

EP wordt gebruikt in verschillende biotechnologische en klinische toepassingen¹². Nieuwe technologische ontwikkelingen, zoals speciaal ontworpen elektroden met een hoge specificiteit voor elke doelcel en -locatie, kunnen ECT-targeting overal in het lichaam helpen¹². Het ontwerp en de positie van de elektroden moeten volledige toegankelijkheid van de tumor mogelijk maken en ervoor zorgen dat gezond weefsel slechts minimaal wordt aangetast of niet beschadigd door de behandeling¹³.

Eerdere publicaties toonden het effect van ECT in humane melanoomcelsuspensies in vitro^{aan 7,8}. De literatuur die verwijst naar de toepassing van ECT in 3D oculaire celmodellen of andere vergelijkbare in vivo omgevingen, die een veiliger therapeutisch gebruik mogelijk maken, is beperkt. Brun et al. stellen dat de 3D-cellen in de steiger tijdens de morfologische analyse een ronde vorm hebben die verschilt van de langwerpige vorm die wordt getoond in de 2D-culturen, maar zeer vergelijkbaar is met de cellen uit biopsieën van patiënten⁹. De verfijning van therapie-instellingen en instrumenten die in 3D-culturen worden gebruikt, kan leiden tot een optimalisatie van ECT-parameters, waardoor een nauwkeurigere klinische benadering mogelijk wordt⁹.

We beschrijven een technologische ontwikkeling met betrekking tot nieuwe elektroden voor de toepassing van ECT in 3D celculturen. Bleomycine is het meest toegediende cytotoxische middel in combinatie met ECT¹¹. Eerdere studies van onze groep toonden aan dat de toegepaste EP-instellingen (750 Volt/cm, 8 pulsen, 100 ms, 5 Hz) geschikt waren voor de behandeling van oogtumoren in vitro. Kritieke stappen van de techniek zijn onder meer de korte tijd die nodig is om de ECT uit te voeren terwijl de sferoïde zinkt na mobilisatie, evenals de precieze afmeting van de elektroden. De noodzaak voor de op maat gemaakte elektroden was te wijten aan moeilijkheden bij het uitvoeren van ECT in de putten met de beschikbare instrumenten. Niet-gepubliceerde gegevens van onze groep toonden verhoogde sferoïde schade aan bij het overbrengen van de sferoïden naar een grotere put of in een cuvet om ze voor te bereiden op de behandeling en vervolgens terug naar de kweekput. Een voordeel van de beschreven techniek is het ontbreken van sferoïde manipulatie om de behandeling uit te voeren, omdat de organoïden niet worden overgebracht naar grotere platen of putjes. Daarom behouden alle sferoïden hun vorm. Een ander voordeel is het gebruik van robuustere 3D-levensvatbaarheidstesten om de cytotoxiciteit van ECT te bepalen in vergelijking met standaard levensvatbaarheidstesten, zoals de MTT-test. Daarbij worden alle cellen van de sferoïde gelyseerd en zijn extra celspoeling, verwijdering van het medium en meerdere pipetteerstappen nodig.

Beperkingen van de beschreven methoden zijn de korte levensduur van sferoïden, die zowel de grootte van de tumor als de celnecrose beïnvloedt, zoals te zien is in het midden van de tumororganoïde. Het daarmee gepaard gaande hoge sterftecijfer in zowel CM als UM en de beperkte therapeutische mogelijkheden vereisen een verrijking van de bestaande therapeutische mogelijkheden. ECT kan een adjuvante modaliteit bieden voor de verbetering van de kwaliteit van leven van de patiënt en het verlengen van de overleving van de patiënt. Deze in vitro omstandigheden imiteren een in vivo setting met hogere precisie en bieden veelbelovende resultaten voor verdere toepassing op de mens. Toekomstige studies met behulp van sferoïden bereid uit primaire culturen kunnen meer representatieve resultaten opleveren voor optimalisatie van ECT-instellingen voor een gerichte behandeling.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bleomycin sulfate	Enzo	BML-AP302-0010	10 mg
Cell culture flask 75 cm	TPP	TPP90076
Cell culture flask TC175 cm	Sarstedt	83.39.12.002	Standaard met filter
Cliniporator	IGEA	EPS01	Electroporator
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 96 well, ronde bodem	Corning	7007	96Well heldere ronde bodem, Ultra low attachment platen
EGF 1MG	Sigma-Aldrich	E4127-.1MG
F-12 K Nut Mix (1x)	Gibco	21127-022
Fetal Bovine Serum, South American	Corning	35-079-CV	LOT Nr. 35079010, Reservatienummer: EU00478541
FKS
KGM-2	Lonza	CC-3103
PBS zonder CaCl en MgCl	PromoCell	C-40232	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ml
RPMI 1640	Gibco	11504566	ATCC-modificatie, HEPES, vloeibaar, 500 ml
Tecan Infinity M Plex	Tecan
Trypsin-EDTA 1x oplossing	Sigma-Aldrich	59430C-100ml