De voorbereiding van SNS tang kobalt (II) modelcomplexen van leveralcohol dehydrogenase wordt hier gepresenteerd. De complexen kunnen worden voorbereid door te reageren op de ligand voorloper met CoCl2·6H2O en kunnen vervolgens worden geherkristalliseerd door dat diethylether langzaam diffuus in een acetonitril oplossing die het kobaltcomplex bevat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding van SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexen van Lever Alcohol Dehydrogenase
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chemische modelcomplexen zijn bereid om de actieve plaats van een enzym te vertegenwoordigen. In dit protocol worden een familie van drietandige pincerligand precursoren (elk met twee zwavel- en één stikstofdonoratoomfunctionaliteiten (SNS) en op basis van bis-imidazool- of bistriazoleverbindingen) metallated met CoCl2·6H2O om tridentate SNS pincer kobalt(II) complexen te veroorloven. De bereiding van de kobalt(II) modelcomplexen voor leveralcohol dehydrogenase is facile. Op basis van een snelle kleurverandering bij het toevoegen van de CoCl2·6H2O aan acetonitriloplossing die de ligand-voorloper bevat, vormen de complexe vormen zich snel. De vorming van het metaalcomplex is voltooid nadat de oplossing 's nachts kan worden overgeleverd. Deze kobalt(II) complexen dienen als modellen voor de zink actieve site in leveralcohol dehydrogenase (LADH). De complexen worden gekenmerkt met behulp van enkel kristal X-ray diffractie, electrospray massaspectrometrie, ultraviolet zichtbare spectroscopie, en elementaire analyse. Om de structuur van het complex nauwkeurig te bepalen, moet de enkele kristalstructuur worden bepaald. Enkele kristallen van de complexen die geschikt zijn voor röntgendiffractie worden vervolgens via langzame dampdiffusie van diethylether gekweekt tot een acetonitriloplossing die het kobalt(II)-complex bevat. Voor hoge kwaliteit kristallen, herkristallisatie vindt meestal plaats over een periode van 1 week, of langer. De methode kan worden toegepast op de voorbereiding van andere model coördinatie complexen en kan worden gebruikt in undergraduate onderwijslaboratoria. Ten slotte wordt aangenomen dat anderen deze herkristallisatiemethode kunnen vinden om enkele kristallen te verkrijgen die gunstig zijn voor hun onderzoek.
Inleiding
Het doel van de gepresenteerde methode is om kleine molecuulanalogen van LADH voor te bereiden om de katalytische activiteit van metalloenzymen verder te begrijpen. LADH is een dimeric enzym dat een cofactor-bindend domein en zink(II) metaalhoudend katalytisch domein1bevat. LADH, in aanwezigheid van co-factor NADH, kan ketonen en aldehyden reduceren tot hun respectieve alcoholderivaten2. In aanwezigheid van NAD+kan LADH omgekeerde katalyse van oxidatie van alcoholen tot ketonen en aldehydenuitvoeren 2. De kristalstructuur van de actieve locatie van LADH toont aan dat het zink(II) metaalcentrum gebonden is aan één stikstofatoom, geleverd door een histidinezijde en twee zwavelatomen en wordt aangeboden door twee cysteïneliganden3. Verder onderzoek heeft aangetoond dat het zinkmetaalcentrum is verbonden met een labiel watermolecuul, wat resulteert in pseudo-tetraëdergeometrie rond het metalen centrum4.
We hebben eerder gemeld en gebruikt SNS pincer ligand precursoren evenals metallated de ligand precursoren met ZnCl2 te vormen Zn (II) complexen die de tridentate ligand voorloper5bevatten ,6,7. Deze ligandprecursoren zijn afgebeeld in figuur 1. Deze zink(II) complexen vertoonden activiteit voor de stoichiometrische vermindering van elektronenarme aldehyden en zijn dus modelcomplexen voor LADH. Vervolgens zijn de synthese en karakterisering van een reeks koper(I) en koper(II) complexen die SNS ligand precursoren bevatten gemeld8,9,10.
Hoewel LADH een zink(II) enzym is, zijn we geïnteresseerd in het voorbereiden van kobalt(II) modelcomplexen van LADH om meer spectroscopische informatie over de kobalt(II) analogen van LADH te verkrijgen. De kobalt(II) complexen zijn gekleurd, terwijl de zink(II) complexen off-white zijn. Aangezien de kobalt(II) complexen gekleurd zijn, kunnen ultraviolet zichtbare spectra van de complexen worden verkregen, waarin ook informatie over de sterkte van het ligandveld in kobalt(II) complexen kan worden verzameld. Door gebruik te maken van informatie uit Gaussische berekeningen en de experimenteel verkregen ultraviolette zichtbare spectra kan informatie over de sterkte van het ligandveld worden afgeleid. Kobalt(II) is een goede vervanging voor zink(II), aangezien beide ionen vergelijkbare ionische stralen en vergelijkbare Lewis-zuurgraad hebben11,12.
De gepresenteerde methode omvat het synthetiseren en karakteriseren van modelcomplexen om te proberen het natuurlijke katalytische gedrag van LADH5na tebootsen,6. We hebben eerder een familie van ligand precursoren met ZnCl2 gemetalleerd om zink(II) modelcomplexen van LADH te vormen, die de structuur en reactiviteit van de zinkactieve locatie in LADH4modelhebben gemodelleerd. Door middel van meerdere experimenten hebben deze tangliganden bewezen robuust te zijn onder verschillende omgevingsomstandigheden en zijn stabiel gebleven met een gevarieerde verzameling van aangesloten R-groepen. 5,6.
Tridentate liganden hebben de voorkeur in vergelijking met monodentate liganden, omdat ze zijn gevonden om meer succes met metalatie als gevolg van de sterke chelaat effecten van tridentaat liganden. Deze observatie is te wijten aan een meer favoriete entropie van tridentate pincer ligand vorming in vergelijking met een monodentate ligand13. Bovendien, tridentate tang ligands zijn waarschijnlijk te voorkomen dat verkleining van de metalen complexen, die wordt begunstigd omdat verkleining is waarschijnlijk katalytische activiteit van een complexe14vertragen . Zo is het gebruik van tridentate tangliganden bewezen succesvol in de organometaalchemie bij de voorbereiding van katalytische actieve en robuuste complexen. SNS tang complexen zijn minder bestudeerd dan andere pincer systemen, als tang complexen bevatten meestal tweede en derde rij overgang metalen15.
Dit onderzoek naar metalloenzymen kan helpen om het begrip van hun enzymatische activiteit, die kan worden toegepast op andere gebieden in de biologie, verder te begrijpen. Deze methode voor het synthetiseren van modelcomplexen in vergelijking met de alternatieve methode (het synthetiseren van het volledige eiwit van LADH) is om een aantal redenen gunstig. Het eerste voordeel is dat modelcomplexen een laag gehalte aan moleculaire massa hebben en nog steeds in staat zijn om de katalytische activiteit en de omgevingsomstandigheden van de actieve locatie van het natuurlijke enzym nauwkeurig weer te geven. Ten tweede zijn modelcomplexen eenvoudiger om mee te werken en betrouwbare en relatable gegevens te produceren.
Dit manuscript beschrijft de synthetische voorbereiding en karakterisering van twee kobalt (II) tangen modelcomplexen van LADH. Beide complexen zijn voorzien van een tang ligand dat zwavel, stikstof en zwavel donor atomen bevat. Het eerste complex (4) is gebaseerd op een imidazool voorloper, en de tweede (5) is gebaseerd op een triazool voorloper. De complexen vertonen reactiviteit voor de stoichiometry reductie van elektronenarme aldehyden in aanwezigheid van een waterstofdonor. Deze reactiviteitsresultaten worden gerapporteerd in een volgend manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Synthese van chloor-(n3-S,S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazool-2-thione)pyridine]kobalt(II)tetrachloorkobaltaat [4]
- Voeg voor de voorbereiding van complex 40,121 g (3,12 x 10-4 mol) van 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methyleneimidazool-2-thione)pyridine (C19H25N5S2)6 tot 15 mL acetriltonie in een ronde kolf van 100 mL. Voeg vervolgens 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) kobaltchloride(II) hexahydraat (CoCl2·6H2O) toe. De reactieoplossing moet van kleur veranderen van lichtgeel naar smaragdgroen onmiddellijk nadat het kobalt(II) chloridehexahydraat is toegevoegd.
- Voeg een roerstaaf toe aan de kolf. Reflux en roer de reactie gedurende 20 uur om volledige reactie te garanderen. Verwijder het oplosmiddel met een rotovap onder verminderde druk.
2. Herkristallisatie van chloor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazool-2-thione)pyridine]kobalt(II)tetrachloorkobaltaat [4] door langzame dampdiffusie
- Los de solute op in acetonitril (7,5 mL), filter de oplossing en plaats de oplossing gelijkmatig in 1 dram-flacons. Vul elke flacon met 1,5 mL acetonitriloplossing.
- Voeg katoen toe om de flacons te capen, wat zorgt voor langzame dampdiffusie. Plaats het katoen goed in de opening aan de bovenkant van de flacon.
- Plaats de flacons in een pot van 240 mL met 50 mL diethylether. Sluit de pot met een dop.
- Laat de kristallen groeien over een periode van 1 week.
LET OP: Herkristallisatie kan langer dan 1 dag duren.
3. Synthese van chloor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazool-2-thione)pyridine]kobalt(II)tetrachloorcobaltaat [5]
- Voeg voor de voorbereiding van complex 50,183 g (4,70 x 10-4 mol) van 2,6-bis (N-isopropyl-N'-methylenetriazool-2-thione)pyridine (C17H23N7S2)6 tot 15 mL acetonitril in een ronde kolf van 100 mL. Voeg aan deze oplossing 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) kobaltchloridehexahydraat (CoCl2·6H2O) toe. De reactieoplossing moet onmiddellijk na de afgifte van het kobalt(II) chloridehexahydraat van kleur veranderen van lichtgeel naar koninklijk blauw.
- Voeg een roerstaaf toe aan de kolf. Reflux en roer de reactie gedurende 20 uur om volledige reactie te garanderen. Verwijder het oplosmiddel met een rotovap onder verminderde druk.
4. Herkristallisatie van chloor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazool-2-thione)pyridine]kobalt(II)tetrachloorkobaltaat [5] door langzame dampdiffusie
- Los de solute op in acetonitril (9,0 mL), filter de oplossing en plaats de oplossing gelijkmatig in 1 dram-flacons. Vul elke flacon met 1,5 mL acetonitriloplossing.
- Voeg katoen toe om de flacons te capen, wat zorgt voor langzame dampdiffusie. Plaats het katoen goed in de opening aan de bovenkant van de flacon.
- Doe de flacons in een pot met 50 mL diethylether. Sluit de flacon met een dop.
- Laat de kristallen groeien over een periode van 1 week.
LET OP: Herkristallisatie kan langer dan 1 dag duren.
5. Röntgenkristallografie
- Monteer een kristal van 4 op een nylon lus. Verzamel de gegevens op een Rigaku Oxford Diffractie diffractometer. Hier worden röntgendiffractiegegevens verzameld op 173(2) K. Los de kristalstructuur op met Olex216- en ShelXT 17-structuuroplossingsprogramma's met behulp van directe methoden.17 Verfijn de structuur met het ShelXL18 verfijningspakket met de minste vierkantenminimalisatie.
- Monteer een kristal van 5 op een nylon lus. Verzamel de röntgendiffractiegegevens op een Rigaku Oxford Diffractie diffractometer. Hier worden röntgendiffractiegegevens verzameld op 173(2) K. Los de kristalstructuur op met Olex216- en ShelXT 17-structuuroplossingsprogramma's met behulp van directe methoden.17 Verfijn de structuur met het ShelXL18 verfijningspakket met de minste vierkantenminimalisatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Synthese
De syntheses van complexen 4 en 5 werden met succes uitgevoerd door te reageren op een acetonitriloplossing die een bis-thione ligand-voorloper met kobalt (II) chloridehexahydraat ( figuur 2 ) (figuur 2) ( Deze reactie trad op bij een refluxtemperatuur in aanwezigheid van lucht. In het algemeen werden complexen 4 en 5 waargenomen oplosbaar in acetril, dimethylsulfoxide, dichloormethaan en methano...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De voorbereiding van complexen 4 en 5 is facile. De belangrijkste stap is om de solide CoCl2·6H2O toe te voegen aan een acetonitriloplossing die de respectievelijke ligand-voorloper bevat. De oplossing wordt binnen enkele seconden na de toevoeging van CoCl2·6H2O donkergroen om complex 4te vormen. De oplossing wordt helderblauw na de toevoeging van CoCl2·6H2O om complex 5te vormen. Om een v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
John Miecznikowski kreeg financiële steun van het volgende voor dit project: de Connecticut NASA Space Grant Alliance (Award Number P-1168), het Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield University Faculty Summer Research Stipendend, en National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1827854) voor fondsen voor de aanschaf van een 400 MHz NMR spectrometer. Hij bedankt ook Terence Wu (Yale University) voor hulp bij het verwerven van electrospray massa spectra. Jerry Jasinski erkent de National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1039027) voor fondsen voor de aankoop van een X-ray diffractometer. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch, en Samantha Zygmont erkennen de Hardiman Scholars Program voor het verstrekken van hun zomer onderzoek stipendium.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100 mL Round Bottomed Flask | Chem Glass | CG150691 | 100mL Single Neck Round Bottomed Flask, 19/22 Outer Joint |
| Acetonitrile | Fisher | HB9823-4 | HPLC Grade |
| Chiller for roto-vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Cobalt Chloride hexahydrate | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Diethyl Ether | Fisher | E-138-1 | Diethyl Ether Anhydorus |
| graduated cylinder | Fisher | S63456 | 25 mL graduated cylinder |
| hotplate | Fisher | 11-100-49SH | Isotemp Basic Stirring Hotplate |
| jars | Fisher | 05-719-481 | 250 mL jars |
| Ligand | ----- | ----- | Synthezied previously by Professor Miecznikowski |
| medium cotton balls | Fisher | 22-456-80 | medium cotton balls |
| one dram vials | Fisher | 03-339 | one dram vials with TFE Lined Cap |
| pipet | Fisher | 13-678-20B | 5.75 inch pipets |
| pipet bulbs | Fisher | 03-448-21 | Fisher Brand Latex Bulb for pipet |
| recrystallizing dish for sand bath | Fisher | 08-741 D | 325 mL recrystallizing dish for sand bath |
| reflux condensor | Chem Glass | CG-1218-A-22 | Condenser with 19/22 inner joint |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Heidolph Collegiate Rotary Evaporator with Heidolph WB eco bath Heidolph Rotary Evaporator |
| sea sand for sandbath | Acros Organics | 612355000 | washed sea sand for sand bath |
| Stir bar | Fisher | 07-910-23 | Egg-Shaped Magnetic Stir Bar |
| Vacum grease | Fisher | 14-635-5D | Dow Corning High Vacuum Grease |
| vacuum pump for rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Heidolph Rotovac Valve Control |
Referenties
- Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
- Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
- Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
- Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
- Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
- Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
- Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
- Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
- Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
- Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
- Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019).
- Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019).
- Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1'-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
- Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on "Pincer" Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
- Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
- Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
- Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
- Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
- Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
- Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389(1991).
- Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
- Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
