Kwantificeren van de cytotoxiciteit van Staphyloccus aureus tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor de zuivering van polymorfonucleaire leukocyten uit het hele menselijke bloed en twee verschillende assays die de cytotoxiciteit van Staphylococcus aureus kwantificeren tegen deze belangrijke aangeboren immuuncellen.

Samenvatting

Staphylococcus aureus is geschikt voor het afscheiden van een breed scala aan leukocidinen die de membraan integriteit van polymorfonucleaire leukocyten (PMNs of neutrofielen) targeten en verstoren. Dit protocol beschrijft zowel de zuivering van menselijke Pmn's en de kwantificering van S. aureus cytotoxiciteit tegen pmns in drie verschillende secties. Sectie 1 Details van de isolatie van PMNs en serum van menselijk bloed met behulp van dichtheid centrifugeren. In deel 2 wordt de cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten die door S. aureus worden geproduceerd, getest tegen deze gezuiverde humane Pmns. rubriek 3 meet de cytotoxiciteit tegen humane pmns na de fagocytose van levende S. aureus. Deze procedures meten verstoring van de PMN-plasma membraan integriteit door S. aureus leukocidins met behulp van Flowcytometrie analyse van pmn's behandeld met propidium jodide, een DNA-bindende de dat celmembraan ondoorstroombaar is. Collectief, deze methoden hebben het voordeel van snel testen S. aureus cytotoxiciteit tegen primaire menselijke PMNs en kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van andere aspecten van gastheer-pathogen interacties.

Inleiding

Staphylococcus aureus is een gram-positieve bacterie die een breed spectrum van ziekten bij de mens veroorzaakt. Deze prominente pathogeen produceert talrijke virulentie factoren die bijdragen aan verschillende aspecten van infectie. Deze omvatten oppervlakte moleculen waardoor S. aureus zich aan verschillende soorten host-weefsel¹kan houden, extracellulaire eiwitten die interfereren met de gastheer immuunrespons², en een array van afgescheiden toxines die gericht zijn op verschillende soorten hostcellen³. In dit verslag beschrijven we een methode die de cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten, geproduceerd door S. aureus , kwantificeert tegen humane polymorfonucleaire leukocyten (PMNs of neutrofielen), primaire Effector cellen van de gastheer aangeboren immuunrespons.

PMNs zijn de meest voorkomende leukocyten in zoogdieren. Deze circulerende immuuncellen worden snel gerekruteerd op de plaats van gastheer weefsel belediging in reactie op gevaarsignalen geproduceerd door ingezeten cellen of door verbindingen die uniek zijn voor het binnenvallen van microben. De extracellulaire input van deze moleculen en van directe contacten met geactiveerde Resident gastheer cellen tijdens extravasatie verhogen de activeringsstatus van pmns in een proces dat bekend staat als priming^4,5. Primed PMNs die noodlijdende weefsel hebben bereikt dan uitvoeren belangrijke aangeboren immuunresponsen ontworpen om te voorkomen dat de oprichting van infectie. Deze omvatten de binding en internalisatie, of fagocytose, van het binnenvallen van micro-organismen die een cascade van intracellulaire gebeurtenissen die cumuleren in microbe vernietiging veroorzaakt door een batterij van krachtige antimicrobiële verbindingen⁵.

Pmn's spelen een essentiële rol bij het beschermen van mensen tegen het binnenvallen van pathogenen en zijn vooral belangrijk voor het voorkomen van S. aureus infectie⁴. Echter, deze bacterie produceert een breed scala van virulentie genen die verschillende PMN functies belemmeren. Deze omvatten extracellulaire eiwitten die herkenning van signalering moleculen blokkeren, voorkomen hechting op gastheer weefsel, remmen de productie van antimicrobiële verbindingen, en compromitteren van het plasma membraan integriteit⁴. S. aureus organiseert de temporele uitdrukking van deze virulentie genen door middel van de collectieve inbreng van meerdere twee componenten sensorische systemen die specifieke omgevings aanwijzingen herkennen. De Saer/S twee-componenten systeem is een belangrijke up-regulator van S. aureus virulentie gentranscriptie tijdens infectie^{6,7,8,9,10,11}. In het bijzonder is gebleken dat dit twee componenten systeem van cruciaal belang is voor de productie van bi-component leukocidinen die specifiek gericht zijn op humane PMNs¹².

Dit protocol is onderverdeeld in drie verschillende secties. De eerste sectie beschrijft de zuivering van PMNs van menselijk bloed met behulp van dichtheidsgradiënt centrifugeren met behulp van een protocol dat is aangepast aan de methoden die zijn vastgesteld door Bøyum¹³ en Nauseef¹⁴. In de tweede en derde sectie worden twee verschillende technieken beschreven om S. aureus cytotoxiciteit te onderzoeken; een bedwelmt pmns met extracellulaire eiwitten geproduceerd door S. aureus terwijl de andere onderzoekt het vermogen van levende bacteriën te beschadigen pmns na fagocytose. Deze procedures gebruiken propidium jodide om het verlies van PMN-plasma membraan integriteit veroorzaakt door S. aureus porie vormende toxines te meten. Propidium jodide is een DNA-bindende de die normaal celmembraan ondoorlaat is, maar kan Cross plasma membranen die zijn verstoord door S. aureus toxines. Flow cytometrie analyse maakt de snelle kwantificering van propidium iodide-positieve Pmn's mogelijk om de relatieve cytotoxiciteit van S. aureus stammen te meten. Methicillaire-resistente S. aureus (MRSA) geïdentificeerd als gepulseerd veld gel elektroforese type USA300 en een isogene deletie van Saer/s in deze stam (USA300ΔSaer/s) zijn gebruikt als modellen om aan te tonen hoe deze procedures de cytotoxiciteit van S. aureus kunnen kwantificeren tegen menselijke pmns.

Protocol

Heparinized veneuze bloed van gezonde donoren werd verzameld in overeenstemming met het protocol goedgekeurd door de institutionele Review Board voor menselijke proefpersonen aan de Montana State University. Alle donoren hebben schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan deze studie.

1. zuivering van menselijke polymorfonucleaire leukocyten en isolatie van menselijk serum

Opmerking: alle reagentia moeten routinematig worden gecontroleerd op de aanwezigheid van endotoxine met behulp van een in de handel verkrijgbare endotoxine detectiekit en moeten < 25.0 PG/mL endotoxine bevatten om ongewenste priming van Pmn's te voorkomen.

1. Breng 50 mL van 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL van 1,077 g/mL dichtheidsgradiënt oplossing, en 20 mL water van injectie of irrigatie-niveau op kamertemperatuur.
2. Om humaan serum te isoleren, incuberen 4 mL vers getrokken menselijk bloed zonder anti-coagulans bij 37 °C in een glazen buis van 15 mL gedurende 30 minuten. Na incubatie, centrifugeer monster bij 2000 – 3000 × g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng de bovenste serum laag over in een nieuwe conische centrifugebuis van 15 mL en plaats op ijs.
3. Combineer 25 ml vers getekende gehepariniseerd (1000 eenheden/ml) volbloed met 25 ml kamertemperatuur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) in twee replicaatconische centrifugebuizen van 50 ml (50 ml totaal volume per buis). Meng door zachtjes elke 50 mL conische buis te rocken en laat dan 30 min op kamertemperatuur staan.
4. Na incubatie bij kamertemperatuur worden twee afzonderlijke lagen weergegeven. Breng de bovenste laag van elk dextran-bloed mengsel over in nieuwe conische buisjes van 50 mL en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met lage of geen remmen bij 450 x g .
5. Aspireren zowel supernatanten en gooi zonder verstoring van de celpellets. Zachtjes resuspendeer elke celpellet in 2 mL kamertemperatuur 0,9% NaCl, combineer de geresuspendeerde pellets in een enkele 50 mL conische buis, voeg vervolgens de resterende 0,9% NaCl (eindvolume van 35 mL).
6. Onderleg voorzichtig 10 mL kamertemperatuur van 1,077 g/mL dichtheidsgradiënt oplossing onder de celsuspensie met behulp van een hand pipet. Spin bij 450 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met lage of geen remmen. Zuig de supernatant zachtjes op zonder de celpellet te storen. Supernatant zal perifere bloed mononucleaire cellen bevatten die kunnen worden verzameld zoals eerder beschreven¹⁴.
7. Lyse de rode bloedcellen door het resuspenseren van de celpellet in 20 mL kamertemperatuur water. Meng zachtjes door de buis te schudden voor 30 sec. De lysis van rode bloedcellen zal gepaard gaan met een duidelijke afname van troebelheid.
8. Voeg onmiddellijk 20 mL 1,8% NaCl (bij kamertemperatuur [RT]) en centrifuge monster bij 450 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: het is belangrijk om de tijd te minimaliseren dat PMNs alleen in water achterblijven na de rode bloedcel lysis om de PMN-opbrengst te maximaliseren en PMN-lysis en/of activering te voorkomen.
9. Zuig de supernatant voorzichtig op zonder de celpellet te verstoren. Breng de celpellet voorzichtig over in 2 mL RT RPMI 1640 medium en plaats op ijs.
10. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Respendeer gezuiverde Pmn's met een concentratie van 1 x 10⁷ cellen/ml met IJSKOUDE rpmi en blijf op ijs.
11. Combineer 100 μL gezuiverde PMNs (1 x 10⁶ cellen) met 300 μL ijskoude dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (dpbs) met 1 μL propidium jodide vlek in twee replicaatcytometrie buisjes. Voor een positieve controle op beschadiging van het plasma membraan, voeg 40 μL 0,5% Triton X-100 oplossing toe aan een van de flow cytometrie buizen en meng grondig.
12. Gebruik stroom cytometrie voor het meten van de voorwaartse spreiding, Side Scatter en propidium jodide kleuring (excitatie/emissiemaxima bij 535/617 nm) van gezuiverde cellen (Figuur 1).
    Let op: forward en side Scatter analyse zal ongewenste populaties van lymfocyten en monocyten identificeren. Propidium jodide zal alleen cellen vlekken met een aangetast plasma membraan en gezuiverde pmns die populaties van propidium jodide positieve cellen hebben uitgesproken, mogen niet worden gebruikt. Voor deze studies werden gezuiverde PMNs alleen gebruikt als ze bestonden uit > 98% gezuiverde cellen en < 5% bevlekt positief voor propidium jodide.
13. Bereid een 96-boorput voor PMN cytotoxiciteit-assays door individuele putjes te coaten die in deze test zullen worden gebruikt met 100 μL van 20% geïsoleerd humaan serum dat is verdund met DPBS.
    Opmerking: het bekleden van Pmn's direct op plastic of glas zal leiden tot activering van de cellen. Zorg ervoor dat u ten minste één negatieve controle goed die alleen media ontvangt en ten minste één positieve controle goed die zal ontvangen 0,05% Triton X-100.
14. Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 30 minuten. Na incubatie, was de gecoate putjes tweemaal met ijskoude DPBS om overtollig serum te verwijderen. Tik zachtjes op de plaat ondersteboven om eventuele resterende DPB'S te verwijderen en op ijs te plaatsen.
15. Voeg voorzichtig 100 μL gezuiverde humane Pmn's toe bij 1 x 10⁷ cellen/ml voor elk goed gecoat (1 x 10⁶ pmns/well). Laat de PMNs zich in putten vestigen door de plaat op ijs gedurende ten minste 5 min te inbroed. Houd het niveau van de plaat zodat zelfs de verdeling van cellen in elk putje en laat op ijs om ongewenste activering van PMNs te voorkomen.

2. cytotoxiciteits test van S. aureus extracellulaire eiwitten tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten

1. Culture S. aureus 's nachts in tryptische soja Bouillon (TSB) met behulp van een schudden incubator ingesteld op 37 ° c. Voor deze studies werden 20 mL TSB in afzonderlijke Erlenmeyerkolven van 150 mL geënt met bevroren culturen van s. aureus stammen USA300 of USA300ΔSaer/S en gekweekt voor ongeveer 14 uur met schudden bij 250 rpm.
2. Subculture S. aureus door het uitvoeren van een 1:100 verdunning van nachtelijke bacteriële cultuur met verse media. Inbroed bij 37 °C met schudden totdat de bacteriën de vroege stationaire groeifase bereiken.
   Opmerking: voor deze experimenten werden 20 mL tryptische soja Bouillon in 150 mL erlenmeyer geënt met 200 μL 's nachts gekweekte USA300 of USA300ΔSaer/S en geïncubeerd bij 37 °c met schudden bij 250 rpm gedurende 5 uur.
3. Wanneer bacteriën de vroege stationaire groeifase hebben bereikt, breng dan 1 mL van de ondergekweekte S. aureus over in een micro centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 5.000 × g .
4. Na centrifugeren, breng supernatant over in een doseerspuit van 3 mL. Geef supernatanten door een 0,22 μm filter en in een nieuwe 1,5 ml microcentrifuge buis op ijs.
5. Voer seriële verdunningen van supernatanten uit met ijskoude media die worden gebruikt om S. aureuste kweken.
   Opmerking: voor de getoonde experimenten, supernatanten van USA300 en USA300ΔSaer/S onderging vier opeenvolgende 1/2 log verdunningen met ijskoude TSB.
6. Voeg voorzichtig supernatant monsters of media alleen (voor negatieve en positieve controles) toe aan afzonderlijke putjes van 96-boorput met Pmn's op ijs uit stap 1,15. Voor deze experimenten werden aan elk goed 10 μL van USA300 of USA300ΔSaer/S supernatant monsters toegevoegd. Zachtjes rotsplaat om supernatanten in Wells te verdelen en te inbroed bij 37 °c.
7. Op de gewenste tijden, verwijder de plaat uit de incubator en plaats op ijs. Voeg 40 μL 0,5% Triton X-100 toe aan de positieve controle goed.
8. Pipetteer de monsters voorzichtig op en neer in elke put om alle PMNs die aan de plaat zijn gehecht volledig uit te trekken en breng de monsters vervolgens over naar flow cytometrie buisjes op ijs met 300 μL ijskoude DPBS met 1 μL propidium jodide.
9. Meet het aandeel propidium iodide-positieve Pmn's met behulp van Flowcytometrie (Figuur 2A). Bij gebonden aan DNA heeft propidium jodide excitatie/emissie bij 535/617 nm.

3. S. aureus cytotoxiciteits test tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten na fagocytose

Opmerking: groeicurves gedefinieerd door de extinctie bij 600 nm (OD₆₀₀) en de concentratie van bacteriën moeten empirisch worden bepaald voor de te onderzoeken S. aureus -stammen voordat deze test begint. Succes van deze experimenten vereist de consistente oogst van gelijke concentraties van elke S. aureus stam getest in de mid-exponentiële groeifase met behulp van de OD₆₀₀ van subgekweekte bacteriën.

1. Start 's nachts culturen van S. aureus stammen en subcultuur bacteriën zoals beschreven in de stappen 2.1.1 en 2.1.2.
2. Oogst ondergekweekte S. aureus wanneer het een mid-exponentiële groei heeft bereikt door 1 ml gekweekte bacteriën over te brengen naar een micro centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeren bij 5.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   NB: onder onze groeiomstandigheden bereikten USA300 en USA300ΔSaer/S een mid-exponentiële groeifase na ongeveer 135 minuten incubatie⁶.
3. Was S. aureus na centrifugeren door het supernatant te opzuigen, de gepelleteerde bacteriën in 1 ml dpbs te resuspenderen, het monster gedurende 30 sec. te centrifugeren en bij kamertemperatuur op 5.000 × g gedurende 5 minuten te centrifuge teren.
4. Opsonize S. aureus door het resuspeniseren van de bacteriële pellet in 1 ml 20% humaan serum verdund met dpbs en incuberen bij 37 ° c met opwinding gedurende 15 minuten.
5. Centrifugeer opsonized bacteriën bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was S. aureus na centrifugeren door het supernatant te zuigen, de gepelleteerde bacteriën opnieuw op te schorten in 1 ml dpbs, en vervolgens het monster te Vortex totdat de bacteriële pellet volledig gebroken is plus een extra 30 seconden. Centrifugeer bacteriën bij 5.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Respenderen opsonized S. aureus stammen in 1 ml rpmi, Vortex het monster totdat bacteriële pellet volledig uiteen is gebroken, en vervolgens voor een extra 30 S. plaats bacteriën op ijs.
7. Verdun opsonized S. aureus stammen tot de gewenste concentratie met IJSKOUDE rpmi. Vortex voor 30 s en plaats op ijs.
8. Bevestig de concentratie van opsonized S. aureus door plating 1:10 seriële verdunningen van bacteriën op tryptische soja agar.
   Opmerking: omdat de verschillen in de concentratie van bacteriën die in deze test worden gebruikt een grote invloed kunnen hebben op de daaropvolgende permeabiliteit van de PMN-plasma membraan (Figuur 3a), is het zeer belangrijk dat de concentratie van elke geteste stam wordt bepaald voor elk experiment en gelijkwaardig is aan de stammen.
9. Voeg voorzichtig 100 μL/goed van elke S. aureus stam of rpmi (voor positieve en negatieve controles) toe aan PMNs in de 96-put plaat op ijs uit stap 1,14. Zachtjes rotsplaat om S. aureus in Wells te verdelen.
10. Synchroniseer fagocytose door de plaat te centrifugeren bij 500 × g gedurende 8 minuten bij 4 °c¹⁵. Incuberen van de plaat bij 37 °C onmiddellijk na het centrifugeren (T = 0).
11. Op de gewenste tijden, verwijder de plaat van de incubator en plaats op ijs. Voeg 40 μL 0,5% Triton X-100 toe aan de positieve controle goed.
12. Pipetteer de monsters voorzichtig op en neer in elke put om alle PMNs die aan de plaat zijn gehecht volledig uit te trekken en breng de monsters vervolgens over naar flow cytometrie buisjes op ijs met 200 μL ijskoude DPB'S met 1 μL propidium jodide.
13. Analyseer monsters voor propidium jodide-kleuring met behulp van flow-cytometrie zoals beschreven in stap 2,9.

Resultaten

We hebben laten zien hoe de hierboven beschreven procedures kunnen worden gebruikt om de cytotoxiciteit van s. aureus te kwantificeren tegen menselijke PMNs met behulp van MRSA PFGE-type USA300 en een isogene deletie Mutant van Saer/s in deze stam (USA300ΔSaer/s) gegenereerd in eerdere studies⁶. PMNs geïsoleerd volgens de procedures beschreven in sectie 1 van dit protocol werden gekleurd met propidium jodide en onderzocht met behulp van Flowcytometrie. Voorwaarts-en zijspreidings plots werden gebruikt om de verontreiniging van gezuiverde pmns door monocyten of lymfocyten (Figuur 1A, B) en PMN-integriteit te illustreren met behulp van propidium jodide-kleuring (Figuur 1C). De beschreven methode van humane PMN-zuivering kan consequent 0,5 x 10⁷ tot 1 x 10⁸ pmns opleveren die > 98% zuiver zijn en > 95% propidium jodide negatief zijn.

De cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300 en USA300ΔSaer/S werd getest tegen gezuiverde PMNs (Figuur 2) volgens de procedures beschreven in punt 2 van dit protocol. Deze experimenten tonen een concentratieafhankelijke toename in de kleuring van propidium jodide van gezuiverde PMNs na 30 minuten intoxicatie met extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300 (Figuur 2B). Eerdere studies hebben aangetoond dat de Saer/S twee-componenten systeem is belangrijk voor de expressie van talrijke bi-component leukocidinen die gericht zijn op menselijke pmns^6,10,11,16. Congruent met deze eerdere bevindingen werden zeer weinig propidium iodide-positieve PMNs gedetecteerd na blootstelling aan extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300ΔSaer/S (Figuur 2B). Verdere experimenten toonden een gestage toename van het aandeel van gelyseerd PMNs na intoxicatie door USA300 extracellulaire eiwitten die na ongeveer 30 minuten (Figuur 2C). Minimale Lysis van humane Pmn's werd opgemerkt op alle tijdpunten na blootstelling aan extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300ΔSaer/S. Deze resultaten illustreren het nut van deze test voor de relatieve kwantificering van cytotoxiciteit door extracellulaire S. aureus eiwitten tegen menselijke PMNs.

We testten USA300 en USA300ΔSaer/s met behulp van de S. aureus cytotoxiciteits test tegen humane pmns na fagocytose dat wordt beschreven in rubriek 3 van dit Protocol (Figuur 3). Een concentratieafhankelijke toename van het aandeel propidium jodide positieve pmns werd waargenomen 90 min na de fagocytose van USA300 (Figuur 3A). Een significante afname werd waargenomen in het aandeel van pmns dat propidium jodide positief was na de fagocytose van USA300ΔSaer/s (Figuur 3A), waarbij andere resultaten werden ondersteund die aangeven dat het Saer/S twee componenten systeembelang rijk is voor de cytotoxiciteit van S. aureus tegen humane pmns (Figuur 2)^7,11 Zoals eerder vermeld en aangetoond in Figuur 3A, hebben verschillen in de concentratie S. aureus een uitgesproken effect op de PMN-lysis na fagocytose. Opsomming van de USA300 en USA300ΔSaer/S entmateriaal gebruikt in elk van deze experimenten aangetoond dat het contrast in de cytotoxiciteit tussen deze stammen niet te wijten aan verschillen in de concentratie van bacteriën gebruikt (Figuur 3B). Deze bevindingen laten zien hoe de s. aureus cytotoxiciteits test tegen humane PMNs na fagocytose kan worden gebruikt om het vermogen van verschillende S. aureus stammen te beoordelen om de integriteit van de humane PMN plasma membraan te compromitteren.

Figuur 1: Flowcytometrie analyse van gezuiverde PMNs. Representatieve Flowcytometrie punten van (A) gezuiverde humane pmn's en (B) pmn's die opzettelijk zijn verontreinigd met perifere bloed mononucleaire cellen. C) representatief Flowcytometrie histogram dat een minimale kleuring van propidium jodide aantoont (< 1%) van gezuiverde PMNs (gearceerd grijs) in vergelijking met PMNs behandeld met 0,05% Triton X-100 (gearceerd rood). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Flowcytometrie analyse van PMNs dronken met extracellulaire eiwitten geproduceerd door S. aureus. A) representatief Flowcytometrie histogram van PMNs gekleurd met propidium jodide na 30 minuten incubatie met media controle (gearceerd blauw), gefilterd USA300 supernatant bij een eindconcentratie van 1:110 (gearceerd grijs), of 0,05% Triton X-100 (gearceerd rood). B) het aandeel propidium jodide-positieve pmns na 30 minuten incubatie met verschillende concentraties van USA300 of USA300 ∆Saer/S -supernatants. C) het aandeel propidium jodide-positieve pmn's na de tijd na incubatie met USA300 of USA300 ∆Saer/S supernatant bij een eindconcentratie van 1:110. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van ten minste 3 afzonderlijke experimenten met * p ≤ 0,05 en * * p ≤ 0,005 zoals bepaald door een tweezijdige t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Flowcytometrie analyse van PMNs na fagocytose van S. aureus. A) het aandeel propidium jodide positieve pmns 90 min na de fagocytose van verschillende concentraties van USA300 of USA300 ∆Saer/S. B) concentratie van opsonized S. aureus stammen die worden gebruikt voor de in panel A. gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van 4 afzonderlijke experimenten met * p ≤ 0,01, zoals bepaald door een tweezijdige t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de zuivering van Pmn's uit menselijk bloed en twee verschillende assays die propidium jodide gebruiken voor het kwantificeren van de cytotoxiciteit van S. aureus tegen deze belangrijke aangeboren immuuncellen. Het succes van deze procedures zal afhangen van de kwaliteit van gezuiverde Pmn's en de juiste bereiding van S. aureus en extracellulaire eiwitten die door dit pathogeen worden geproduceerd. Voor de isolatie van Pmn's is het belangrijk om de PMN-activering tijdens en na de zuivering te minimaliseren door gebruik te maken van reagentia die vrij zijn van endotoxine verontreiniging, celpreparaten zachtjes te behandelen en cellen op de juiste temperatuur te houden. Verschijnselen die duiden op activering van pmn's zijn klonteren van cellen tijdens zuivering en wanneer meer dan 5% van de geïsoleerde cellen positief voor propidium jodide vlek. Vanwege de relatief korte levensduur van Pmn's, moeten deze cellen worden geïsoleerd van menselijk bloed en op dezelfde dag worden getest. PMNs zal beginnen te vertonen tekenen van spontane apoptosis indien achtergelaten op ijs voor meer dan 3 h na zuivering. Zoals eerder vermeld, is het zeer belangrijk dat elke PMN-bereiding zorgvuldig wordt geëvalueerd met behulp van Flowcytometrie analyse van voorwaartse en zijverstrooiing, evenals propidium jodide-kleuring om de zuiverheid en integriteit van geïsoleerde cellen te waarborgen.

De uitdrukking van bi-component leukocidinen door S. aureus is verantwoordelijk voor de meerderheid van de GECOMPROMITTEERDE PMN plasma membraan integriteit, die wordt waargenomen met behulp van de in dit protocol beschreven assays. Variatie in de expressie van deze toxines en andere Pore-vormende peptiden, zoals fenol-oplosbare modulinen, tussen stammen van S. aureus zal verschillen in cytotoxiciteit te produceren tegen menselijke PMNs. significante afwijkingen tijdens in vitro groei tussen S. aureus stammen zullen ook invloed hebben op de expressie van porie vormende toxines en daaropvolgende cytotoxiciteit. Daarnaast heeft de ratio van S. aureus naar PMNs in fagocytose assays een grote invloed op de daaropvolgende permeabiliteit van de PMN plasma membraan(figuur 3a) en deze experimenten vereisen de consistente oogst van gelijke concentraties van elke S. aureus stam getest in de mid-exponentiële groeifase met behulp van de OD₆₀₀ van ondergekweekte bacteriën. Gezien deze overwegingen is het zeer belangrijk om groeicurves te definiëren voor alle stammen die zullen worden onderzocht voordat de cytotoxiciteits testen beginnen. We raden deze methoden voor het analyseren van S. aureus cytotoxiciteit met stammen die significante groeiverschillen in vitro vertonen niet aan.

USA300 is een virulente MRSA-isolaat waarvan bekend is dat het zeer cytotoxisch is tegen humane pmns¹⁵ en het verlies van Saer/S in deze stam vermindert de transcriptie van talrijke bi-component leukocidins die gericht zijn op humane pmns^6,12, waardoor deze stammen ideale modellen zijn voor het vergelijken van cytotoxiciteit met behulp van de beschreven assays. Er is echter uitgebreide genetische variatie tussen verschillende s. aureus isolaten en de parameters die in deze protocollen worden beschreven, mogen niet resulteren in substantiële veranderingen in de cytotoxiciteit tegen menselijke Pmn's bij het testen van andere s. aureus stammen. Het afstemmen van de groeiomstandigheden, volumes van supernatanten toegevoegd, of de verhouding van bacteriën aan pmns kan nodig zijn voor succes met deze methoden met behulp van andere stammen van S. aureus.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container	Baxter	2B1323Q	PMN-zuivering
1.5 mL micro-centrifugebuisjes met Snap Caps	VWR	89000-044	Wordt gebruikt bij het wassen van cellen
1.8% Sodium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	S5150	PMN-zuivering
12x75mm Cultuurbuisjes	VWR	60818-430	Wordt gebruikt als flowcytometriebuisjes
20% (w/w) Dextran	Sigma-Aldrich	D8802	PMN-zuivering
3125 Hand Tally Counter	Traceable Products	3125CC	Voor het tellen van cellen
50 mL conische centrifugeerbuisjes	VWR	89039-656	Voor het uitdelen van media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium	FischerScientific	211823	Voor het kweken van celculturen
BD Wegwerpspuitjes met Luer-Lok Tips, 3 mL	FischerScientific	BD 309657	Voor het filteren van supernatanten
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Celtellingsapparaat
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) met calcium en magnesium	Corning	21-030-CV	Wordt gebruikt bij het wassen van cellen
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN-zuivering
Fisherbrand Steriele polystyreen wegwerpspuiten	FischerScientific	13-678-11E	Voor het afzuiging van vloeistof
Greiner CELLSTAR 96 well platen	Millipore Sigma	M0687	Plaat voor het houden van experimentele monsters
OMICRON Spuitfilters	Omicron Scientific	SFPV13R	Voor het filteren van supernatanten
Propidium jodide	ThermoFisher Scientific	P3566	Membraan ondoorlatende DNA-kleurstof
PYREX Merk 4980 Erlenmeyer kolven	Cole-Parmer	EW-34503-24	Voor het kweken van celculturen
RPMI 1640, 1X zonder L-glutamine, fenol rood	Corning	17-105-CV	Wordt gebruikt bij het resuspenderen van cellen
Steriele water voor irrigatie, USP	Baxter	2F7113	PMN-zuivering
De Pipet Pomp	Bel-Art Products	F37898	Voor het afzuiging van vloeistof
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Positieve controle voor membraanintegriteit