Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Summary

Dit protocol toont real-time registratie van volledige dosis-respons relaties voor agonist-geïnduceerde GPCR activering van een eencellige laag geteeld op een enkele micro-elektrode met behulp van label-vrije impedantie metingen. De nieuwe dosing regeling verhoogt aanzienlijk doorvoer zonder verlies in de tijd resolutie.

Abstract

Label-vrije impedantie-gebaseerde testen worden steeds vaker gebruikt om niet-invasief bestuderen ligand-geïnduceerde GPCR activering in celcultuur experimenten. De aanpak biedt real-time celbewaking met een apparaatafhankelijke tijdsresolutie tot enkele tientallen milliseconden en is sterk geautomatiseerd. Wanneer de steekproefaantallen echter hoog worden (bijvoorbeeld dosisresponsstudies voor verschillende liganden), kunnen de kosten voor de beschikbare elektrodearrays en de beschikbare tijdsresolutie voor sequentiële well-by-well-opnames beperkend worden. Daarom presenteren we hier een seriële agonist toevoeging protocol dat het potentieel heeft om de output van label-vrije GPCR testen aanzienlijk te verhogen. Met behulp van de seriële agonist toevoeging protocol, een GPCR agonist wordt achtereenvolgens toegevoegd in toenemende concentraties tot een enkele cel laag, terwijl voortdurend toezicht op impedantie van het monster (agonist modus). Met deze seriële aanpak is het nu mogelijk om een volledige dosis-responscurve vast te stellen voor een GPCR-agonist uit slechts één enkele cellaag. Het seriële agonist toevoegingsprotocol is van toepassing op verschillende GPCR-koppelingstypen, G_q G_i/0 of G_s en is compatibel met recombinante en endogene expressieniveaus van de onderzochte receptor. Receptor blokkeren door GPCR antagonisten is ook te beoordelen (antagonist-modus).

Introduction

Dit rapport presenteert een gedetailleerde beschrijving van een seriële toevoeging protocol ontwikkeld voor de kwantificering van ligand-geïnduceerde G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) activering in aanhangende cellen door label-vrije impedantie metingen. G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn betrokken bij een veelheid van fysiologische functies en menselijke ziekten¹. Vanwege deze en hun goede toegankelijkheid aan het celoppervlak, GPCRs zijn een van de belangrijkste drug doelen. Deze beoordeling wordt weerspiegeld in een geschat aantal ~ 700 goedgekeurde geneesmiddelen gericht op GPCRs, gelijk aan een ~ 35% aandeel op alle op de markt gebrachte drugs².

De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen omvat twee centrale processen: i) de identificatie en functionele karakterisering van biologische doelmoleculen, en (ii) de ontdekking van nieuwe loodstoffen en hun ontwikkeling tot administrable drugs. In beide processen zijn efficiënte methoden nodig om interacties met drugsengerichtheid en de daaropvolgende biologische downstreamrespons kwantitatief te evalueren. Verschillende stadia van het preklinische geneesmiddelenontwikkelingsproces maken gebruik van verschillende analysemethoden, variërend van biomoleculaire interactiestudies tussen medicijn en doel, over functionele studies over cellen in de cultuur, tot experimenten op uitgesneden orgaanmateriaal of hele dieren. Beide fysiologische betekenis en biologische complexiteit nemen toe van de eerste naar de laatste³. Hoewel het het algemene doel is om dierproeven te minimaliseren, worden farmacologische studies met behulp van geïsoleerde organen van proefdieren of zelfs hele dieren onvermijdelijk geacht om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen volledig te karakteriseren. In termen van analytische uitlezing, orgaan farmacologie studies bieden een distale, integratieve "holistische" functionele respons van de hoogste fysiologische relevantie. Een nadeel van dergelijke experimenten is dat zij om zowel technische als ethische redenen niet verenigbaar zijn met een hoge doorvoerscreening en grotendeels zijn vervangen door studies op basis van in vitro celcultuur⁴.

Methoden om gpcr-activering in celculturen te kwantificeren, omvatten verschillende op etiketten gebaseerde chemische tests, die specifiek tweede boodschappers detecteren, fosforylatietoestand van downstream-signaaleiwitten, transcriptieactivering via bepaalde transcriptiefactoren of ligand-geïnduceerde intracellulaire receptorhandel^4,5. Een nadeel van dergelijke op etiketten gebaseerde tests is de noodzaak om de cellen te etiketteren met mogelijk schadelijke kleurstoffen of radioactieve markers. Dit vereist vaak het uitvoeren van de test als een eindpunt-bepaling voor een blootstelling stijd die moet worden opgegeven a priori. Met behulp van label-gebaseerde eindpunt testen lijdt aan deze zeer beperkte en bevooroordeelde timing van het experiment en het risico dat chemische etiketten en sondes kunnen interfereren met de reguliere celfysiologie - potentieel onopgemerkt door de experimentator.

In de afgelopen jaren zijn labelvrije tests voor het monitoren van GPCR-activatie naar voren gekomen, zoals impedantiegebaseerde technieken of optische methoden die resonante waveguide roosters toepassen^5,6. Etikettering van de cellen is experimenteel niet nodig met deze benaderingen. Aangezien deze fysieke uitlezingen werken op lage amplitude signalen, dergelijke methoden worden beschouwd als niet-invasief, ze zorgen voor continue cel monitoring potentieel in real time en de observatie tijd wordt alleen beperkt door de celcultuur niet door de uitlezing. Vergelijkbaar met uitlezingen van hele organen, label-vrije benaderingen vaak verslag over holistische celreacties, ver stroomafwaarts van receptor activering wanneer de integratie langs het hele signaleringsnetwerk leidt tot tijd-afhankelijke, maar eerder onspecifieke veranderingen in celmorfologie of massa herverdeling. Overwegende dat op impedantie gebaseerde tests de diëlektrische signatuur van veranderingen in celvorm^7,8meten , metingen met behulp van resonerende golfgeleidingsroosters gevoelig zijn voor veranderingen in de brekingsindex op de celsubstraatinterface als gevolg van dynamische massaherverdeling (DMR)⁹. Het integrerende karakter maakt labelvrije methoden uiterst gevoelig voor receptorgemedieerde gebeurtenissen, ongeacht het type(en) van G-eiwit (G_q, G_i/0, G_s, G_12/13) of β-arrestine die betrokken zijn bij de signaleringcascade⁶ en goed geschikt voor eneexpressieniveaus van de receptor.

In een standaard label-vrije impedantie-gebaseerde test de cellen zijn adherently geteeld in multi-well platen met coplanar goud-film elektroden afgezet op de bodem van elke put¹⁰. Deze elektrodearrays zijn verbonden met een impedantieanalyzer en de celreacties op een experimentele stimulus worden geregistreerd vanuit individuele putten door door de tijd opgeloste impedantiemetingen. In een typische GPCR-test wordt een ligand toegevoegd in individueel verschillende concentraties aan elk individu goed. De ligand-geïnduceerde veranderingen in de impedantie tijdcursus worden vervolgens geanalyseerd met betrekking tot karakteristieke curvekenmerken zoals maximale signaalverandering, gebied onder de curve, signaalverandering binnen een bepaald tijdsinterval of helling van de curve op een bepaald tijdspunt, om de potentie en werkzaamheid van de ligand te kwantificeren¹¹.

De kosten van de elektrodearrays kunnen de toepassing van deze techniek beperken in HTS-campagnes (high throughput screening). Bovendien neemt het aantal afzonderlijke metingen toe en vermindert daarmee geleidelijk de beschikbare tijdsresolutie voor elke put - zelfs voor state-of-the-art meerkanaalsopnamen. Onder dergelijke omstandigheden kunnen snelle en voorbijgaande celreacties aan de meting ontsnappen. Bovendien, de conventionele een goed - een concentratie benadering legt een aanzienlijke tijd en kostenfactor op perfused organ-on-chip of body-on-chip ontwikkelingen met betrekking tot hun geschiktheid in ligand-GPCR interactie analyse.

Om deze reden ontwikkelden we een stapsgewijs doseringsprotocol dat het registreren van volledige dosisresponscurven van ligand-geïnduceerde GPCR-activering in gekweekte celmonolagen mogelijk maakt door de impedantie van één enkele put continu te monitoren, terwijl de agonistconcentratie stapsgewijs wordt verhoogd. Het seriële agonist toevoegingsprotocol verhoogt de doorvoer per put aanzienlijk van één concentratie naar 10 of meer concentraties, zoals blijkt uit het huidige voorbeeld van menselijke U-373 MG-cellen, die de histamine 1-receptor (H1R) endoopeerig uitdrukken. Zo heeft de methode het potentieel om de doorvoer in labelvrije dosisresponsstudies aanzienlijk te verbeteren, terwijl de tijdsresolutie op het instrumentele maximum wordt gehandhaafd.

Protocol

1. Celzaaien op elektrodearrays

OPMERKING: Selectie van elektrode lay-out is een afweging tussen gevoeligheid en het aantal cellen in studie. Hoe kleiner de elektrode, hoe gevoeliger is de meting, maar hoe kleiner het aantal cellen dat wordt onderzocht. Voor cellen die in de loop van de tijd sterke impedantieschommelingen vertonen onder basisomstandigheden, hebben grotere of onderling gedigitaliseerde elektroden de voorkeur.

1. Verwarm alle oplossingen die nodig zijn voor standaard celpasseren en zaaien in een waterbad van 37 °C. Voor tests met menselijke U-373 MG cellen duurt het: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium, 0,05% (w/v) trypsine, celkweekmedium (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) aangevuld met 5% (v/v) foetale kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine en 100 μg/mL penicilline/streptomycine).
2. Spoel de cellaag van de voorraadcultuur geteeld op de bodem van conventionele celcultuur kolven of gerechten met PBS tweemaal.
3. Verwijder de PBS, voeg de trypsineoplossing (1 mL voor 25 cm²⁾toe en laat de cellen 5 min bij 37 °C uitbroeden (geldt voor U-373 MG-cellen).
4. Controle voor volledige onthechting van de cellen van de bodem van het groeisubstraat door microscopie.
5. Stop de trypsine reactie zodra de cellen volledig zijn losgemaakt door 9 mL celkweekmedium per 1 mL trypsine toe te voegen aan de celvering. Spoel de resterende cellen voorzichtig van de bodem van het celkweeksubstraat door de suspensie over het substraat te beluchten.
6. Verzamel de celvering met een pipet en breng deze over naar een centrifugeeringsbuis (15 mL of 50 mL buis).
7. Draai de cellen door centrifugeren op 110 x g voor 10 min bij kamertemperatuur.
8. Verwijder voorzichtig de supernatant en breveer de celpellet grondig opnieuw op in kweekmedium voordat u de cellen telt (bijvoorbeeld door een hemacytometer te gebruiken voor fasecontrastmicroscopen en handmatig tellen).
9. Pas de celvering aan op de gewenste celdichtheid. Gebruik voor experimenten met U-373 MG-cellen 100 000 cellen/cm² om een confluente cellaag binnen 48 uur te laten groeien. Dit vertaalt zich in een celdichtheid van 200 000 cellen/mL voor 8-well elektrodearrays met een groeigebied van ~0,8 cm² en een putvolume van 400 μL.
   OPMERKING: Voor reproduceerbare GPCR-activeringsexperimenten moeten cellen worden gekweekt tot confluente monolagen op de elektrodearrays. Om een goede receptorexpressie op het celoppervlak te garanderen, moeten cellen ten minste 36 uur worden ingezaaid voordat het experiment wordt uitgevoerd. Het testen van verschillende celdichtheden voor celzaaien is vaak zinvol om de beste experimentele omstandigheden te identificeren.
10. Voeg de celvering toe aan de putten van de elektrodearray en laat de verkopen 10 – 15 min op kamertemperatuur neerstrijken om een homogene verdeling van cellen op de bodem van de putten te garanderen.
11. Kweek cellen gedurende ten minste 36 uur in een standaard celkweekincubator met 5% CO₂ (afhankelijk van het gemiddelde type) bij 37 °C en bevochtigde atmosfeer. Verander celkweek medium 24 uur voorafgaand aan het experiment.
12. Inspecteer op de dag van het experiment de cellagen op de elektrodearrays door (fasecontrast) microscopie om volledige dekking van elektroden met cellen te garanderen.

2. Evenwicht van cellen in serumvrij medium

1. Verwarm serumvrij medium, in deze studie: Leibovitz's L15 medium.
2. Verwijder celkweekmedium uit cellen die op elektrodearrays worden gekweekt en vervang door voorverwarmde serumvrije medium. Gebruik 200 μL voor elektrodearrays met 8 putten en 150 μL voor 96-well-elektrodearrays.
3. Laat de cellen ten minste 2 uur in serumvrij medium bij 37 °C equilibrate. De evenwichtstijd hangt sterk af van het celtype. U-373 MG-cellen hebben bijvoorbeeld 2 uur nodig, CHO-cellen hebben 4 uur nodig, BAEC kan 's nachts equilibratie in Het L-15 medium vereisen.
   LET OP: Het L-15 medium is CO_{2-onafhankelijk} en vereist een CO_2-vrijeatmosfeer. Voor de equilibratie in L-15 wordt de incubator op 0 % CO₂ingesteld . Equilibratie kan worden gecontroleerd door impedantie metingen, die we aanbevelen om te doen voor de eerste experimenten.

3. Monitoring celequilibratie met impedantiemetingen

1. Plaats de elektrodearray in de verbindingsarrayhouder van de impedantieanalyzer.
2. Zorg voor een goede lage impedantie contact tussen elektroden en impedantie analyzer. Deze controle is individueel verschillend voor verschillende instrumenten.
   OPMERKING: Als het instrument geen verbinding maakt met de elektroden, opent u de contactklem opnieuw, stelt u de elektrodearray voor op de juiste positionering in de houder en probeert u het opnieuw.
3. Selecteer elektrodetype en/of multi-well formaat uit de gebruikersinterface van de software.
4. Stel de meetparameters in. Er zijn verschillende opties beschikbaar.
   OPMERKING: Om de meest gevoelige AC-frequentie te selecteren, verwijzen we naar de literatuur- en instrumenthandleidingen, omdat deze afhankelijk zijn van de lay-out van elektrode en het celtype dat wordt bestudeerd. Meestal is de sensorfrequentie in het bereik van 4 kHz – 50 kHz. Hier werden U-373 MG-cellen gekweekt op cirkelvormige werkende elektroden met een diameter van 250 μm en ze werden gecontroleerd met een AC-frequentie van 12 kHz.
   1. Als er modi voor het verkrijgen van gegevens met één en meerdere frequenties beschikbaar zijn, selecteert u de modus met één frequentie om maximale tijdsresolutie te garanderen. De meting wordt uitgevoerd op deze enkele frequentie. Voor de meest verspreide instrumenten is er een aantal vooraf ingestelde frequenties langs het beschikbare frequentievenster.
   2. Als het aantal onderzochte putten laag is of de tijdresolutie niet van cruciaal belang is, selecteert u in plaats daarvan meerdere frequentie-opnamen. Impedantiemetingen op een bepaald aantal frequenties worden voor elke put geregistreerd voor latere diepgaande analyses.
      OPMERKING: De tijdresolutie neemt af met een toenemend aantal frequenties die per put worden geregistreerd en het toenemende aantal putten. De opties voor de selectie van de frequentie- en gegevensverwervingsmodus variëren per instrumenttype en versie.
5. Start met het verkrijgen van tijdcursusgegevens.
6. Volg de cellaag impedantie (ten minste 2 uur) totdat de impedantie is gestabiliseerd. Bereid ondertussen de agonistoplossingen voor.
7. Wanneer de cellagen een stabiel impedantieniveau hebben bereikt, gaat u (i) naar de toevoeging van de seriële agonist binnen hetzelfde experiment of (ii) de gegevensverwerving te beëindigen en start u een nieuwe gegevensset voor het monitoren van agonist-geïnduceerde receptoractivering.

4. Voorbereiding van agonist oplossingen voor experimenten in agonist modus

1. Bereken de concentratie van agonist oplossingen als dat nodig is voor elke stap van seriële doseren volgens vergelijking (1). n varieert van 1 tot het totale aantal seriële toevoegingen i. x duidt op concentratie en volume in de put bij stap n. y duidt op concentratie en volume van de "toe te voegen oplossing" in stap n.

OPMERKING: Houd rekening met het aantal replica's en bereken het totale volume van "oplossing-toe te voegen" voor elke concentratiestap. De resultaten van een typische berekening worden gegeven in tabellen 1-4. Er is een algemeen idee nodig over het agonistconcentratiebereik dat moet worden bestudeerd, aangezien het bereik de concentraties en het aantal porties definieert dat moet worden toegediend tijdens de seriële toevoeging. Met behulp van de seriële agonist toevoeging protocol de agonist concentratie wordt stapsgewijs verhoogd. Daarom moet rekening worden gehouden met de hoeveelheid agonist die al in de put zit wanneer de volgende dosis wordt toegevoegd. Wanneer het aantal agonistmoleculen dat al in de put aanwezig is n_x = c_x ∙V_x (met de huidige concentratie c_x x en volume V_x)en het aantal moleculen in de put na de volgende toevoeging n_x+yis, wordt het aantal moleculen dat moet worden toegevoegd n_y bepaald door de concentratie c_y en volume V_y van de oplossing die op de put moet worden toegepast (n_y = c_y ∙ V_y). Na het toevoegen van een deel van agonist, de nieuwe hoeveelheid agonist moleculen in de put is: c_{x +y} ∙ V_x+y = c_x ∙ V_x + c_y ∙ V_y. Deze berekening geldt voor elke volgende stap. Vanwege de onderlinge afhankelijkheid van agonist concentratie in de put en de hoeveelheid agonist in de porties worden toegevoegd met elke stap, is het belangrijk om de uiteindelijke concentraties te definiëren na elke stap van tevoren.

Modus 1: Het volume in de put zal toenemen met elke stap als vloeistof continu wordt toegevoegd.
Gebruik deze modus en een 8-put formaat, gebruik V_x1 = 200 μL en V_{y1 ....} V_yi = 30 μL.

Modus 2: Het volume in de put is constant als het volume toegevoegd bij elke stap wordt verwijderd net voor de daaropvolgende toevoeging.
Gebruik deze modus en een 96-well formaat, gebruik V_x1 = 150 μL en V_{y1 ....} V_yi = 75 μL.

2. Druk het gegevensblad af met het totale volume per concentratie en gedetailleerde instructies voor pipet.
3. Bereid alle oplossingen in het vereiste bedrag voor. Maak alle agonist oplossingen in hetzelfde serumvrije medium als gebruikt voor de equilibratie van de cellen.
   LET OP: Histamine dihydrochloride wordt beschouwd als gevaarlijk door de OSHA Hazard Communication Standard 2012 (29 CFR 1910.1200). Histamine veroorzaakt huidirritatie, ernstige oogirritatie, kan leiden tot een allergische huidreactie, allergie, astma symptomen of ademhalingsproblemen bij inademing en kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Houd rekening met het veiligheidsinformatieblad.
   LET OP: Maak agonist oplossingen zo vers mogelijk. De stabiliteit van agonisten in oplossing kan aanzienlijk variëren. Bewaar oplossingen op 4 °C of lager tot gebruik in het experiment. Voor sommige moleculen kunnen extra stabiliserende additieven, zoals BSA bij het gebruik van op peptiden of lipide gebaseerde moleculen, worden overwogen om adsorptie aan de wanden van putten en buizen te voorkomen.
4. Als u het experiment uitvoert in een 96-well-formaat, brengt u oplossingen over naar een conventionele 96-putplaat (geen elektroden) en gebruikt u een 8- (of 12-) kanaalleiding voor snelle vloeistofoverdracht naar de elektrodearray.

5. Voorbereiding van agonist oplossingen voor experiment in antagonist modus

LET OP: Bereid de antagonistoplossing(en) voor met de concentratie die overal moet worden toegepast. Volume en concentratie van antagonistoplossing zijn afhankelijk van de wijze van toevoeging van agonist (1 of 2). Voorbeelden voor experimenten in 8-well of 96-well formaat in toevoeging modus 2: (A) 8-well formaat (V_x1 = 200 μL, V_Antagonist = 200 μL); (B) 96-well formaat (V_x1 = 150 μL, V_Antagonist = 75 μL).

1. Bereken de concentratie van elke agonist oplossing die nodig is voor elke stap van serie doseren zoals beschreven in stap 4.1.
2. Maak alle agonist oplossingen in hetzelfde serum-vrije medium als gebruikt voor de equilibratie van de cellen en voeg de antagonist op dezelfde uiteindelijke concentratie als gepland voor de respectieve putten in het experiment.
   LET OP: In dit geval wordt de histamine stock oplossing (10 mM) bereid in L-15 medium. Wanneer agonisten worden opgelost in andere oplosmiddelen (bijvoorbeeld dimethylsulfoxoïde (DMSO), ethanol), moet een oplosmiddelcontrole worden opgenomen om rekening te houden met de toenemende oplosmiddelbelasting bij elke stap van toevoeging.

6. Het uitvoeren van het seriële toevoegingsprotocol in agonist-modus

1. Start gegevensverwerving zoals beschreven in de stappen 3.1 – 3.5.
2. Verwarm de agonist oplossingen voor gebruik voor door ze ongeveer 10 – 15 minuten voor optetellen in de couveuse te plaatsen.
   OPMERKING: Bij het gebruik van thermo-labile stoffen mogen de oplossingen niet te lang bij 37 °C worden bewaard. Als vooropwarming voor 10 – 15 minuten als kritiek wordt beschouwd, brengt u kort voor toevoeging in een waterbad oplossingen tot 37 °C.
3. Voer de agonist seriële dosing uit die afhankelijk is van de geselecteerde toevoegingsmodus. Volgende modus 1 neemt het totale volume in de put toe met elke toevoeging van de volgende dosis. In modus 2 wordt hetzelfde volume dat bij elke stap wordt toegevoegd ook weer verwijderd vlak voordat de volgende hogere dosis wordt toegevoegd.
   OPMERKING: Tijd die nodig is voor de equilibratie van de cellaag tussen twee daaropvolgende agonist doses is afhankelijk van de reactietijd van de cellen. Een eerste experiment in parallelle modus (één put – één concentratie) onthult (i) celresponstijden voor verschillende agonistconcentraties en (ii) de meest gevoelige curveparameter (bijvoorbeeld impedantie maximum, impedantie na verloop van tijd x).

A: Mode 1 / 8-well formaat

1. Voeg 30 μL van de eerste oplossing met de laagste concentratie agonist toe aan de cellen die in 200 μL serumvrij medium zijn geëquilibreerd.
2. Laat de cellen reageren en equilibrate voor de vooraf gedefinieerde periode van tijd (bijvoorbeeld 15 min).
3. Voeg 30 μL van de tweede oplossing toe met de volgende hogere concentratie.
4. Herhaal stap 6.3.1-6.3.3 met de derde, vierde, enzovoort, agonist oplossing.
   OPMERKING: Werken met 10 concentratiestappen zal resulteren in een totaal volume van 500 μL aan het einde van het experiment, dat net onder het maximaal toepasselijke volume van deze putten van ~ 550 μL ligt.

B: Mode 2 / 96-well formaat

OPMERKING: Pauzeer het verzamelen van gegevens tijdens elke liquid handling stap (optellen/verwijderen) via de software van het impedantie-instrument bij het uitvoeren van experimenten in 96-well formaat. De meer uitgebreide vloeistofafhandeling kan de gegevensverwerving verstoren. Gebruik een meerkanaals pipet.

1. Het verkrijgen van gegevens onderbreken.
2. Voeg 75 μL van de eerste oplossing met de laagste concentratie agonist toe aan de cellen die zijn geëquilibreerd in 150 μL serumvrij medium.
3. Hervat het verzamelen van gegevens.
4. Laat de cellen reageren en equilibrate voor de vooraf gedefinieerde periode van tijd (bijvoorbeeld 15 min).
5. Ongeveer 1 – 2 minuten voordat de reguliere evenwichtstijd eindigt, pauzeer de meting en verwijder 75 μL uit elke put.
   OPMERKING: Het tijdstip waarop de oplossing moet worden verwijderd, is afhankelijk van het aantal evenhoge putten en de pipettersnelheid. Tijd die nodig is voor het verwijderen van de oplossingen mag niet hoger zijn dan de tijd tussen de volgende stappen.
6. Voeg 75 μL van de tweede oplossing toe met de volgende hogere concentratie en hervat de meting.
7. Herhaal stap 6.3.8-6.3.10 met de derde, vierde, enzovoort, agonist oplossing.

7. Het uitvoeren van het seriële bijtellingsprotocol in de antagonistmodus

1. Start de meting zoals beschreven in de stappen 3.1 – 3.5.
2. Bereid tijdens de equilibratie van de cellagen een antagonistoplossing voor (bijvoorbeeld 200 μL van 1,5 μM difenhydraminehydrochloride in L15-medium).
   LET OP: Difenhydramine hydrochloride heeft potentiële acute gezondheidseffecten. Het is schadelijk bij inslikken of ingeademd, kan oog- en huidirritatie veroorzaken. Het kan irritatie van de luchtwegen en het spijsverteringskanaal veroorzaken. Houd rekening met het veiligheidsinformatieblad.
3. Verwarm de antagonist- en agonistoplossingen voor door ze ongeveer 10 – 15 minuten in de couveuse te plaatsen voordat ze de celculturen versterken (zie 6.2). Als antagonistvrije putten ook in de test zijn opgenomen, ook pre-warm serumvrij medium.
4. Voeg de antagonistoplossing toe aan de aangewezen putten. Laat de cellen 15 – 20 min met antagonist equilibrate. Als antagonistvrije putten zijn opgenomen, voeg dan hetzelfde volume serumvrij medium toe aan deze putten.
5. Volgens antagonist toevoeging in modus 2,verwijder oplossing uit de putten
   (A) 8-well formaat (200 μL)
   (B) 96-well formaat (75 μL)
6. Voer de agonist toevoeging sing volgorde zoals beschreven in stap 6.3.

8. Uitvoer en analyse van gegevens

1. Exporteer gegevens met behulp van de software van het impedantie-instrument om alle geregistreerde gegevens van eigen gegevens om te zetten in gemeenschappelijke gegevensformaten (bijvoorbeeld csv). Deze stap maakt het mogelijk voor gegevens reorganisatie en presentatie met andere software pakketten.
2. Laad de csv-geformatteerde gegevens naar wetenschappelijke data-analysesoftware.
3. Normaliseer impedantiewaarden door de impedantie van het laatste gegevenspunt af te trekken vóór de eerste toevoeging van agonist-oplossing en door de tijd van toevoeging aan t = 0 in te stellen. Plot de tijdsloop van genormaliseerde impedantie.
4. Plot de individuele tijdcursussen en identificeer de maxima in impedantie na elke toevoegingstap. Stel een gegevensblad samen met deze waarden.
5. Plot de waarden van maximale (of minimum, indien van toepassing) impedantie veranderingen als een functie van agonist concentratie. Dit kan worden gedaan voor individuele putten of voor de gemiddelden (gemiddelde ± SD).
6. Gebruik een gegevensmontageroutine om de halfmaximale effectieve concentraties (EC₅₀₎en maximale respons (E_Max)te bepalen met behulp van het logistieke model met vier parameters (vergelijking 2):

OPMERKING: c geeft de agonistconcentratie aan, A₁ is het minimum en A₂ is het maximale asymptoat van de sigmoïdale dosisresponscurve (A₂ = E_Max). EC₅₀ is de concentratie op het buigpunt van de curve, en n komt overeen met de helling van de heuvel.

Results

Een typisch schema voor de voorbereiding van de verschillende agonist oplossingen wordt getoond voor een experiment met behulp van 8-goed elektrode arrays met histamine als agonist in tabellen 1-4. Tabel 1 en tabel 2 bevatten volumes en concentraties voor een experiment met toevoegingsmodus 1 (zie figuur 1),terwijl tabel 3 en tabel 4 volumes en concentraties presenteren voor een experiment n...

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode voor labelvrije impedantiemetingen om de dosisresponsrelatie van agonist-geïnduceerde GPCR-activering te bepalen bij afwezigheid of aanwezigheid van specifieke antagonisten voor dezelfde receptor. Het proof of concept van deze methode werd gepresenteerd in een recente publicatie¹². Voor zover wij weten is het de eerste studie die de oprichting beschrijft van een volledige dosisresponscurve van agonist-gemedieerde GPCR-activering met behulp van een eencellige laa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker tellingkamer	Marienfeld (Lauda-Königshofen, Duitsland)	640210
celkweekkolven 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Duitsland)	690175
Cel incubator (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Duitsland)	\
Centrifuge (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Duitsland)	\
Diphenhydramine hydrochloride	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Duitsland)	D3630
Eagle's Minimum Essential Medium met 4,5 g/L D-Glucose en 2,2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Duitsland)	D5671
Impedantie Instrument (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET-basis met 0,049 mm2 werkelektrode en ~50 mm2 tegenelektrode (goud)
96-well electrode arrays (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET-basis met twee elektroden (goud) met 0,256 mm2 totale elektrodeoppervlak
Foetaal kalfs serum (FCS)	Biochrom (Berlijn, Duitsland)	S0615
Histamine dihydrochloride	Carl Roth (Karlsruhe, Duitsland)	4017.1
Laminaire stromingshaak (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Duitsland)	51022515	klasse II veiligheidscabinet
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Duitsland)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Duitsland)	G7513
Micropipette groot (100 - 1000 µL)	Brandt (Wertheim, Duitsland)	704780
Micropipette groot (20 - 200 µL)	Brandt (Wertheim, Duitsland)	704778
Microscoop (fase contrast, Nikon Diaphot)	Nikon (Düsseldorf, Duitsland)
Penicilline/streptomycine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Duitsland)	P0781
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Duitsland)	D8537
Pipet, serologisch	Greiner bio-one (Frickenhausen, Duitsland)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Duitsland)	26300
Trypsine	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Duitsland)	T4174	in PBS met 1 mM EDTA
Buis, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Duitsland)	188 271
Buis, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Duitsland)	210 261
U-373 MG cellen	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
waterbad (TW21)	Julabo (Seelbach, Duitsland)	\