We presenteren een protocol voor de isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale kam afgeleide vet-afgeleide stamcellen (NCADSCs) uit de periaortische vetweefsel van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ muizen. De NCADSCs kunnen een gemakkelijk toegankelijke bron van ADSCs voor het modelleren van adipogenese of lipogenese in vitro.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale crest originele vet-afgeleide stamcellen uit periaortic vetweefsel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een overmatige hoeveelheid vetweefsel rond de bloedvaten (perivasculair vetweefsel, ook bekend als PVAT) wordt geassocieerd met een hoog risico op hart- en vaatziekten. Adscs afgeleid van verschillende vetweefsel tonen verschillende kenmerken, en die van de PVAT zijn niet goed gekarakteriseerd. In een recente studie, rapporteerden we dat sommige ADSCs in de periaortische boog vetweefsel (PAAT) afstammen van de neurale crest cellen (NCCs), een voorbijgaande populatie van migrerende cellen afkomstig uit het ectoderm.
In dit artikel beschrijven we een protocol voor het isoleren van rode fluorescerende eiwitten (RFP)-gelabelde NCCs van de PAAT van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ muizen en het opwekken van hun adipogene differentiatie in vitro. Kortom, de stromal vasculaire fractie (SVF) is enzymatisch gescheiden van de PAAT, en de RFP+ neuralcrest afgeleide ADSCs (NCADSCs) worden geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). De NCADSCs onderscheiden zich in zowel bruine als witte adipocyten, kunnen worden cryopreserved, en behouden hun adipogene potentieel voor ~ 3-5 passages. Ons protocol kan genereren overvloedige ADSCs uit de PVAT voor het modelleren pvat adipogenese of lipogenese in vitro. Zo kunnen deze NCADSCs een waardevol systeem bieden voor het bestuderen van de moleculaire schakelaars die betrokken zijn bij PVAT-differentiatie.
Inleiding
De prevalentie van obesitas neemt wereldwijd toe, wat het risico op gerelateerde chronische ziekten, waaronder hart- en vaatziekten en diabetes1, verhoogt. PVAT omringt bloedvaten en is een belangrijke bron van endocriene en paracrine factoren die betrokken zijn bij vasculatuur functie. Klinische studies tonen aan dat een hoog PVAT-gehalte een onafhankelijke risicofactor is van hart- en vaatziekten2,3, en de pathologische functie ervan hangt af van het fenotype van de van bestanddelen afgeleide stamcellen (ADSCs)4.
Hoewel ADSC-cellijnen zoals de murine 3T3-L1, 3T3-F442A en OP9 nuttige cellulaire modellen zijn om adipogenese of lipogenese5te bestuderen, verschillen de regulerende mechanismen voor adipogenese tussen cellijnen en primaire cellen. De ADSCs in de stromal vasculaire celfractie (SVF) rechtstreeks geïsoleerd van vetweefsel en ertoe aangezet om zich te onderscheiden in adipocyten waarschijnlijk samenvatten in vivo adipogenese en lipogenese6. Echter, de kwetsbaarheid, drijfvermogen, en de variaties in grootte en immunophenotypes van de ADSCs maken hun directe isolatie uitdagend. Bovendien kunnen de verschillende isolatieprocedures ook een aanzienlijke invloed hebben op het fenotype en het adipogene potentieel van deze cellen7,waardoor de nadruk wordt gelegd op de noodzaak van een protocol dat de ADSC-integriteit handhaaft.
Vetweefsel wordt meestal geclassificeerd als ofwel de morfologische en functioneel onderscheiden wit vetweefsel (WAT), of de bruine vetweefsel (BBT)8, die verschillende ADSCs herbergt9. Terwijl ADSCs geïsoleerd van perigonadale en inguinal onderhuidse WAT's zijn gekenmerkt in eerdere studies9,10,11,12, minder bekend is met betrekking tot de ADSCs van PVAT die voornamelijk bestaat uit BAT13.
In een recente studie, vonden we dat een deel van de ingezetene ADSCs in de periaortische boog vetweefsel (PAAT) zijn afgeleid van neurale crest cellen (NCCs), een voorbijgaande populatie van migrerende voorlopercellen die afkomstig zijn van de ectoderm14,15. Wnt1-Cre transgene muizen werden gebruikt voor het traceren van neurale crest cel ontwikkeling16,17. We staken Wnt1-Cre+ muizen over met Rosa26RFP/+ muizen om Wnt-1 Cre+/-te genereren; Rosa26RFP/+ muizen, waarin NCC's en hun nakomelingen zijn gelabeld met rood fluorescerend eiwit (RFP) en gemakkelijk in vivo en in vitro15worden bijgehouden. Hier beschrijven we een methode voor het isoleren van neurale kam afgeleide ADSCs (NC-afgeleide ADSCs, of NCADSCs) van muis PAAT en induceren de NCADSCs om zich te onderscheiden in witte adipocyten of bruine adipocyten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het dierenprotocol is herzien en goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Shanghai Jiao Tong University.
1. Generatie wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Muizen
- Cross Wnt-1 Cre+/- muizen16 met Rosa26RFP/+ muizen18 om Wnt-1 Cre+/-te genereren ; Rosa26RFP/+ muizen. Huismuizen onder een licht/donkere cyclus van 12 uur in een pathogene vrije faciliteit bij 25 °C en 45% vochtigheid tot ze 4-8 weken oud zijn.
2. Dissectie van de PAAT
LET OP: Zie figuur 1.
- Steriliseer alle chirurgische gereedschappen (bijvoorbeeld chirurgische schaar, standaard tangen en microchirurgische scharen en tangen) door autoclaving bij 121 °C gedurende 30 min.
- Bereid het spijsverteringsmedium (High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] met 2 mg/mL collagenase type I). Bereid het kweekmedium (HDMEM met 10% foetaal runderserum [FBS] en 1% v/v penicilline-streptomycine [PS]). Steriliseren met behulp van een 0,22 μm spuitfilter voor gebruik.
- Steriliseren van de celcultuur reagentia met behulp van UV, ethanol, filtratie, of stoom, indien van toepassing.
- Bereid een petrischaaltje met Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) en een 15 mL conische buis met 10 mL HBSS aangevuld met 1% v/v PS-oplossing. Hou beide op ijs.
- Verdoven de muizen15 met isoflurane en offer door cervicale dislocatie. Dompel de lichamen onder in een beker gevuld met 75% alcohol (200 mL) gedurende 5 min om het huidoppervlak te steriliseren.
- Knip en scheid de huid op de buik en snijd langs de ventrale middellijn van het bekken naar de nek. Open de buik en beweeg de lever om het middenrifbloot te leggen 19.
- Snijd het middenrif en de ribben aan beide zijden van de middellijn en bloot het hart en de longen door peeling terug de ribben.
- Verwijder de long en thymus en extract van de PAAT samen met de aorta en het hart.
- Snijd de aorta bij de aortawortel af om het hart te verwijderen. Maak een snede tussen de aortaboog en dalende aorta en zorgvuldig scheiden van de vetweefsel rond beide structuren en de linker en rechter gemeenschappelijke halsslagaders van de achterste borstwand. Breng het weefsel naar de ijskoude HBSS-buffer in de petrischaal.
- Met behulp van steriele tangen, verwijder zo veel van de vasculatuur (bijvoorbeeld, aorta, gemeenschappelijke halsslagaders, en andere kleine vasculatuur) en fascia mogelijk, en breng het vetweefsel in de 2 mL Eppendorf buizen bevatten 0,5 mL ijskoude HBSS buffer op ijs.
3. Isolatie van de SVF
Verzamel de PAAT van 5-6 muizen in één microcentrifugebuis van 2 mL met 1 mL vers bereid spijsverteringsmedium en hak het weefsel af met een chirurgische schaar in een Eppendorf-buis bij kamertemperatuur (RT).
- Breng het mengsel over in 50 mL buizen met 9 mL van het spijsverteringsmedium. Homogeniseren van de weefsels door op en neer te paien met een 1 mL pipet 10x.
- Incubeer de buizen bij 37 °C met constant schudden bij 100 tpm gedurende 30-45 min en controleer elke 5-10 min om overdigestie te voorkomen. Dit is van cruciaal belang voor het verbeteren van de levensvatbaarheid en opbrengst van de cellen.
OPMERKING: Goede weefselvertering zal resulteren in een homogeen, licht geel vetweefsel dat zichtbaar is voor het blote oog bij het zachtjes wervelen van de buis. - Stop de spijsvertering door 5 mL HDMEM toe te voegen met 10% FBS en 1% v/v PS bij RT en meng goed door te beknipetteren.
- Centrifugeer de celvering op 500 x g gedurende 5 min bij RT. De SVF zal zichtbaar zijn als een bruinachtige pellet. Trek de drijvende adipocyten voorzichtig aan en decanterde de resterende supernatant zonder de SVF te storen. Los de SVF-pellet op in 10 mL kweekmedium en filter door een 70 μm celzeef.
- Centrifugeer de celvering bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant en breg de pellet voorzichtig opnieuw op in 5 mL erythrocyte lysebuffer in een conische buis van 15 mL gedurende 10 min bij RT.
- Stop de reactie door 10 mL 1x PBS met 1% FBS toe te voegen. Centrifugeer de celvering bij 500 x g voor 5 min bij 4 °C, verwijder de supernatant en bredig de pellet opnieuw op in 10 mL van 1x PBS met 1% FBS.
- Centrifugeer de cellen opnieuw bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder de supernatant en breg de pellet opnieuw op in 5 mL kweekmedium in een conische buis van 15 mL bij 4 °C.
- Na een laatste ronde van centrifugatie (500 x g voor 5 min bij 4 °C), resuspendde de pelleted cellen in 5 mL facs buffer (PBS met 10% FBS, 100 eenheden/mL DNA I, en 1% v/v PS) op ijs, en tel de cellen met een hemocytometer.
4. Isolatie van ncadscs door FACS
- De celsorteerder instellen en optimaliseren volgens de handleiding. Selecteer het mondstuk van 100 μm, steriliseer de inzamelbuizen, installeer het vereiste inzamelapparaat en stel de zijstromen20in.
- Een 561 nm geel/groene laser en optische filter 579/16 worden aanbevolen voor het sorteren van RFP+ cellen. Voer de compensatie uit met behulp van de negatieve controle en de single-gekleurde positieve controles. Zie figuur 2A voor de gatingregeling.
- Filtreer de cellen door een zeef van 40 μm, centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min en breg de cellen opnieuw op in 2 mL FACS-buffer met een dichtheid van 0,5-1 x 107/mL. Breng de cellen over naar duidelijk gelabelde 5 mL ronde bodem polystyreen buizen, en belasting in de sorteerder.
- Voer de experimentele monsterbuis uit bij 4 °C, schakel de afbuigplaten in en sorteer in een conische buis van 15 mL die voorbekleed is met RPMI met 1% FBS en 1% v/v PS.
OPMERKING: Bescherm de monsters tegen sterk licht om RFP-blussing te minimaliseren.
5. Cultuur van ncadscs
- Beschik de gesorteerde cellen met een dichtheid van 5.000 cellen/cm2 in een 12-putkweekplaat in volledig kweekmedium en uitbroed bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 gedurende 20-24 uur.
- Verwijder het kweekmedium, was de cellen met voorverwarmde (37 °C) PBS om celvuil te verwijderen en voeg vers kweekmedium toe.
- Zodra de cellen 80-90% confluent zijn, vertreer de monolayer met behulp van een 0,25% trypsinEDTA-oplossing bij 37 °C in een couveuse voor 3-5 min en neutraliseer met 2 mL kweekmedium.
- Centrifugeer de geoogste cellen gedurende 15 min bij 250 x g bij RT, verwijder de supernatant en breg de cellen opnieuw op in 1 mL kweekmedium. Tel de cellen met een hemocytometer.
- Zaai de cellen in een 12 put kweekplaat met een dichtheid van 5.000 cellen/cm2.
- Resuspend de resterende cellen in kweekmedium met 10% DMSO, bevriezen en opslaan in vloeibare stikstof.
6. Adipogene inductie van NCADSCs
- Induceren adipogene differentiatie van de NCADSCs op 80-90% samenvloeiing en standaard cultuur voorwaarden21.
- Voor bruine adipogene inductie, eerst de behandeling van de gekweekte cellen met bruine adipogene inductie medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1μM/L dexamethason, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, en 1 μg/mL insuline) voor 2 dagen. Was de cellen met PBS 2x en vervang door vers medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine en 1 μg/mL insuline). Verander dit medium om de 2 dagen voor een totaal van 3-5x.
- Voor witte adipogene inductie, eerst de behandeling van de cellen met witte adipogene inductie medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L dexamethason, en 1 μg/mL insuline) gedurende 2 dagen. Was de cellen met PBS 2x en vervang door vers medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS en 1 μg/mL insuline). Verander dit medium om de 2 dagen voor een totaal van 3-5x.
- Analyseer de adipogene cellen waar nodig.
LET OP: Wees voorzichtig bij het wassen van de cellen met PBS. Gedifferentieerde adipocyten kunnen gemakkelijk wegspoelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het hierboven beschreven protocol hebben we ~0,5–1,0 x 106 ADSCs van 5-6 Wnt-1 Cre+/-verkregen; Rosa26RFP/+ muizen (48 weken oud, mannelijk of vrouwelijk).
Het stroomdiagram van de verzameling PAAT van muizen wordt weergegeven in figuur 1. De morfologie van de NCADSCs was vergelijkbaar met de ADSC van andere muizen vetweefsel. De gekweekte NCADSCs bereikt 80-90% samenvloeiing na 7-8 dagen van de cultuur, en de NCADSC...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie presenteren we een betrouwbare methode voor de isolatie, cultuur en adipogene inductie van NCADSCs uit de PVAT van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgene muizen ontworpen om RFP+ ADSCs te produceren. Uit eerdere rapporten blijkt dat er geen significant verschil is in de expressie van algemene multipotente mesenchymale stamcellen (MPC's) in NCADSCs en niet NCADSCs22, en dat NCADSCs een sterk potentieel hebben om zich te onderscheiden in adipocyten in vit...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
National Key R&D-programma van China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) en Science and Technology Commission van shanghai Gemeente (17411971000, 17140902402) verstrekten de fondsen voor deze studie .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% werkconcentratie |
| Anti-cebp/& ;alpha; | ABclonal | A0904 | 1:1000 werkconcentratie |
| Anti-mouse IgG, HRP-gekoppeld | CST | 7076 | 1:5000 werkconcentratie |
| Anti-perilipine | Abcam | AB61682 | 1 µg/mL werkconcentratie; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 µg/mL werkconcentratie |
| Anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld | CST | 7074 | 1:5000 werkconcentratie |
| Anti-β-Tubuline | CST | 2146 | 1:1000 werkconcentratie |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL werkconcentratie; lot #: 0536C008 |
| Collageenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM werkconcentratie |
| Erytrocyt Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL werkconcentratie; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM werkconcentratie |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 µg/mL werkconcentratie |
| Microchirurgische pincet | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microchirurgische schaar | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O-oplossing | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% werkconcentratie |
| PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicilline-Streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagenskit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ muizen | JAX | No.007909 | C57BL/6 achtergrond; mannelijk en vrouwelijk |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 µM werkconcentratie |
| Standaard pincet | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Chirurgische schaar | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM werkconcentratie |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox muizen | JAX | No.009107 | C57BL/6 achtergrond; mannelijk en vrouwelijk |
Referenties
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200(2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886(2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026(2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546(2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206(2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
