Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie

Liangfei Niu; Cong Wang; Kaile Zhang; Miaomiao Kang; Rui Liang; Xiaonan Zhang; Bo Yan

doi:10.3791/60698

Methodenartikel

Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie

DOI:

10.3791/60698

⸱

9 januari 2019

Liangfei Niu¹ , Cong Wang¹ , Kaile Zhang¹^,² , Miaomiao Kang¹^,² , Rui Liang¹ , Xiaonan Zhang¹ , Bo Yan¹

¹Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, ²School of Life Sciences, Bengbu Medical College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een techniek voor het visualiseren van macrofaag gedrag en overlijden in embryonale zebravis tijdens infectie met Mycobacterium de . Stappen voor de bereiding van bacteriën, infectie van de embryo's, en intravital microscopie zijn opgenomen. Deze techniek kan worden toegepast op de observatie van cellulaire gedrag en overlijden in soortgelijke scenario's met betrekking tot infectie of steriele ontsteking.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuun Celgedrag als gevolg van de transparante aard en het vertrouwen uitsluitend op zijn aangeboren immuunsysteem tijdens de vroege ontwikkeling. De zebravis Mycobacterium de (M. de) infectie model is goed opgericht in het bestuderen van gastheer immuunrespons tegen mycobacteriële infectie. Er is gesuggereerd dat verschillende macrofaag celdood types zal leiden tot de diverse uitkomsten van mycobacteriële infectie. Hier beschrijven we een protocol met behulp van intravital microscopie te observeren macrofaag celdood in zebravis embryo's na M. de infectie. Zebravis transgene lijnen die specifiek labelen macrofagen en neutrofielen zijn geïnfecteerd via intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde M. de in ofwel de veroorzaakt of de romp. Besmette zebravis embryo's worden vervolgens op laag smelt agarose gemonteerd en waargenomen door confocale microscopie in X-Y-Z-T afmetingen. Omdat langdurig Live beeldvorming een laag Laser vermogen vereist om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen, wordt een sterk uitgesproken transgene aanbevolen. Dit protocol vergemakkelijkt de visualisatie van de dynamische processen in vivo, met inbegrip van immuuncelmigratie, gastheer pathogeen interactie, en celdood.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacteriële infectie is aangetoond dat gastheer immuuncel overlijden¹. Bijvoorbeeld, een verzwakte stam zal leiden tot apoptosis in macrofagen en de infectie bevatten. Een virulente stam zal echter leiden tot lytische celdood^{, waardoor}bacteriële verspreiding^1,2. Gezien de impact van deze verschillende soorten celdood op host anti-mycobacteriële respons, is een gedetailleerde observatie van macrofaag celdood tijdens mycobacteriële infectie in vivo nodig.

De conventionele methoden voor het meten van celdood zijn het gebruik van dode celvlekken, zoals annnexi....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis werd onder standaardomstandigheden opgevoed in overeenstemming met de richtlijnen van het laboratorium dier voor ethische toetsing van dierenwelzijn (GB/T 35823-2018). Alle zebravis experimenten in deze studie werden goedgekeurd (2019-A016-01) en uitgevoerd bij Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.

1. M. de -inoculum-voorbereiding met één cel (Figuur 1)

Ontdooien Cerulean-fluorescerende M. de glycerol voorraad van-80 °c en inoculeren een 7h10 agar plaat met 10% (v/v) oadc, 0,25% glycerol en 50 μg/ml hygromycine. Incuberen de plaat bij 32 °C gedurende onge....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium infectie kan leiden tot verschillende gastheer reacties op basis van de routes van de infectie. In dit protocol worden zebravis-embryo's geïnfecteerd door intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde bacteriën in de midhersenen of romp (Figuur 3) en waargenomen door confocale Live beeldvorming. Infectie via deze twee routes zal lokaal de infectie waardoor aangeboren immuuncelwerving en daaropvolgende celdood beperken.

Het visualiseren v.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de visualisatie van macrofaag sterfte tijdens mycobacteriële infectie. Op basis van factoren zoals de integriteit van het celmembraan, kan infectie gedreven celdood worden onderverdeeld in apoptosis en lytische celdood²⁴^,²⁵. Lytic Cell Death is meer stressvol voor het organisme dan apoptosis, omdat het een sterke ontstekingsreactie veroorzaakt, ²⁴^,²⁵. Observatie van lytische celdoo.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Dr. zilong Wen voor het delen van zebravis stammen, Dr. Stefan oehlers en Dr. David Tobin voor het delen van M. de gerelateerde middelen, yuepeng hij voor hulp in de voorbereiding van de figuur. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), het uitstekende opleidingsprogramma voor jongeren van Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) en het open fonds van Shanghai Key Laboratory of tuberculose (2018KF02) (B.Y.).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,05% Tween-80	Sigma	P1379
10 mL spuit	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
3-aminobenzoëzuur	Sigma	E10521
5 μm filter	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
Glazen bodem 35 mm schaal	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Confocal microscoop	Leica	TCS SP5 II
Omgevingskamer	Pecon	temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader	Eppendorf	No.5242956003
Glazen microscoopglaasje	Bioland Scientific LLC	7105P
Glycerol	Sangon Biotech	A100854
Incubator	Keelrein	PH-140(A)
M.marinum			ATCC BAA-535
Micro-injectienaald	World Precision Instruments	IB100F-4
Micro-injector	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	NARISHIGE	MN-151
msp12:cerulean			Ref.: PMID 25470057; 27760340
Fenolrood	Sigma	P3532
PTU	Sigma	P7629
Glazen microscoopglaasje met enkele concaviteit	Sail Brand	7103
Sonicator	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spectrofotometer (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburg
Stereomicroscoop	OLYMPUS	SZX10
Tg(mfap4:eGFP)			Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)			Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)			Ref.: PMID 27424497; 17477879

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathw....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

celdood van macrofagen confocale microscopie transgene lijnen fluorescente bacteri n intramusculaire injectie laservermogensinstellingen XYZ sequenti le scan

Visualisatie van macrofaag lytische celdood tijdens mycobacteriële infectie in zebravis-embryo's via Intravital microscopie

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen