Methodenartikel

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60726

⸱

18 februari 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, Harvard University, 2Department of Biology, College of William and Mary, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Department of Bioengineering, California Institute of Technology, 5Department of Computer Science, College of William and Mary

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Samenvatting

Spontane intracellulaire calciumactiviteit kan worden waargenomen in een verscheidenheid van celtypes en wordt voorgesteld om een kritische rol te spelen in een verscheidenheid van fysiologische processen. In het bijzonder is passende regulatie van calciumactiviteitspatronen tijdens embryogenese noodzakelijk voor vele aspecten van de neurale ontwikkeling van gewervelde dieren, waaronder een goede neurale buissluiting, synaptogenese en fenotypespecificatie voor neurotransmitters. Hoewel de constatering dat calciumactiviteitspatronen kunnen verschillen in zowel frequentie als amplitude suggereert een dwingend mechanisme waarmee deze fluxen gecodeerde signalen naar downstream-effectoren kunnen overbrengen en genexpressie kunnen reguleren, benaderingen op populatieniveau zijn niet de precisie die nodig is om deze mogelijkheid verder te onderzoeken. Bovendien beperken deze benaderingen studies van de rol van celcelinteracties door het uitsluiten van de mogelijkheid om de toestand van neuronale bepaling te zeggen bij afwezigheid van celcelcontact. Daarom hebben we een experimentele workflow opgezet die time-lapse calciumbeeldvorming van gescheiden neuronale explants koppelt aan een fluorescentie in situ hybridisatietest, waardoor de ondubbelzinnige correlatie van calciumactiviteitspatroon met moleculaire fenotype op een eencellige niveau. We waren met succes in staat om deze aanpak te onderscheiden en te karakteriseren specifieke calcium activiteit patronen geassocieerd met het onderscheiden van neurale cellen en neurale voorlopercellen, respectievelijk; buiten dit, echter, zou het experimentele kader dat in dit artikel wordt beschreven gemakkelijk kunnen worden aangepast om correlaties tussen om het even welke tijd-reeks en uitdrukking van een gen of genen van belang te onderzoeken.

Inleiding

Vrij cytosolisch calcium is van cruciaal belang voor een verscheidenheid aan biologische processen, variërend van celproliferatie en migratie tot apoptose en autofagie1,2,3. Binnen deze trajecten kan calcium downstream-effecten op genexpressie uitoefenen door te interageren met calciumbindende domeinen om conformatieveranderingen te veroorzaken die eiwitactiviteit en interacties moduleren. Bijvoorbeeld, een neuronale calcium sensor bekend als de Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gehouden in een ontvouwde tussenliggende conformatie wanneer gebonden door calcium, waardoor het niet interactie met zijn eiwitten en DNA-doelen4. Naast het dienen als een eenvoudig signaalmolecuul, echter, de dynamische aard van intracellulaire calcium transiënten kan deze activiteit patronen te coderen meer complexe amplitude- of frequentie-gebaseerde signalen5,6. Nucleaire translocatie van de transcriptiefactor nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) wordt versterkt door hoogfrequente calciumschommelingen, maar geremd door laagfrequente oscillaties7. Overtuigend, recent werk heeft gesuggereerd dat NFAT daadwerkelijk kan reageren op cumulatieve blootstelling aan calcium8. Zowel calcineurine als Ca2+/calmodulin-afhankelijke eiwit kinase II (CaMKII) vertonen ook verschillende reacties op calciumtransiënten van een specifieke frequentie, duur of amplitude9. Om een extra niveau van regelcomplexiteit toe te voegen, suggereren computationele modellen dat veel downstream calciumbindende eiwitten min of meer frequentieafhankelijk worden in reactie op de aanwezigheid of afwezigheid van bindende concurrenten10,11.

Binnen het ontwikkelende zenuwstelsel zijn twee hoofdklassen van calciumactiviteitsgedrag gedefinieerd en geassocieerd met specifieke biologische processen. Calcium instroom worden geclassificeerd als "spikes" als ze zich voordoen binnen individuele cellen, bereiken een piekintensiteit van ~ 400% van de basislijn binnen vijf seconden, en vertonen dubbele exponentiële verval12. Dit type signaal wordt voornamelijk geassocieerd met neurotransmitter fenotype specificatie13. In tegenstelling, "golven" worden gedefinieerd als langzamer, minder extreme calcium transiënten waarin een cel intracellulaire calcium concentratie stijgt tot ~ 200% van de basislijn over een periode van dertig seconden of meer, dan vervalt over enkele minuten12. Deze signalen verspreiden zich vaak over meerdere naburige cellen, en hun aanwezigheid is geassocieerd met neurite uitgroei en celproliferatie14,15. Hoewel deze twee klassen zijn gedefinieerd op basis van karakteristieke kinetische profielen, blijft het onduidelijk welke kenmerken van deze patronen daadwerkelijk door cellen worden gedetecteerd en door downstream-effectoren worden vertaald.

Inzicht in de relatie tussen intracellulaire calciumschommelingen en genexpressie zou cruciaal inzicht geven in een van de regulerende mechanismen die een passende ontwikkeling en patronen van het zenuwstelsel garandeert. Hiertoe hebben studies van het embryonale ruggenmerg aangetoond dat verhoogde calciumpiekactiviteit tijdens de ontwikkeling wordt geassocieerd met hogere niveaus van remmende neuronen, terwijl verminderde calciumpiekactiviteit wordt geassocieerd met hogere niveaus van excitatory neuronen13. Deze tests op populatieniveau zijn echter niet gebruikt om calciumactiviteit te associëren met genexpressie op een eencellige niveau.

Het benaderen van deze vragen op het niveau van de eencellige cel biedt verschillende voordelen ten opzichte van eerder werk. Voor een, de mogelijkheid om calcium activiteit en genexpressie in veel cellen individueel te beoordelen maakt het mogelijk het volledige repertoire van verschillende activiteit patronen worden waargenomen zonder te worden versluierd door een bulk-level meting. Bovendien betekent het bestuderen van deze relaties in eencellige primaire cultuur dat celautonome verbanden tussen calciumactiviteit en genexpressie worden gehandhaafd, terwijl interacties die celcelcommunicatie vereisen, zullen worden ingetrokken. Daarom maakt deze aanpak het mogelijk om deze celautonome mechanismen afzonderlijk te bestuderen. Het maakt het echter ook mogelijk om de rol van niet-celautonome calciumactiviteit op te helderen en te ondervragen. Cellen kunnen bijvoorbeeld worden ontleed uit een embryo in het neurale plaatstadium, gekweekt totdat de controle van het broertje het neurale buisstadium bereikt en vervolgens vergeleken met cellen die vers zijn ontleed uit een embryo in neurale buisfase. Dit maakt directe vergelijking van cellen die celcelcommunicatie over een belangrijke ontwikkelingsperiode behielden mogelijk toe aan cellen waarin celcelcommunicatie werd afgeschaft.

Bij het aanpakken van de beperkingen van eerdere experimentele benaderingen, ontwikkelden we een protocol dat de beoordeling van zowel calciumactiviteit als genexpressie in individuele neurale voorlopercellen mogelijk zou maken, waardoor de correlatie van specifieke activiteitspatronen met daaropvolgende differentiatieprogramma's wordt vergemakkelijkt. Neurale weefsel werd ontleed uit Xenopus laevis in verschillende stadia van neurale ontwikkeling, gescheiden in enkele cellen, en afgebeeld via confocale microscopie in aanwezigheid van een fluorescerende calcium indicator. Na live-celbeeldvorming werden monsters vastgesteld en getest via fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om expressie van een gen of isoforme van belang te detecteren. Belangrijk is dat individuele cellen kunnen worden gevolgd in beide beeldvormingsexperimenten, wat betekent dat het calciumactiviteitsprofiel van een cel en het genexpressieniveau met elkaar kunnen worden geassocieerd(figuur 1). Het hier gerapporteerde protocol is bedoeld om relaties tussen calciumactiviteitspatronen en genexpressie over embryonale neuroontwikkeling in Xenopus laeviste onderzoeken. Echter, de bredere experimentele kader (single-cell time-course imaging gevolgd door FISH en beeld coregistratie) kan worden gewijzigd en toegepast op vrijwel elk celtype, fluorescerende reporter, en gen van belang.

Protocol

Alle werkzaamheden waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Comité voor institutionele dierenzorg en -gebruik (IACUC) van het College van William en Mary.

1. Behandeling van dierverzorging en embryo's

  1. Induceer natuurlijke paring door het toedienen van een onderhuidse injectie van menselijke chorionische gonadotropine (HCG) in de dorsale lymfezak van volwassen Xenopus laevis bij een dosis van 600 U voor vrouwen en 400 U voor mannen.
  2. Plaats na injectie ten minste één mannelijke en één vrouwelijke kikker 's nachts in een kamertemperatuurtank. Het leggen van eieren begint meestal 9-12 uur na HCG administratie.
  3. Verzamel embryo's. Dejelly door zachtjes te wassen met 2% cysteïne (pH 8.0) gedurende 2-4 min.
  4. Spoel de embryo's 3x in 0,1x Mark's Modified Ringer's solution (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH aangepast aan 7,4-7,6).
  5. Breng de embryo's over naar 100 mm glazen petrischaaltjes met 0,1x MMR en 50 μg/mL gentamycine. Een dichtheid van 50-100 embryo's per plaat is geschikt.
  6. Bebroed de gerechten bij 14 °C–22°C en laat de embryo's zich ontwikkelen tot ze de gewenste ontwikkelingsfase(en) bereiken. Verwijder periodiek onbevruchte cellen en necrotische of abnormaal ontwikkelende embryo's met een plastic overdrachtspipet.
    OPMERKING: Om consistentie te garanderen, wordt ontwikkelingsfasefase uitgevoerd volgens morfologische criteria gedefinieerd door Nieuwkoop en Faber16. Stadia van belang zullen variëren op basis van experimentele focus. Zo worden belangrijke neuroontwikkelingsoriëntatiepunten geassocieerd met fase 14 (begin van neurculatie), fase 18 (begin van neurale buissluiting) en fase 22 (begin van de verlenging van de staartknop).

2. Embryodissectie en monsterpreparaat

  1. Voorbereiding van de oplossing
    1. Bereid 2 mM Ca2+ oplossing voor met 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1,31 mM MgSO4en 4,6 mM Tris. Voeg voor elke 100 mL-oplossing 1 mL penicilline/streptomycine (10.000 U/mL penicilline; 10.000 μg/mL streptomycine). Pas pH aan op 7,8 en filter steriliseren.
    2. Bereid calcium- en magnesiumvrije (CMF) oplossing voor door 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris en 0,4 mM EDTA te combineren. Pas pH aan op 7,8 en autoclave om te steriliseren. Voeg voor elke 100 mL-oplossing 1 mL penicilline/streptomycine (10.000 U/mL penicilline; 10.000 μg/mL streptomycine). Pas pH aan op 7,8 en filter steriliseren.
  2. Bereiding van platen voor dissectie en beeldvorming
    1. UV-steriliseren twee 35 mm plastic petrischaaltjes en een 35 mm Cell Culture Dish (zie Tafel van Materialen).
    2. Tijdens het werken in een laminaire flow hood, bereid twee 50 mL plastic conische buizen met 10 mL van 2 mM Ca2 + oplossing elk.
    3. Blijf werken in de laminaire flow hood en voeg 2 mL van 2 mM Ca2 + oplossing toe aan een 35 mm plastic petrischaal, 2 mL van 2 mM Ca2+ oplossing voor één 35 mm Cell Culture Dish en 2 mL CMF-oplossing aan één 35 mm plastic petrischaal.
    4. Buiten de laminaire stroomkap vul je twee 100 mm plastic petrischalen en een 35 mm plastic petrischaal met 0,1x MMR met gentamycine (50 μg/mL). Vul een 60 mm plastic petrischaal met 70% ethanol.
    5. Voeg vlak voor de dissectie 0,01 g Collagenase B toe aan een van de 50 mL buizen met Ca2+ oplossing. Meng goed en breng de oplossing over op een verse 60 mm plastic petrischaal.
  3. Identificeer met behulp van een ontledende microscoop embryo's van de gewenste ontwikkelingsfase. Gebruik een steriele overdrachtspipet om ten minste zes geschikte embryo's over te brengen naar een van de 100 mm platen met 0,1 x MMR + gentamycine bereid in stap 2.2.4. Dit zal dienen als de holding plaat.
  4. Gebruik een steriele overdrachtspipet om één embryo over te brengen op de tweede 100 mm plaat met 0,1x MMR + gentamycine. Dit zal dienen als de dissectie plaat.
    1. Als het ontleden van embryo's oud genoeg om te bewegen (ongeveer fase 23 of ouder), verdoven elk embryo voorafgaand aan de dissectie door het over te brengen naar een schotel met 0,1% 3-aminobenzoëzuur ethylester verdund in 0,1x MMR met gentamycine (50 μg/mL). Zodra het embryo is geïmmobiliseerd, breng het terug naar de schotel met 0,1x MMR met gentamycine (50 μg/mL) en ga verder met de dissectie.
  5. Verwijder voorzichtig het vitellinemembraan dat het embryo omringt. Dit kan het gemakkelijkst worden gedaan met behulp van een paar stompe tangen om het embryo te stabiliseren tijdens het gebruik van een paar fijne tangen om het membraan te grijpen. Trek voorzichtig met de fijne tangen om het vitellinemembraan uit elkaar te pellen.
  6. Gebruik fijne tangen om de rug- en ventrale gebieden van het embryo te scheiden. Dit kan worden gedaan door het gebruik van de tangen te 'knijpen' het embryo langs de voorste-achterste as, snijden in de helft. Breng met een steriele overdrachtspipet het ruggedeelte over op de 60 mm plaat met collageenoplossing bereid in stap 2.2.5. Gooi het ventrale gedeelte weg.
  7. Laat de dorsale explant 1-2 min bij kamertemperatuur inde collageenoplossing uitbroeden. Breng het voorzichtig terug naar de dissectieplaat.
  8. Voltooi de dissectie door zorgvuldig alle resterende endodermale en mesodermale verontreiniging uit het vermoedelijke neurale weefsel van het ectoderm zorgvuldig te verwijderen. Voor embryo's in fase 22 of ouder moet de neurale buis ook worden verwijderd en weggegooid.
    OPMERKING: Indien nodig tijdens de dissectie, kan het gerecht van 70% ethanol bereid in stap 2.2.4 worden gebruikt om de tangen te wissen of opnieuw te steriliseren.
  9. Zodra de dissectie is voltooid, breng voorzichtig de explant naar de 35 mm plaat van Ca2 + oplossing bereid in stap 2.2.3.
  10. Herhaal stap 2.4-2.9 tot vier explants zijn verzameld.
  11. Gebruik een P1000 micropipet om alle vier de explants over te brengen naar de 35 mm plaat met CMF-oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat elk contact tussen de explants en de luchtwaterinterface wordt vermeden. Draai de schotel voorzichtig zodat alle explants in het midden van de plaat clusteren.
  12. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur om explants te laten scheiden.
    OPMERKING: Om te helpen bij de dissociatie, 0,025%–0,01% trypsine kan worden toegevoegd aan de CMF-oplossing. Dit kan nodig zijn voor een efficiënte dissociatie van oudere embryo's (fase 22 en ouder).
  13. Op dit punt moeten ten minste twee op de juiste plaats geënsceneerde embryo's op de bedrijfsplaat blijven staan. Breng deze embryo's over naar een vers gerecht gevuld met 0,1x MMR met gentamycine bereid in stap 2.2.4 en laat ze zich ongestoord ontwikkelen met het gerecht dat bedekt is om de explantschotel te evenaren. Deze embryo's zullen dienen als broer of zus controles.
  14. Gebruik superlijm om een micro-geregeerde coverslip (zie Tabel met materialen)aan de onderkant van de 35 mm Cell Culture Dish bereid in stap 2.2.3 te bevestigen.
    LET OP: Plaats kleine schar van superlijm rond de randen van de coverslip, druk het stevig tegen de onderkant van de Cell Culture Dish. De positionele markeringen worden overal verduisterd dat de lijm het rooster bereikt, dus het is belangrijk om het centrale gerasterde gedeelte van de coverslip vrij te houden van lijm.
  15. Nadat de explants hebben gescheiden voor 1 uur, gebruik maken van een P100 micropipet om ze over te dragen aan de Cell Culture Dish. Om zoveel mogelijk cellen op het gerasterde gedeelte van de schotel te plaatsen, houdt u de pipet in een ondiepe hoek dicht bij het oppervlak van de schotel, plaatst u de pipetpunt in de hoek van het rooster naar binnen gericht en verwijdert u de celvering stevig over de gerasterde ar ea. Idealiter zullen cellen zich vestigen in een strak dicht cluster.
  16. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om cellen aan de plaat te laten hechten. Bepaal en leg de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's wanneer deze incubatie begint.
  17. Combineer 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (zie Tabel met materialen) met 2 μL van 10% Pluronic F-127 zuur.
    OPMERKING: Fluo-4 AM is lichtgevoelig en moet te allen tijde in een lichtveilige of met folie bedekte buis worden bewaard.
  18. Nadat de incubatie tijd is voltooid, verplaatst u de monsterschaal naar een donkere kamer of een andere lichtbeveiligde locatie. Gebruik een micropipetom om 100 μL oplossing van de rand van de schotel te verwijderen. Voeg deze oplossing toe aan de aliquot van Fluo-4 AM/Pluronic F-127 zuur, pipet op en neer om te mengen, en breng het volledige volume terug naar de monsterschotel. Draai zachtjes om te mengen.
  19. Bedek de plaat met aluminiumfolie en laat 1 uur bij kamertemperatuur uitbroeden. Bepaal en leg de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's wanneer deze incubatie begint.
  20. Aan het einde van de incubatie, gebruik maken van de resterende conische buis van 2 mM Ca2 + om drie media wasbeurten uit te voeren op de volgende manier: 1) verwijder 1 mL oplossing uit de schotel, voeg 3 mL verse oplossing, voeg 3 mL van verse oplossing.

3. Calciumbeeldvorming

OPMERKING: Calcium beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde confocale microscoop(Tabel van materialen).

  1. Plaats de monsterplaat op het microscoopstadium en zorg ervoor dat deze wordt beschermd tegen blootstelling aan omgevingslicht. Zodra de plaat is bevestigd, gebruik een marker om het voorste punt van de plaat te etiketteren, zodat hetzelfde gezichtsveld kan worden gevonden in de volgende beeldvorming.
  2. Zoek het monster onder de microscoop - eerst op 10X en vervolgens bij 20X vergroting - en selecteer een geschikt gezichtsveld voor beeldvorming. Een ideaal gezichtsveld is celdicht, maar niet zo dicht dat cellen worden samengeklonterd of moeilijk individueel te onderscheiden.
  3. Pas de microscoopfocus aan zodat de door het raster geregeerde coverslip zichtbaar is. De nummers die op de coverslip zijn gemarkeerd, dienen als unieke id's voor bepaalde rasterlocus en kunnen worden gebruikt om hetzelfde gezichtsveld te vinden voor aanvullende beeldvorming. Als het oorspronkelijk geselecteerde gezichtsveld niet overlapt met getallen, wordt u pas geselecteerd totdat een identificeerbaar getal in beeld is.
  4. Neem een helder veldbeeld van het geselecteerde gezichtsveld met de door het raster geregeerde coverslip scherp.
  5. Pas de focusinstellingen aan en maak een helder veldbeeld van het geselecteerde gezichtsveld met de cellen scherp.
  6. Met de cellaag in focus, verlicht de monsters met een 488 nm laser. HV- en Offsetwaarden kunnen voor elk experiment worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat een dynamisch bereik van fluorescentie wordt gedetecteerd op het FITC-kanaal.
  7. Wijzig voor een afbeelding van twee uur de beeldconfiguratie om 901 frames op te nemen met een scantijd van 3,93 s en een interval van 8 s. Voer de configuratie uit om een afbeelding te verkrijgen.
  8. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijder de plaat uit de microscoop fase. Verwijder 1 mL oplossing van de plaat en vervang deze door 1 mL van 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA en 2 mM MgSO4 in 7,4% formaldehyde).
  9. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Bepaal en leg de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's wanneer deze incubatie begint.
  10. Nadat de fixatie is voltooid, verwijder alle oplossing van de plaat en vervang deze door 2 mL 1x PBS. Bewaar platen bij 4 °C voor verdere verwerking.

4. Gen expressie analyse: Sonde Synthese

  1. Zoals hieronder beschreven, het genereren van een antisense RNA sonde voor in situ hybridisatie. Bovendien, het genereren van een sense probe voor hetzelfde gen voor gebruik als een negatieve controle.
  2. Om plasmidDNA te zuiveren dat de sondesjabloonopeenvolging bevat, inent 150 mL van bouillon VAN LB met bacteriële glycerolvoorraden die de malplaatjeplasmid bevatten. Incubeer bij 37 °C met schudden 's nachts of tot de cultuur troebel is.
  3. Zuiver plasmide DNA uit de bacteriële cultuur met behulp van uw methode van keuze.
    LET OP: We gebruiken de McNary-Nagel midi-prep kit om hoge opbrengsten plasmid DNA te verkrijgen.
  4. Om te bevestigen dat de plasmid de verwachte insert bevat, voert u een beperkingsvertuiting uit en analyseert u de producten op een agarosegel. Onbesneden plasmid kan ook worden geanalyseerd op een agarose gel om te controleren op genomische DNA-besmetting.
  5. Om het sjabloon-DNA te lineariseren, stelt u een 100 μL-beperkingsvergisterreactie in die 20 μg plasedisch DNA, 2 μL van het juiste beperkingsenzym en 1x geschikte buffer bevat. Incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur.
  6. Extract gelineariseerd DNA door het uitvoeren van een fenol / chloroform extractie gevolgd door een chloroform extractie.
  7. Neerslag DNA met 100% ethanol. Dit kan snel worden gedaan door het toevoegen van twee volumes koude ethanol aan het monster en het uitbroeden op -80 °C totdat het stolt (15-30 min).
  8. Gebruik een gekoelde centrifuge om DNA te pelletren door 20 min te spinnen bij 12.000 x g/4 °C.
  9. Verwijder de supernatant en was de pellet met 200 μL van 70% ethanol. Draai gedurende 5 min bij 12.000 x g/4 °C.
  10. Verwijder de supernatant en luchtdroge pellet gedurende ongeveer 5 min. Resuspend in 20 μL van 1x TE en bewaar bij 4 °C tot verder gebruik.
  11. Om antisense RNA-sonde te synthetiseren en te zuiveren, maakt u een rNTP-mix van 2,5 mM m m door 15 μL van 10 mM rCTP, 15 μL van 10 mM rATP, 9,75 μL van 10 mM rUTP en 5,25 μL van 10 mM dig-11 UTP (Zie Tabel met materialen).
  12. Een 50 μL in vitro transcriptiereactie instellen die 4 μg gelineariseerd sjabloon-DNA bevat vanaf stap 4.2-4.10; 15 μL van 2,5 mM rNTP-mix uit stap 4.11, 10 μL van 5x transcriptiebuffer, 5 μL van 0,1 M DTT, 0,5 μL RNAse-remmer (20 U/μL) en 1,5 μL geschikte RNA polymerase (T3, T7 of SP6). Incubeer 1 uur bij 37 °C.
  13. Voeg een extra 1,5 μL RNA polymerase toe aan de reactie en keer gedurende een uur terug naar 37 °C.
  14. Voeg 1 μL RQ1 DNAse toe aan de reactie en incubeer bij 37 °C gedurende 10 min om de DNA-sjabloon te degraderen.
  15. Voeg 30 μL van 7,5 M LiCl-oplossing toe aan monster. Pipette om te mengen en uitte broeden op -20 °C gedurende ten minste 1 uur.
  16. Draai het monster met behulp van een gekoelde centrifuge 25 min bij 14.000 x g/4 °C.
  17. Verwijder de supernatant en spoel de pellet af met 500 μL van 70% ethanol. Draai 5 min bij 14.000 x g/4 °C.
  18. Verwijder de supernatant en luchtdroogpellet gedurende ongeveer 5 min. Resuspend in 20 μL nuclease-vrij water.
  19. Maak op 10x sondevoorraad door het monster te verdunnen tot een concentratie van 10 ng/μL in hybridisatiebuffer (50% formamide; 5x SSC (zout-natriumcitraat; 750 mM NaCl, 75 mM natriumcitraat, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardt's Solution, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA en 100 μg/mL heparine). Bewaar bij -20 °C tot verder gebruik.

5. Genexpressie Analyse: Fluorescentie In Situ Hybridization

OPMERKING: Alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd met ongeveer 1 mL oplossing met behulp van een steriele, individueel verpakte overdracht pipet. De pipet moet bij het verwijderen of toevoegen van de oplossing aan de rand van de plaat worden geplaatst en wasbeurten moeten zo voorzichtig mogelijk worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat cellen niet van het plaatoppervlak worden losgemaakt en verloren gaan.

  1. Verwijder 1x PBS van plaat (vanaf stap 3.10). Vervang door verse 1x PBS en incubeer 5 min bij kamertemperatuur.
  2. Combineer 25 mL van 0,1 M triethanolamine (pH 8.0) met 62,5 μL azijnzuuranhydride. Meng goed. Was de plaat met deze oplossing voor 10 min.
  3. Was de plaat met 1x SSC gedurende 5 min.
  4. Was de plaat met 0,02 M HCl gedurende 10 min om cellen te doorsijpelen.
  5. Was 2x met 1x PBS voor 5 min per stuk.
  6. Verwijder de oplossing en voeg 1 mL hybridisatiebuffer (50% formamide, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitraat, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x Denhardt's Solution, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA en 100 μg/mL heparin) op plaat. Incubeer met schudden voor ten minste 6 uur bij 60 °C.
  7. Verwijder hybridisatiebuffer en vervang deze door 750 μL 1x RNA Probe-oplossing (verdund vorm de 10x-voorraad in stap 4.19. Sense RNA sondes kunnen worden gebruikt als een negatieve controle.
  8. Incubeer met schudden voor 8-14 uur bij 60 °C.
  9. Verwijder de sonde en bewaar bij -20 °C.
    LET OP: 1x sondeverdunning kan tot drie keer worden hergebruikt voordat deze wordt weggegooid.
  10. Spoel de plaat af met 0,2x SSC.
  11. Was met verse 0,2x SSC gedurende 1 uur bij 60 °C.
  12. Verplaats de platen naar kamertemperatuur en equilibrate gedurende 5 min.
  13. Was de plaat met 0,2x SSC gedurende 5 min.
  14. Was de plaat met 1x PBT gedurende 15 min.
  15. Was de plaat met 2% H2O2 in 1x PBT (0,1% Triton-x-100) gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Deze oplossing is lichtgevoelig, dus het moet vers worden gemaakt voor elk experiment en afgeschermd van licht. Platen moeten ook worden afgeschermd van licht of verijdeld tijdens deze incubatie.
  16. Was de plaat met 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1%Tween-20) gedurende 15 min.
  17. Verdun blokkerende reagens tot 2% in Maleic Acid Buffer (100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, pH 7,5). Blokkeer de cellen in dit mengsel gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
  18. Vervang de blokkeringsoplossing door anti-digoxygenin-POD antilichaam verdund 1:1.000 in 2% BlokkerenReagenininMaleic Acid Buffer. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
  19. Spoel de plaat 3x af met 1x TBST.
  20. Was 4x met 2mL 1x TBST voor minimaal 15 min per wasbeurt met continu schommelen.
  21. Was 2x met 1x PBT voor minstens 10 min per wasbeurt met continu schommelen.
  22. Verdun Cy3-geconjugeerde tyramide 1:25 in 1x PBT. Was de plaat met 750 μL van deze verdunning gedurende 5 min.
    OPMERKING: Deze oplossing is extreem lichtgevoelig en platen moeten gedurende de rest van het experiment verijdeld of afgeschermd worden van licht om signaalverslechtering te voorkomen.
  23. Voeg 2,5 μL van 0,3% H2O2 toe aan deze oplossing en incubeer met continu schommelen voor nog eens 40 min bij kamertemperatuur.
  24. Was 4x met 1x TBST voor minstens 15 min per wasbeurt met continu schommelen.
  25. Spoel af met 1x PBT.
  26. Repareer de cellen door 1 uur bij kamertemperatuur te broeden in 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA en 1 mM MgSO4 in 3,7% formaldehyde).
  27. Verwijder de oplossing en vervang door 1x PBS. Bewaar de platen in een verijdelde container op 4 °C tot verdere verwerking.

6. ImagingCellen

OPMERKING: Imaging werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde confocale microscoop.

  1. Plaats de monsterplaat op het microscoopstadium, waarbij het merk in stap 3.1 wordt uitgelijnd op de voorkant van het podium.
  2. Focus de afbeelding zodat de met raster omzoomde coverslip zichtbaar is en pas met behulp van de rasterafbeelding die in stap 3.4 als referentie is genomen het gezichtsveld aan om het gezichtsveld dat in het calciumbeeld is vastgelegd (sectie 3) aan te passen.
  3. Verwerf heldere veldbeelden van zowel het raster als de cellen.
  4. Verlicht de monsters met een 595 nm TRITC laser. Pas versterkingswaarden aan om het signaal op de juiste manier van de achtergrond te onderscheiden met behulp van de afbeeldingen van de negatieve controlecellen en een stilstaand beeld te verkrijgen.
    OPMERKING: Idealiter worden de fluorescentieniveaus op de achtergrond bepaald op basis van een negatieve controleplaat die parallel wordt verwerkt met een niet-targeting sense RNA-sonde. Gain-instellingen worden aangepast zodat deze plaat volledig zwart lijkt (overeenkomend met achtergrondniveaus), en vervolgens constant wordt gehouden voor andere platen die uit die experimentele batch zijn afgebeeld.

7. Gegevensverwerking

OPMERKING: De gegevensverwerking werd uitgevoerd met Behulp van Nikon Elements-software.

  1. Open het 2 uur calciumbeeld van stap 3.7. Identificeer de pixels die overeenkomen met elke afzonderlijke cel door Binaire > Steundetectie > Lichtpuntjeste selecteren. Controleer of het FITC-kanaal is geselecteerd.
  2. Gekleurde cirkels verschijnen boven afzonderlijke cellen nadat deze laag is gegenereerd. Pas de parameters voor celdistributie en -grootte aan, zodat zoveel mogelijk cellen worden herkend en gekoppeld aan een unieke id.
  3. Volg de cellen in alle frames van de afbeelding door te navigeren naar Weergave > Analysebesturingselementen > Bijhoudensopties. Stel 5 frames in als de maximale kloof tussen tracks, verwijder objecten die zijn gekoppeld aan minder dan 600 frames en selecteer de optie Hiaten sluiten. Selecteer Binaire bestanden bijhouden om celtracking toe te passen op de afbeelding.
  4. Nadat de cellen zijn bijgehouden, verwijdert u handmatig elk object dat niet overeenkomt met een individuele cel (bijvoorbeeld een klomp cellen). Gegevenspunten mogen echter niet worden uitgesloten van verdere analyse op basis van de morfologie van het calciumactiviteitsspoor.
  5. Selecteer overlay weergeven > Binaire object-id weergevenin het deelvenster Afbeelding. Schuif naar het einde van de afbeelding (Frame 901) en selecteer Bewerken > Momentopname maken (8bit RGB)> Huidig frame > OK. Hiermee wordt een momentopname van het laatste frame van de afbeelding gemaakt met de bijbehorende binaire ID van elke cel zichtbaar. Sla deze afbeelding op.
  6. Exporteer tijdreeksgegevens door alle objecten te selecteren, gevolgd door Gegevens exporteren naar Excel. Uitvoer opslaan als een CSV-bestand.
  7. Open de FISH-afbeelding. Optimaliseer de detectie van vlekken zoals in de stappen 7.1–7.2, met behulp van het TRITC-kanaal in plaats van het FITC-kanaal. Verwijder handmatig alle verkeerd toegewezen binaire bestanden en selecteer vervolgens Geautomatiseerde meetresultaten > Meting bijwerken om de signaalintensiteit van elke cel te berekenen. Exporteer een afbeeldingsmomentopname en gegevenstabel door de stappen 7.5 en 7.6 te herhalen.
  8. Maak een spreadsheet waarin kolom A het label FISH Binary ID en Kolom B het label Calcium Binary IDheeft. Open de geëxporteerde afbeeldingen in de stappen 7.5 en 7.7. Neem voor elk object dat is geïdentificeerd in de FISH-afbeelding (stap 7.7) de binaire id op in kolom A. Zoek vervolgens de overeenkomstige cel in de calciumafbeelding (stap 7.5) en noteer die binaire ID in kolom B. Cellen die niet met vertrouwen in beide afbeeldingen kunnen worden geïdentificeerd, mogen niet aan de spreadsheet worden toegevoegd.
    OPMERKING: Het kan handig zijn om een fotobewerkingsprogramma te gebruiken, zoals Adobe Photoshop of GIMP-afbeeldingseditor, om beide afbeeldingen te openen, een semi-transparant te maken en deze op de partnerafbeelding te leggen om de twee binaire id's die aan elke cel zijn gekoppeld, gemakkelijker te identificeren en te koppelen.
  9. Voor elke geïdentificeerde cel, collate (handmatig of met een script) de tijd-serie calcium gegevens (gekoppeld aan de Calcium Binary ID en geëxporteerd in stap 7.6) en de genexpressie gegevens (geassocieerd met de FISH Binary ID en geëxporteerd in stap 7.7).
    OPMERKING: Downstream-gegevensverwerking en -analyse kunnen inhouden dat deze gegevens in één gegevenstabel worden samengevoegd en dat een scala aan analytische technieken wordt toegepast, waaronder spikecounting, fractale analyse en Markovian-entropie waarmee de onderzoeker nieuwe patronen van calciumactiviteit kan onderscheiden 17,18.

Resultaten

Een succesvol voorbeeld van gescheiden cellen die zijn bereid voor calciumbeeldvorming is te zien in figuur 2A. Cellen zijn dicht verguld, waardoor de maximale hoeveelheid informatie kan worden verzameld van elke afbeelding, maar niet zo dicht verguld dat individuele cellen niet vol vertrouwen kunnen worden onderscheiden vormen elkaar. Fluorescentie wordt gedetecteerd voor elke gedefinieerde cel gedurende de 2 uur imaging periode. Visualisatie van een samengestelde plot met de sporen voor alle cellen die in een experiment zijn opgenomen, onthult in welke mate bulk- of populatiemetingen meer genuanceerde patronen van stekeergedrag kunnen verdoezelen (figuur 2B). Wanneer de geregistreerde profielen van individuele cellen geïsoleerd zijn, kunnen voorbeelden van de onregelmatige stekelige activiteit die kenmerkend is voor neurale voorlopercellen duidelijk worden geïdentificeerd. In tegenstelling tot volwassen neuronen vertonen embryonale neuronale cellen onregelmatige, zeer variabele en complexe aard van calciumactiviteit(figuur 2B). Om deze complexiteit te kwantificeren, zijn verschillende methoden voor gegevensanalyse toegepast17,18, inclusief diverse parameters om een piek te definiëren (figuur 2C).

Succesvolle fluorescentie in situ hybridisatie, met inbegrip van succesvol ontwerp en synthese van een antisense mRNA sonde, kan worden beoordeeld door het vergelijken van de experimentele plaat tegen een achtergrond controle geïncubeerd met een niet-bindende zin RNA controle (Figuur 3A, B). Een positieve sonde controle kan ook worden uitgevoerd door het verwerken van een celtype bekend om het doel mRNA uit te drukken op detecteerbare niveaus.

Identificatie van dezelfde cel voor calcium- en VISbeeldvorming vereist dat cellen ongeveer dezelfde positie behouden tijdens de hybridisatie en verwerking van de sonde. Als platen ruwweg worden behandeld of wasbeurten te krachtig worden uitgevoerd, kunnen cellen van het plaatoppervlak worden losgemaakt en verloren gaan wanneer de oplossing wordt weggegooid of op een andere plaats op de plaat wordt afgezet, waardoor het onmogelijk is om ze over afbeeldingen te matchen(figuur 4A). Als deze verstoring slechts enkele cellen in het gezichtsveld beïnvloedt, kan het nog steeds mogelijk zijn om bepaalde cellen in de afbeelding op te sporen en toe te wijzen (figuur 4B). De maximale hoeveelheid gegevens wordt echter verkregen uit een experiment waarbij FISH zorgvuldig wordt uitgevoerd en er weinig cellen verloren gaan of tussen afbeeldingen worden verplaatst(figuur 4C).

Zodra gegevens zijn verzameld om zowel de calciumactiviteit als de genexpressie van een redelijk aantal cellen in de ontwikkelingsfase(en) van belang te beschrijven, kunnen verdere analyses worden uitgevoerd om correlaties tussen deze twee kenmerken te beoordelen (figuur 1). Een aantal statistieken zijn toegepast om calciumactiviteitspatronen te kwantificeren, waaronder spike counting/frequency, average power, Hurst exponent estimate, en Markovian entropy measurement17,18. Genexpressie kan kwantitatief worden gedefinieerd door absoluut fluorescentieniveau of gesorteerd op een binaire (ja/nee) schaal, afhankelijk van de experimentele vragen die worden aangepakt.

Resultaten van experimenten die calciumactiviteit met de uitdrukking van neurale voorlopergenen samenspannen, toonden talrijke associaties aan tussen specifieke patronen van calciumactiviteit en neurotransmitterfenotypes. In de neurale plaatfase (fase 14) vertonen GABAergic-cellen die de remmende neuronmarker gad1.1 uitdrukken, calciumactiviteit die regelmatiger en hoger is dan die van cellen die geen gad1.1-expressie hebben(figuur 5A). Bovendien, terwijl deze gad1.1-uitdrukkende cellen worden geassocieerd met hogere niveaus van hoge amplitude stekerij, lage amplitude spiking komt vaker voor in glutamatere erecellen uitdrukken van de excitatory neuron marker slc17a7.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch van experimentele workflow. Schaalbalk = 100 μm. Beelden in panelen 3-5 zijn genomen uit Paudel et al. (2019)17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Calciumbeeldvorming en voorbeeldactiviteitsprofielen. (A) Intracellulaire calciumactiviteit zoals gerapporteerd door Fluo4-AM. Elke 2 uur beeld bestaat uit 901 frames, met een representatief frame hier laten zien. (B) Samengestelde plot van fluorescentieintensiteit in de tijd in alle cellen binnen het beeldveld. De sporen geven duidelijk aan op het fotobleken van indicatorkleurstof (Fluo4) overwerk. Raster plot linksboven toont representatieve sporen van calcium activiteit na toepassing van een de-trending algoritme ontwikkeld door Eilers en Boelen19, waar cellen hier getoond vertonen divers patroon van stekerij gedrag. (C) Toepassing van verschillende drempels (150% en 200% van de basislijn, waarbij de basislijn het gemiddelde is van onttrendte fluorescerende intensiteit) om een piek (groene en blauwe pijlen) te definiëren. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: FISH imaging. (A) FISH uitgevoerd met een niet-bindende zin RNA sonde als een negatieve controle. Beeldvormende instellingen zijn aangepast zodat er geen cellen fluorescerend lijken. Sommige gezichtsvelden kunnen niet-celvuil met enige fluorescentie bevatten, zoals te zien in de rechterbovenhoek en rechterbenedenhoek van (A); deze kunnen worden genegeerd met het oog op achtergrondinstelling. (B) Dezelfde beeldvormingsinstellingen worden vervolgens gebruikt om een experimentele plaat (antisense RNA-sonde) in beeld te brengen. Fluorescentie onder deze omstandigheden komt overeen met genexpressie boven de achtergrond. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Afbeeldingsoverlay en coregistratie. Schematische weergaven van een monster dat wordt weergegeven voor calciumactiviteit (cellen die worden vertegenwoordigd door gevulde groene cirkels) en na FISH (cellen die worden vertegenwoordigd door schaduwrijke rode cirkels). (A) Cellen die aanzienlijk zijn verplaatst tijdens het verwerken en verwerken van monsters, kunnen niet betrouwbaar worden geïdentificeerd in de twee afbeeldingen. (B)Celverstoring kan slechts enkele cellen in het gezichtsveld beïnvloeden. Sommige cellen kunnen duidelijk worden geïdentificeerd in beide beelden, terwijl anderen niet vol vertrouwen kunnen worden geëvenaard. (C) Als monsters zorgvuldig worden behandeld, blijven de meeste cellen ongestoord en kunnen ze in beide afbeeldingen worden geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Een voorbeeld van toepassing van deze methode, boxplots met associaties tussen calciumactiviteit en genexpressie (GABA en Glut voor genen gad1.1 en slc17a7 respectievelijk) in neurale plaatstadium Xenopus laevis. In fase 14 vertonen gad1.1-postive cells (GABA) een hogere amplitude en regelmatigere calciumactiviteit zoals gedefinieerd door (A) Markovian entropie18 en (B) piektellingen met behulp van drempels 125%, 150%, 200% en 300% van het gemiddelde van de gedetrendeerde fluorescerende intensiteit (baseline)17 dan slc17a7 positieve cellen (Glut). Sterren wijzen op statistisch significante verschillen volgens zowel bonferroni-gecorrigeerde twee-steekproef Kolmogorov-Smirnov Test (p < 0,05) en Cohen's d statistieken voor effectgrootte (n = 5 culturen en >100 cellen; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Het cijfer werd hertekend en aangepast aan de gegevensset van Paudel et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Karakteristieke patronen van calciumactiviteit zijn waargenomen in de cellen die deel uitmaken van het ontwikkelende zenuwstelsel, met specifieke soorten activiteit geassocieerd met verschillende neuroontwikkelingsprocessen. Een verder begrip van de mechanismen waarmee deze informatiedichte activiteitspatronen worden vertaald in transcriptiereacties vereist echter dat informatie over calciumactiviteit en genexpressie moet worden verzameld met eencellige resolutie. Terwijl systemen die meer stereotiepe calciumactiviteit vertonen, zoals volwassen neuronen, redelijkerwijs kunnen worden geassuieerd op bulkniveau, worden de onregelmatige patronen die het embryonale zenuwstelsel karakteriseren gemakkelijk gemaskeerd door minder nauwkeurige opnames.

Het experimentele kader dat in dit protocol wordt vastgesteld, is gemakkelijk aan te passen aan een breed scala aan celtypen en fluorescerende verslaggevers. Weefsel dat vrijwel elk celtype of een combinatie van celtypen bevat, kan worden ontleed uit een modelorganisme van belang en verguld voor eencellige beeldvorming. Naast het toestaan van celidentificatie en het isoleren van het effect van celautonome processen, stelt een primaire celkweekbenadering de experimentator in staat om mediacomponenten naar wens te definiëren. Zo zijn experimenten met het vergelijken van de activiteit van neuronale precursoren in 2 mM Ca2+ oplossing uitgevoerd om te onderzoeken of de relaties tussen spikefrequentie en neurotransmitterfetype in het embryonale ruggenmerg kunnen worden samengevat zonder de invloed van celcelinteracties13,20.

Hoewel dit protocol de fluorescerende marker Fluo4-AM gebruikt om intracellulaire calciumactiviteit te detecteren, kunnen gebruikers, afhankelijk van de selectiecriteria, andere commercieel beschikbare markers21selecteren, inclusief genetisch gecodeerde calciumindicatoren. Op dezelfde manier kunnen alternatieve markeringen worden gebruikt om dynamische veranderingen in de concentratie van een ion van belang te controleren (waaronder K+, Na+en Zn2+), membraanpotentieel of cellulaire pH. Beeldinstellingen en beeldduur kunnen indien nodig worden gewijzigd.

Hoewel we calciumactiviteit en neuronale fenotype correleerden als een specifieke toepassing, is deze methode ook van toepassing op een verscheidenheid aan andere cellulaire eigenschappen. Bijvoorbeeld, fluorescentie in situ hybridisatie kan worden uitgevoerd met sondes tegen elk gen van belang, met inbegrip van de neuronale marker ChAT of de transcriptie factor Engrailed, waardoor gevoelige detectie van een aanpasbaar paneel van mRNA soorten. Deze sondes kunnen worden ontworpen om isoform-specifieke, ondersteuning van extra doel specificiteit indien gewenst. Dubbele VIS kan worden uitgevoerd met behulp van sondes geconjugeerd tot verschillende twee verschillende fluorophoren, waardoor de gelijktijdige beoordeling van de expressie van meerdere genen. Echter, de extra wasbeurten vereist door dit type experiment worden geassocieerd met een verhoogde kans op celverlies of beweging en vereisen ervaring en delicatesse met succes worden uitgevoerd.

Ongeacht eventuele experiment-specifieke wijzigingen aan dit protocol, zijn er verschillende belangrijke stappen die zorgvuldige aandacht vereisen. Dissecties moeten met zorg worden uitgevoerd om alle verontreinigde weefsels of celpopulaties te verwijderen; omdat ruimtelijke patronen verloren gaan wanneer de explants worden gescheiden, worden de resterende cellen van naburige weefsels afgewisseld met en niet te onderscheiden van de cellen van belang. Nadat cellen zijn verguld, moeten monsters zo voorzichtig mogelijk worden behandeld om te voorkomen dat cellen worden losgemaakt. Het belangrijkste is dat dit betekent dat alle oplossingswijzigingen langzaam en zorgvuldig moeten worden uitgevoerd, waarbij de pipet aan de rand van de plaat wordt geplaatst wanneer de oplossing wordt verwijderd en toegevoegd. Dit zal ervoor zorgen dat cellen met vertrouwen kunnen worden geïdentificeerd in zowel calcium- als FISH-afbeeldingen. Als cellen tijdens de verwerking worden verstoord, kan het onmogelijk zijn om sommige of alle overeenkomstige cellen tussen de twee afbeeldingen te identificeren. Wij adviseren erring aan de kant van voorzichtigheid met deze opdrachten, zodanig dat alleen ondubbelzinnig overeenkomstige cellen worden gebruikt voor verdere analyse.

Afhankelijk van de biologische vraag die wordt behandeld, kunnen verschillende analysebenaderingen passend zijn. Tijdreeksen calciumactiviteit kunnen op verschillende manieren worden verwerkt en gekwantificeerd, met een flexibiliteit van de onderzoeker bij het kiezen van detrendingparameters, analysestatistieken en analyseparameters (bijvoorbeeld het percentage basislijndrempel dat wordt gebruikt om een calciumpiek te definiëren). Correlaties tussen calciumactiviteit en het niveau van genexpressie kunnen worden getrokken door genexpressie te analyseren als een absolute of relatieve fluorescentiewaarde die uit het FISH-beeld wordt gehaald. Als alternatief kunnen correlaties tussen calciumactiviteit en genexpressie (aanwezigheid/afwezigheid) worden getrokken door een fluorescentiedrempel voor positief genexpressiesignaal te definiëren en 'ja' of 'nee'-id'-identificatiemiddelen toe te wijzen aan individuele cellen. Als geheel biedt dit experimentele schema een ongelooflijk flexibele pijplijn voor het verzamelen en voorbereiden van tijdreeksgegevens in combinatie met cel-overeenkomende genexpressiegegevens. Dergelijke experimenten zullen van cruciaal belang zijn voor een beter begrip van de complexe relaties tussen cellulaire dynamiek en transcriptieveranderingen, zoals blijkt uit de identificatie van calciumactiviteitspatronen die kenmerkend zijn voor remmende en excitatorische neuronale precursoren in embryonale Xenopus laevis.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij danken Wendy Herbst en Lindsay Schleifer voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 en 1R15HD096415-01) aan MSS.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor diergeneeskunde & Celcultuur
CHORULON (choriongonadotropine)Merck Animal Health
Gentamycin sulfaat zoutMillipore SigmaG1264
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Pyrex petrischalen, 100 mm x 20 mmMillipore SigmaCLS3160102
Corning Falcon Easy-Grip weefselkweekschalen, 35mmFisher Scientific08-772A
Corning Falcon Easy-Grip weefselkweekschalen, 60mmFisher Scientific08-772F
Falcon Standard weefselkweekschalenFisher Scientific08-772E
Thermo Scientifc Nunc Celcultuur / Petrischotels, 35x10mm schaal, Nunclon DeltaFisher Scientific12-565-90
Fisherbrand standaard wegwerppipetten, niet gegradueerd; Lengte: 5.875 in.; Capaciteit: 7.7 mLFisher Scientific13-711-7M
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatMillipore SigmaE10521
Collagenase BMillipore Sigma11088807001
Dumont #55 Pincetten, DumostarFine Science Tools11295-51
Dumont #5 Pincetten, DumostarFine Science Tools11295-00
Cellattice Micro-Ruled Celcultuur OppervlakNexcelom BioscienceCLS5-25D-050
Voor Calcium Imaging
Fluo-4, AM, celdoordringbaarThermo Fisher ScientificF14201
Pluronic F-127, 0.2 µm gefilterd (10% oplossing in water)Thermo Fisher ScientificP6866
Voor RNA-probegeneratie
PureYield Plasmid Miniprep SysteemPromegaA1222
rATPPromegaP1132
rCTPPromegaP1142
rGTPPromegaP1152
rUTPPromegaP1162
Digoxigenin-11-UTPMillipore Sigma3359247910
Rnase InhibitorThermo Fisher ScientificN8080119
T3 RNA PolymerasePromegaP2083
T7 RNA PolymerasePromegaP2075
SP6 RNA PolymerasePromegaP1085
RQ1 Rnase-vrije DnasePromegaM6101
LiCl precipitatieoplossing (7,5 M)Thermo Fisher ScientificAM9480
Voor fluorescentie in situ hybridisatie
Acetisch AnhydrideThermo Fisher Scientific320102
Blocking ReagentMillipore Sigma11096176001
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragmentenMillipore Sigma11207733910
Cy3 Mono-Reactieve NHS EsterMillipore SigmaGEPA13105
Oplossingscomponenten
Calciumchloride, 96% extra puur, poeder, watervrij, ACROS OrganixsFisher ScientificAC349610
Calciumchloride dihydraatMillipore SigmaC3306
CHAPS hydraatMillipore SigmaC3023
Denhardt's Solution (50X)Thermo Fisher Scientific750018
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)PromegaP1171
Ethyleendiaminetetraazijnzuur, Dinatriumzout DihydraatFisher ScientificS311
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuurMillipore SigmaE3889
Formamide (Degeïoniseerd)Thermo Fisher ScientificAM9342
Heparine natriumzout uit varkensdarmmucosaMillipore SigmaH3393
HEPES (Ultra Puur)Thermo Fisher Scientific11344041
WaterstofperoxideoplossingMillipore SigmaH1109
L-CysteïneMillipore Sigma168149
Magnesiumchloride, puur, ACROS OrganicsFisher ScientificAC223211000
Magnesiumsulfaat, 97% puur, ACROS Organixs, watervrijFisher ScientificAC413480050
Maleïnezuur, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificACS125231000
MOPS (fijne witte kristallen/moleculaire biologie), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP308
KaliumchlorideMillipore SigmaP9541
Ribonucleïnezuur uit torula-gist, Type IXMillipore SigmaR3629
NatriumchlorideMillipore SigmaS7653
TriethanolamineMillipore Sigma90279
TrisMillipore SigmaGE17-1321-01
TWEEN 20Millipore SigmaP9416
Apparatuur
Laminaire stroomkapmodel naar keuze
Dissectiemicroscoopmodel naar keuze
Omgekeerde fluorescentiemicroscoopNikonTE200
NIS-Elements beeldvormingssoftwareNikon
Schenkende incubatormodel naar keuze
Gekoelde centrifugemodel naar keuze
Diverse
Corning bottle-top vacuümfiltersysteem, 0,22 μm porie, 500

Referenties

  1. Humeau, J., et al. Calcium signaling and cell cycle: Progression or death. Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).
  2. Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration. PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).
  3. Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).
  4. Pham, K., et al. Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator. Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).
  5. Smedler, E., Uhlén, P. Frequency decoding of calcium oscillations. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).
  6. Moreau, M., Néant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development. Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).
  7. Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation. EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).
  8. Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load. Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).
  9. Li, L., Stefan, M. I. Le Novère N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII. PLoS One. 7 (9), 43810(2012).
  10. Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820(2017).
  11. Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).
  12. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation. Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).
  13. Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).
  14. Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation. Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).
  15. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex. Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).
  16. Nieuewkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  17. Paudel, S., et al. Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner. International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880(2019).
  18. Marken, J. P., et al. A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series. PLoS One. 11 (12), 0168342(2016).
  19. Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing. Leiden University Medical Centre Report. , (2005).
  20. Guemez-Gamboa, A., et al. Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching. Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).
  21. Paredes, R., Madelaine,, et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentie in situ hybridisatieanalyse van individuele cellenconfocale microscopieFluo 4 AMspontane calciumactiviteitcorrelatie van genexpressiegedissocieerde explantaten

Gerelateerde artikelen