Methodenartikel

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

DOI:

10.3791/60727

⸱

16 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monoklonale antilichamen zijn hoge affiniteit multifunctionele geneesmiddelen die werken door variabele onafhankelijke mechanismen om kankercellen te elimineren. In de afgelopen decennia is het gebied van antilichaam-drug conjugaten, bispecifieke antilichamen, chimerische antigeenreceptoren (CAR) en kankerimmunotherapie naar voren gekomen als het meest veelbelovende gebied van basis- en therapeutische onderzoeken. Met tal van succesvolle menselijke proeven gericht op immuun checkpoint receptoren en CAR-T cellen in leukemie en melanoom in een doorbraak tempo, het is zeer spannende tijden voor oncologische therapieën afgeleid van variaties van antilichaam engineering. Helaas, een aanzienlijk groot aantal antilichamen en CAR gebaseerde therapieën hebben ook bewezen teleurstellend in menselijke proeven van vaste kankers vanwege de beperkte beschikbaarheid van immuun-effector cellen in de tumor bed. Belangrijk is dat niet-specifieke distributie van therapeutische antilichamen in andere weefsels dan tumoren ook bijdraagt aan het gebrek aan klinische werkzaamheid, bijbehorende toxiciteit en klinisch falen. Zoals getrouwe vertaling van preklinische studies in menselijke klinische paden zijn sterk vertrouwd op muizen tumor xenograft werkzaamheid en veiligheid studies, hier wijzen we op een methode om de tumor en de algemene weefseldistributie van therapeutische antilichamen te testen. Dit wordt bereikt door het etiketteren van de eiwit-Een gezuiverd antilichaam met in de buurt infrarood fluorescerende kleurstof gevolgd door live beeldvorming van tumordragende muizen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FDA keurde het eerste monoklonale antilichaam dat CD3 (OKT3, Muromonab) richt in 1986goed 1,2. Sindsdien voor de komende twintig jaar, is er een snelle explosie op het gebied van antilichaam engineering als gevolg van het overweldigende succes van antilichamen tegen immuun checkpoint remmers3. Naast indirecte activering van het immuunsysteem, antilichamen worden gericht op het direct markeren van kankercellen om precies te betrekken immuun effector cellen, trigger cytotoxiciteit via death receptor agonist, blokkeren tumorcel overleving signalering, obstructie van angiogenese (groei van bloedvaten), beperken immuun regulator checkpoints, leveren radio-isotopen, chemotherapie drugs en siRNA als een geconjugeerde middelen2. Daarnaast is het bestuderen van de variabele fragmenten van de enkele keten (scFv) van verschillende antilichamen op het oppervlak van door de patiënt afgeleide T-cellen en NK-cellen (CAR-T en CAR-NK) een snel groeiend gebied van klinische onderzoeken voor celgebaseerde therapieën4.

De ultrahoge affiniteit van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen die selectiviteit biedt aan antigeenexpressie tumorcellen maakt het een aantrekkelijk middel. Ook de gerichte levering en tumorretentie van een therapeutisch antilichaam (of een chemisch medicijn) is de sleutel tot evenwicht werkzaamheid over toxiciteit. Daarom wordt een groot aantal op eiwitengineering gebaseerde strategieën uitgebuit die geen bispecifieke5- en tri-specifieke antilichamen6 bevatten, om de avidity optimized tumorretentie van intraveneus (IV) geïnjecteerde therapieën5,7aanzienlijk te verbeteren . Hier beschrijven we een eenvoudige fluorescentie gebaseerde methode om de tumor- en weefselverdeling van potentieel effectieve anti-kankerantilichamen aan te pakken.

Omdat dierlijke weefsels autofluorescentie bezitten wanneer ze opgewonden zijn in zichtbaar spectrum, werden de antilichamen aanvankelijk gelabeld met nabij Infrarood kleurstof (bijvoorbeeld IRDye 800CW). Voor proofs of concept investigations, hebben we gebruik gemaakt van foliumzuur receptor alpha-1 (FOLR1) gericht op antilichaam genaamd farletuzumab en de afgeleide genaamd Bispecifieke anker Cytotoxiciteit activator (BaCa)7 antilichaam dat co-doelen FOLR1 en death receptor-5 (DR5)8 in een recombinant antilichaam. FOLR1 is een goed gedefinieerde overexpressed doelreceptor in eierstokkanker- en TNBC-kankercellen, tumor xenografts en patiënttumoren9. Met name zijn er meerdere inspanningen om folr1 klinisch te exploiteren met behulp van op antilichamen gebaseerde benaderingen om immuuneffectorcellen en antilichaammedicatie (ADC) in te schakelen voor eierstokkanker en borstkanker10,11.

In deze methoden papier, we gekloond, uitgedrukt en gezuiverd klinische anti-FOLR1 (farletuzumab) samen met andere controle antilichamen met behulp van CHO expressie systeem. IgG1 isotype en een klinische anti-idiotype mucin-16 antilichaam genaamd abagovomab12 werden gebruikt als negatieve controles. Na eiwit-A zuivering, geïndiceerde antilichamen werden gelabeld met IRDye 800CW en werden toegediend in de staart ader van naakte muizen ofwel met eierstokkanker xenografts of stabiel getransfecteerd menselijke FOLR1 uitdrukken murine dikke darmkanker xenografts. De lokalisatie van antilichamen werd gevolgd door live beeldvorming met behulp van in vivo beeldspectrum op meerdere verschillende tijdstippen7. Deze methode vereist geen genetische modificatie of injectie van het substraat om lichtemissie mogelijk te maken en is aanzienlijk sneller, kosteneffectief en efficiënt. Het hieronder beschreven algemene kloon-, expressie-, zuiverings- en etiketteringsprotocol kan worden toegepast op elk klinisch en niet-klinisch antilichaam als er zware en lichte kettingsequenties beschikbaar zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met betrekking tot dieren behandeling en tumor xenografts studies werden herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hier aan de Universiteit van Virginia en voldoen aan de relevante wettelijke normen

1. Expressie en zuivering van antilichamen

  1. Onderhoud van CHO-cellen
    1. Kweek CHO cellen in FreeStyle CHO Media aangevuld met commercieel verkrijgbare 1x glutamine supplement bij 37 °C schudden bij 130 rpm met 5% CO2 met behulp van delong Erlenmeyer flessen glas of wegwerp.
      OPMERKING: Het is ten zeerste aan te raden om een verbijsterde kolf met geventileerde dop te gebruiken voor verhoogde agitatie en om de gasoverdracht tijdens de schudtoestand te verbeteren. Aanzienlijk verminderde antilichaam opbrengst is verkregen met regelmatige kolven (niet-verbijsterd) als gevolg van beperkte agitatie van de suspensie cultuur.
    2. Houd het celnummer tussen 1-5 x 106 cellen/mL met >95% cel levensvatbaarheid. Als het celaantal met meer dan 5 x 106 cellen/mL toeneemt, splitst u de cellen. Laat cho-cellen nooit onder 0,2 x 106 cellen/mL komen.
  2. Transfectie van CHO-cellen
    1. Kweek CHO-cellen in 200 mL media (2 x10 6 cellen/mL) in delong Erlenmeyer verbijsterde kolven.
      OPMERKING: Suspensieculturen gekweekt in verbijsterde kolven hebben altijd een hogere eiwitopbrengst geproduceerd vs wanneer ze worden geteeld in niet-verbijsterde kolven.
    2. Neem in een buis van 15 mL 5 mL CHO FreeStyle-media en voeg 50 μg VH-kloon-DNA en 75 μg VL-kloon-DNA toe. Vortex om goed te mengen.
    3. Broed het DNA-mengsel 5 min op kamertemperatuur.
      LET OP: Langere incubatie vermindert de eiwitopbrengst.
    4. Voeg 750 μL van 1 mg/mL polyethyleenimine (PEI) voorraad toe aan de DNA-oplossing en draai het mengsel agressief voor 30 s. Incubeer bij kamertemperatuur voor extra 5 min.
      LET OP: PEI moet vers worden gemaakt. Meervoudige vriesdooicyclus van PEI vermindert de totale opbrengst aanzienlijk.
    5. Voeg het hele mengsel van DNA en PEI op de cellen terwijl handmatig schudden van de kolf. Onmiddellijk incubeer de delong Erlenmeyer verbijsterde kolven met cellen bij 37 °C schudden bij 130 rpm.
  3. Expressie
    OPMERKING: Het antilichaam heeft secretoire signaal peptide ontworpen om zijn N-terminal einde, die helpt antilichamen worden afgescheiden in de media.
    1. Laat de doorgestemde cellen groeien bij 37 °C, met schudden bij 130 tpm op dag 1.
    2. Voeg op dag 2 2 mL 100x anti-klonterend middel en 2 mL 100x antibacterieel-anti-mycotische oplossing toe. Verleg de kolf naar lagere temperatuur (32-34 °C), met schudden bij 130 tpm.
    3. Voeg op elke vijfde dag 10 mL Tryptone N1-voer toe en 2 mL 100x glutaminesupplement.
    4. Houd tellen van de cellen elke derde dag met behulp van hemocytometer na het bevlekken van een aliquot van cellen met trypan blauwe vlek. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel boven de 80% blijft.
    5. Oogst op dag 10 of 11 het medium voor antilichaamzuivering. Draai de cultuur op 3000 x g,4 °C gedurende 40-60 min en filter vervolgens de heldere media met behulp van 0,22 μM flesfilters.
  4. Zuivering
    OPMERKING: Antilichaamzuivering wordt uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgde Protein-A kolom (zie Tabel van materialen), met behulp van een peristaltische pomp.
    1. Equilibrate de kolom met twee kolomvolume van bindende buffer (20 mM natriumfosfaat bij pH 7.4).
    2. Laat de gefilterde media met antilichaam (verkregen in stap 1.3.5) door de kolom met een stroomsnelheid van 1 mL/min.
    3. Was de kolom met een bindingsbuffer met twee kolommen.
    4. Elute het antilichaam in 500 μL fracties met behulp van 5 mL elutie buffer (30 mM natriumacetaat bij pH 3.4).
    5. Neutraliseer de pH van het geëuterde antilichaam door 10 μL neutralisatiebuffer (3 M natriumacetaat bij pH 9) per fractie toe te voegen.
      LET OP: Fractienummer 3-6 bevat het grootste deel van het antilichaam. Het is raadzaam om alle fracties te houden in het geval het antilichaam in een latere fractie wordt geëutteerd dan verwacht.
    6. Meet de concentratie gezuiverd antilichaam met behulp van een spectrofotometer door het standaardprotocol voor IgG te selecteren. De uiteindelijke concentratie van het antilichaam wordt verkregen in mg/mL door rekening te houden met het molecuulgewicht en de absorptiecoëfficiënt.

2. Fluorescerende etikettering

OPMERKING: Antilichamen worden gelabeld met de infraroodkleurstof die een NHS ester reactieve groep bevat, die paren aan eiwitten en vormen een stabiele conjugaat. Deze reactie is pH gevoelig en werkt het beste bij pH 8.5. Fluorescerende conjugaten gelabeld met de kleurstof display een absorptie maximum van 774 nm, en een emissie maximum van 789 nm. pH 8.5 is de sleutel voor effectieve vervoeging.

  1. Dialyze 0,5 mL van het antilichaam met behulp van een dialysecassette (0,1-0,5 mL) in 1 L vervoegingsbuffer (50 mM fosfaatbuffer bij pH 8,5). Na 4 uur breng je de dialysecassette over op een verse buffer en dialyseren 's nachts.
  2. Stel een vervoegingsreactie in door 0,03 mg IRDye 800CW per 1 mg antilichaam toe te voegen in een reactievolume van 500 μL.
    OPMERKING: IRDye 800CW wordt opgelost in DMSO bij een concentratie van 10 mg/mL.
  3. Voer etiketteringsreacties uit voor 2 uur bij 20 °C.
    LET OP: Het verhogen van de tijd na 2 uur verbetert de etikettering niet.
  4. Zuiver gelabelde vervoeging door uitgebreide dialyse tegen 1x PBS.
  5. Schat de mate van etikettering door de absorptie van de kleurstof te meten op 780 nm en absorptie van het eiwit op 280 nm. De kleurstof bijdrage aan de 280 nm signaal is 3%.
  6. Bereken de kleurstof/eiwitverhouding met behulp van deze formule:
    figure-protocol-1
    wanneer 0,03 een correctiefactor is voor de absorptie van de kleurstof die bij 280 nm wordt gebruikt (gelijk aan 3,0 % van de absorptie ervan bij 780 nm), εKleurstof en εEiwit molaire extinctiecoëfficiënten zijn voor respectievelijk de kleurstof en het eiwit (antilichaam).
    LET OP: εKleurstof is 270.000 M-1 cm-1 en εEiwit is 203.000 M-1 cm-1 (voor een typische IgG) in 1:1 mengsel van PBS: methanol. Andere eiwitten dan IgG kunnen zeer verschillende molaire extinctiecoëfficiënten hebben. Het gebruik van de juiste uitstervingscoëfficiënt voor het eiwit van belang is essentieel voor een nauwkeurige bepaling van de D/P-verhouding.
  7. Bereken de uiteindelijke eiwitconcentratie met behulp van deze formule:
    figure-protocol-2
    OPMERKING: Bevestig altijd de antigeenbindende werkzaamheid van gelabeld en niet-gelabeld antilichaam met BEHULP VAN ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) of flow cytometrie voordat u overgaat tot in vivo studies.

3. Muis xenograft studies

  1. Bereiding van tumorcellen voor injectie
    1. Kweek OVCAR-3 cellen in RPMI-1640 Medium, aangevuld met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine.
    2. De dag voor de injectie, subcultuur cellen in nieuwe 100 mm cultuur gerechten met 10 mL van volledige medium / schotel. Gebruik celnummer van 0,5-1 x 106 cellen/schotel.
    3. Incubeerculturen bij 37 °C temperatuur, 95% vochtigheid en 5% CO2 voor 20-24 uur.
    4. Verwijder op de dag van injectie het groeimedium uit cultuurgerechten. Spoel de cellaag grondig af met Ca2+/Mg2+ vrij Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om dode cellen, cellulair puin en alle sporen van serum te verwijderen, wat kan interfereren met trypsine-werking.
    5. Trypsinize de cellen door het toevoegen van 1,0-1,5 mL trypsin-EDta oplossing aan elke schotel en proberen om de oplossing te verspreiden door het kantelen van de schotel rondom, gevolgd door incubatie op 37 °C gedurende 5-10 min.
      OPMERKING: Observeer cellen onder een omgekeerde microscoop om de werkelijke trypsinisatiestatus te controleren. Onder trypsinization resulteert in lager aantal celloslating van de oppervlakte van cultuurschotel, over trypsinization veroorzaakt cellulaire spanning. Dus, een goede trypsinization is belangrijk.
    6. Voeg 1,0-1,5 mL van volledig groeimedium toe aan elk gerecht om de trypsine-actie te stoppen, daarna cellen opnieuw op te schorten door zachtjes te pipetten.
      OPMERKING: Zachte pipetting is belangrijk om de gezondheid van de cel te behouden.
    7. Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 mL en draai 5 minuten op kamertemperatuur op 250 x g.
    8. Verzamel de celpellet na het verwijderen van de supernatant en was de cellen door de pellet opnieuw op te schorten in 1x DPBS.
    9. Draai de celsuspensie bij lage snelheid 250 x g gedurende 5 minuten.
    10. Voeg 500 μL DPBS toe en hang cellen opnieuw op door zachte pipetting om een celopsuspensie te krijgen.
    11. Tel cellen met behulp van hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
      OPMERKING: Voor een betere nauwkeurigheid, herhaal het tellen voor drie keer en neem een gemiddelde.
    12. Pas het volume zo aan dat de uiteindelijke celdichtheid 1 x 108 cellen/mL is.
  2. Onderhuidse injectie van cellen om muis xenografts te ontwikkelen
    LET OP: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een BSL2-veiligheidskast. Athymic Nude Foxn1nu/ Foxn1+ muizen zijn gebruikt in de huidige studie.
    1. Neem 50 μL van de celsuspensie in een buis van 1,5 mL en meng met 50 μL keldermembraanmatrijsmedium.
      OPMERKING: Kelder membraan matrix medium heeft de neiging om een gel achtige toestand te vormen bij kamertemperatuur, dus zorgvuldig onderhouden van de cellen en de matrix medium mengsel op ijs. Het is raadzaam om buizen, tips en spuiten in de koelkast te bewaren en vervolgens over te brengen op ijs voorafgaand aan de injectie van het dier.
    2. Roer het mengsel om te voorkomen dat een cel klonteren. Neem vervolgens deze 100 μL van het celopeningsmatrix medium mengsel dat 5 x 106 cellen bevat, in een 1 cc spuit.
    3. Til de huid van het dier voorzichtig op om de huid van de onderliggende spierlaag te scheiden en injecteer langzaam de celsuspensie (100 μL) onder de huid (5 x 106 cellen), met een 26 G naald. Wacht een paar seconden voordat u de naald eruit haalt, zodat het medium van de keldermatrix de semi-solide gelachtige structuur samen met cellen onder de huid kan vormen, waardoor het mengsel uit de injectieplaats wordt voorkomen.
      OPMERKING: Cellen moeten vóór de injectie worden getest op besmetting die schadelijk kan zijn voor immunodeficiënte muizen. Tijdens het injecteren niet de naald te diep in de huid als dit kan de tumor dieper dan verwacht vormen.
    4. Bewaar het dier in een steriele kooi en observeer ongeveer 20 minuten.
    5. Observeer de muizen gedurende 2-3 weken en laat de tumor groeien tot 500 mm3 grootte.

4. Antilichaamlokalisatie met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem

OPMERKING: In vivo imaging equipment (zie Table of Materials)gebruikt in dit experiment maakt gebruik van een set van hoge efficiëntie filters en spectrale un-mengen algoritmen voor niet-invasieve visualisatie en het bijhouden van cellulaire en genetische activiteit binnen een levend organisme in real time. Systeem biedt zowel fluorescentie en bioluminescentie monitoring vermogen.

  1. Injecteer 25 μg kleurstof gelabeld antilichaam via staartader.
    1. Verdoes tumordragende muizen met 2% isofluram. Controleer op het gebrek aan reactie op pedaalreflexen.
    2. Zodra muizen stoppen met bewegen, verwijd de laterale staart ader door het toepassen van worm water.
    3. Injecteer 25 μg (in 100 μL) gelabeld antilichaam met behulp van 1 cc insulinespuit met een naald van 26 G.
    4. Evenzo, als een negatieve controle, label en injecteren van de niet-specifieke IgG1 Isotype antilichaam dat niet gericht kankercellen.
  2. Voer in vivo live beeldvorming uit na 8, 24, 48 uur, enz.
    1. Klik in de bijbehorende software op Initialiseren in het bedieningspaneel en bevestig dat de temperatuur van het stadium 37 °C is.
    2. Zet de zuurstoftoevoer, alle pompen op het anesthesiesysteem, isoflurane gastoevoer naar de verdovingskamer en stel de isoflurane vaporizer klep in op 2%.
    3. Breng de muizen naar de verdovingskamer en wacht tot muizen volledig verdoofd zijn. Breng de ogen smeren zalf om te voorkomen dat het drogen van hun ogen.
    4. Ga naar het Bedieningspaneel,stel de fluorescentiebeeldvorming in via de optie Imaging Wizard en selecteer de excitatie op 773 nm en emissie op 792 nm.
      OPMERKING: De standaardinstellingen voor automatische belichting bieden een goede fluorescerende afbeelding. Echter, de automatische belichting voorkeuren kunnen worden gewijzigd volgens de behoeften.
    5. Breng de verdoofde muizen in de beeldkamer en monteer deze op het beeldvormingsveld met behulp van neuskegel. De beeldfase biedt de mogelijkheid om plaats te bieden aan 5 muizen tegelijk.
      OPMERKING: Laat controlemuizen samen met de testmuizen een vergelijkbare hoeveelheid belichting en andere instellingen hebben tijdens de analyse.
    6. Zodra alles klaar is, selecteert u De optie Verwerven op het configuratiescherm voor de afbeeldingsverwerving.
    7. Met de instellingen voor automatischbelichting genereert het systeem de afbeelding binnen een minuut. Het gegenereerde beeld is de overlay van fluorescentie op fotografisch beeld met optische fluorescentie intensiteit weergegeven in eenheden van tellingen of fotonen, of in termen van efficiëntie.
    8. Na het verkrijgen van het beeld, breng de muizen van de beeldkamer terug naar hun kooi en observeren voor hun herstel voor 1 tot 2 min.
  3. Stem het beeld verder af met de tools en functies die in de software worden geleverd voor beeldanalyse. Hulpmiddelen voor beeldanalyse bevinden zich in de menubalk en het gereedschapspalet.
    1. Pas onder Afbeeldingsaanpassingde helderheid, het contrast of de dekking aan en selecteer de kleurschaal.
    2. Gebruik de ROI-tools om een regio van belang (ROI) op te geven in een optisch beeld en de signaalintensiteit binnen de ROI te meten. Exporteer indien nodig de gekwantificeerde signaalgegevens naar een spreadsheetsoftware en plot de gegevens.
    3. Voor follow-up studies, analyseren muizen necropsies van verschillende weefsels (bijvoorbeeld, lever, long, hart, nier, milt, hersenen, enz.) side-by-side voor een gedetailleerde niet-specifieke verdeling van fluorescerend gelabeld antilichaam.
      OPMERKING: Gegevens kunnen verder worden ondersteund met weefselspecifieke ELISA door gebruik te maken van antigeen (FOLR1 in dit geval) in 96 well assays.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de beschreven methodologie hebben we eerst antilichamen gekloond die zich richten op foliumreceptor alpha-1 (FOLR1) genaamd farletuzumab, en een bispecifiek antilichaam genaamd BaCa bestaande uit farletuzumab en lexatumumab, samen met controleantilichamen zoals abagovomab (sequenties in aanvullend bestand 1). Details van representatieve variabele zware (VH) en variabele licht (VL) domeinen in DNA klonen (pVH, pVL) worden weergegeven in figuur 1A. Om de positieve klonen te...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selectieve en tumorweefsel specifieke levering van anti-kanker therapeutisch middel is de sleutel tot het meten van de werkzaamheid en veiligheid van een bepaalde gerichte therapie13. Hier hebben we een snelle en efficiënte aanpak beschreven om de gedetailleerde weefsel- en tumordistributie van klinische, farletuzumab en een niet-klinisch BaCa-antilichaam te onderzoeken. De beschreven aanpak is van toepassing op elk nieuw gegenereerd antilichaam en kan worden gebruikt naast een klinisch effectief ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn de Universiteit van Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomoleculaire Analyse Faciliteit, Advanced Microscopy Facility en de Core Vivarium Facility for Assistance dankbaar. J. T-S is een vroege carrière onderzoeker van Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dit werk werd ondersteund door NCI / NIH subsidie (R01CA233752) aan J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) doorbraak level-1 award aan J. T-S (BC17097) en U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) financiering award (OC180412) aan J. T-S

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
FreeStyle CHO mediaGibco Life TechnologiesCat # 12651-014
Anti-Anti (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
Anti-Clumping AgentGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD Insulin SyringeBD BioSciencesCat #329420
Caliper IVIS SpectrumPerkinElmerCat #124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640CorningCat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kitInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe ColumnGE HealthcareCat # 11-0034-93
InfusionTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
Isoflurane, USPCovetrusCat # 11695-6777-2
Lubricant Eye OintmentRefresh Lacri-LubeCat #4089
MatrigelCorningCat # 354234
PEI transfection reagentThermo FisherCat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis CassettesThermo ScientificCat # 66333
Steritop Vacuum FiltersMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
Experimentele modellen: Cellijnen
Human: OVCAR-3American Type Culture CollectionATCC HTB-161
Human: CHO-K cellenStabiel getransformeerd in ons labATCC CCL-61
Muis: 4T1Vriendelijk aangeboden door Dr. Chip Landen, UVA
Muis: MC38Vriendelijk aangeboden door Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBCGeverifieerd door STR-profilering
Muis: MC38 hFOLR1Gemaakt in ons laboratorium (Dit artikel)
Experimentele modellen: Dieren
Muizen: athymische Nude Foxn1nu/Foxn1+EnvigoMeerdere bestellingen
Muizen: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson LaboratoryMeerdere bestellingen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1(2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595(2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50(2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209(2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

Gerelateerde artikelen